L-丙氨酸，又名L-2-氨基丙酸，是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、医药等领域具有广泛的应用，并有日益增长的趋势[1-2]。食品应用方面，L-丙氨酸具有甜味与鲜味，被用于食品添加剂，改善食品风味并强化营养，此外其还具有较强的防腐保鲜功能，被用作防腐剂[3-6]。医药应用方面，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液的组成成分之一，是合成维生素B5、维生素B6、L-氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）和抗癌药4-羟基水杨醛丙氨酸合锌的前体物质[7-8]。此外，L-丙氨酸可用于合成具有光学活性的聚合物，在生物医学、液晶、手性催化等领域具有重要的价值[9]。
L-丙氨酸可以通过提取法、化学合成法和生物转化法进行制备。其中，酶法转化是目前工业上的主要生产方法，即利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase，Asd）以L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）为原料经脱羧生成L-丙氨酸。1951 年，MEISTER 等[10]首次发现了韦尔奇梭菌（Clostridiumn welchii）能催化L-Asp 合成L-丙氨酸。随后国内外很多研究人员对此法生产L-丙氨酸进行了深入的研究。SHIBATANI 等 [11] 以Pseudomonas dacunhae 为产酶菌株，研究不同氨基酸作为氮源对产酶的影响，结果发现L-谷氨酸诱导后产酶量是未添加L-谷氨酸的2 倍。徐虹等[12]通过诱变育种获得一株高Asd 活性的菌株Pseudomonas NX-1，每升培养液可转化L-Asp 达1.4 kg，L-丙氨酸含量可达到90%以上，摩尔转化率接近100%。储瑞蔼等[13]对产酶菌株P.dacunhae CPU9001进行了固定化，并优化了其催化L-Asp 合成L-丙氨酸的发酵条件，每1 kg 固定化细胞可转化2 kg 底物，转化率大于98%，产物收率大于85%，固定化细胞酶活半衰期大于80 d，产品纯度大于98.5%。周丽等[14]以大肠杆菌为出发菌株，敲除编码乳酸、甲酸、乙酸、乙醇、琥珀酸和丙氨酸消旋酶的基因，导入嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothmophilus）来源的L-丙氨酸脱氢酶基因（alaD），构建的重组菌以初始浓度30 g/L 的葡萄糖作碳源，经补料发酵得到67.2 g/L L-丙氨酸。徐友强等[7]将来源于睾丸酮丛毛单胞菌的Asd 基因克隆至大肠埃希氏菌CICC11022S 中，构建了一株转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌，该菌9 h 转化富马酸生成112.7 g/L 产物，生产速率为12.5 g/（L·h），转化率为93.8%。
Asd 是至今在自然界中唯一的氨基酸-β-脱羧酶，以5′-磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′-phosphate，PLP）为辅酶因子，是L-丙氨酸合成的关键酶[15]。汪芳[16]实现了P. dacunhae 来源的Asd（aspD）基因在大肠杆菌中的异源表达，通过定点突变改善了该酶在酸性环境中的催化能力，获得组合突变体酶N34D/L484M，酶比活力达116.27 U/mg，比原始酶提高了76.30%。于封印等[17]首次在大肠杆菌中异源表达不动杆菌来源Asd，对其酶学性质进行分析，为工业生产L-丙氨酸提供参考。Asd 在德阿昆哈假单胞菌（Pseudomonas dacunhae）[18]、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）[19]、粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）[20]、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）[21]、小球诺卡氏菌（Nocardia globerula）[22]等微生物中均有存在，但由于产酶菌株产酶量低、酶活性低，难以实现规模化生产，因此，选育Asd 高产菌株、优化发酵条件和提高酶活力是酶转化生产L-丙氨酸的关键。
本研究在前期通过菌种诱变选育出一株高产Asd的L-丙氨酸转化菌，本文对其产酶条件进行优化，旨在为生物合成L-丙氨酸的工业化生产研究提供科学依据和技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株及培养基
睾丸酮丛毛单胞菌株HY-08D （CGMCC No.6083）：烟台恒源生物股份有限公司。
1.1.2 培养基
斜面及平板培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0～7.2。
液体培养基：玉米浆干粉0.8%，蛋白胨0.8%，磷酸二氢钾0.15%，氯化钠0.5%，硫酸镁0.1%，pH 7.0～7.2。
1.1.3 试剂
酵母膏、牛肉膏、玉米浆、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限公司；玉米浆干粉（生化试剂）：山东康源生物科技有限公司；富马酸（分析纯）：烟台恒源生物有限公司；氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
XNP-9052BS-III 生化培养箱、XL-YC 恒温摇床：上海馨朗电子科技有限公司；722 型分光光度计：上海天普分析仪器有限公司；LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；PY-P10 pH 计、BSA124S-C 电子分析天平：德国赛多利斯公司。
1.3 试验方法
1.3.1 种子培养及发酵培养
种子培养：接一环生长良好的斜面种子至500 mL（装液量50 mL）锥形瓶中，180 r/min，30 ℃，培养12 h～24 h。
摇瓶培养：将种子液按2%（体积分数）接种量转接至500 mL（装液量50 mL）锥形瓶中，180 r/min，培养12 h～24 h。
发酵罐培养：将种子液按0.1%～10%（体积分数）接种量转接至发酵罐（装液量70%）中，150 r/min，培养12 h～24 h。
1.3.2 菌株生长情况测定
发酵液稀释10 倍，在640 nm 测定吸光度值，以OD640 代表菌株生长情况。
1.3.3 酶活的测定
取25 mL 发酵液，加入1 g L-Asp，用0.l mol/L HCl调节pH 5.0，在37 ℃水浴摇床中振荡30 min，微波炉加热1 min，终止反应，利用纸层析法分析反应液中L-丙氨酸的含量，计算酶活。每小时催化消耗l μmol LAsp 的酶量定义为一个酶活单位（U）。
1.3.4 培养基组分及培养条件优化
1.3.4.1 碳源优化
基础发酵培养基其余组分和培养条件不变的情况下，以1%的比例，分别添加富马酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作为发酵产酶的碳源，以原始培养基为对照考察其对菌株HY-08D 生长及产酶的影响。通过L9（34）正交试验设计对以上4 种碳源添加量进行优化。正交试验设计因素与水平如表1 所示。
表1 菌株HY-08D 碳源正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment of
carbon sources by HY-08D strain
水平因素A 富马酸添加量/%D 葡萄糖添加量/%1 0.5 0.5 0.5 0.5 2 1.0 1.0 1.0 1.0 3 1.5 1.5 1.5 1.5 B L-Asp 添加量/%C 谷氨酸添加量/%
1.3.4.2 氮源、氯化钠和pH 值优化
在优化碳源基础上，控制其它条件不变，以0.8%的比例，分别添加玉米浆干粉、酵母粉和蛋白胨作为发酵的氮源，考察其对菌株HY-08D 生长及产酶的影响。通过正交试验对2 种氮源添加量、氯化钠添加量和pH 值的水平进行优化。正交试验设计因素与水平如表2 所示。
1.3.4.3 扩培级数和接种量优化
采用三级扩培，一级采用摇瓶培养，二级采用2 m3发酵罐，二级培养液分别按0.1%、1.0%、5.0%和10%（体积分数）接种量转接至20 m3 发酵罐（装液量为70%）中，150 r/min，30 ℃，培养24 h，每2 h 取样测定OD640 和酶活。
表2 菌株HY-08D 氮源、氯化钠和pH 值正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels in orthogonal experiment of nitrogen sources,NaCl and pH by HY-08D strain
水平因素A 玉米浆干粉添加量/%B 酵母粉添加量/%C 氯化钠添加量/% D pH 值0.6 0.6 0.3 5.5 2 0.8 0.8 0.5 6.0 3 1.0 1.0 0.7 6.5 1
1.3.4.4 通气量优化
按照优化后配方配制培养基，培养液按10%（体积分数）接种量转接至50 L（装液量42.5 L）发酵罐中培养，150 r/min，30 ℃，用氢氧化钠调节初始pH 6.0，设置通气量分别为6、8、10、12、14 L/min，考察其对菌株HY-08D 生长和产酶的影响。
1.4 统计学分析
正交试验采用正交设计助手V3.1 软件通过直观分析对菌株HY-08D 培养基组分及培养条件进行优化，其它数据采用Origin8.1 软件处理。
2 结果与分析
2.1 碳源优化
2.1.1 碳源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响
碳源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响见图1。
图1 碳源对菌株HY-08D 生长及产酶的影响
Fig.1 Effect of carbon source on the growth and enzyme production by HY-08D strain
从图1 可以看出，在添加量相同的条件下，选择富马酸、L-Asp、谷氨酸和葡萄糖作为碳源，OD640 均有所增加，以谷氨酸为碳源时菌体生长最好，以L-Asp 为碳源时，酶活最高。
2.1.2 正交试验结果
正交试验结果见表3。
表3 菌株HY-08D 碳源添加正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results of carbon sources addition by HY-08D strain
试验号123456789 OD640 k1 k2酶活k3Rk1 k2 k3R A 富马酸添加量111222333 0.359 0.355 0.326 0.033 38 690 39 286 31 548 7 738 B L-Asp 添加量 C 谷氨酸添加量 D 葡萄糖添加量 OD640 酶活/(U/mL)1 1 1 0.189 28 571 2 0.522 53 571 3 3 3 0.366 33 929 2 2 0.445 42 857 2 3 1 0.388 50 000 1 2 3 0.231 25 000 1 3 2 0.324 25 000 3 1 2 0.333 42 857 3 2 1 0.322 26 786 2 1 3 0.319 0.251 0.300 0.414 0.430 0.359 0.306 0.359 0.381 0.108 0.179 0.081 32 143 32 143 35 113 48 809 41 071 34 524 28 572 36 310 39 881 20 237 8 928 5 357
从表3 可以看出，影响菌株HY-08D 生长的因子顺序为：谷氨酸添加量＞L-Asp 添加量＞葡萄糖添加量＞富马酸添加量，影响菌株HY-08 产酶的因子顺序为：L-Asp 添加量＞谷氨酸添加量＞富马酸添加量＞葡萄糖添加量；结合k 值，适合菌株HY-08D 生长的最佳组合为A1B2C2D3；适合菌株HY-08D 产酶的最佳组合为A2B2C2D3。葡萄糖添加量对菌株产酶影响最小，不再考虑添加，而富马酸添加量对菌株产酶的影响比其对生长的影响要大，综合考虑，最佳碳源组合为A2B2C2，即富马酸1%，L-Asp 1%，谷氨酸1%。在最佳碳源组合下进行验证试验，OD640 达到0.536，酶活达到53 927 U/mL，均高于正交试验中各试验组，表明优化后碳源有利于菌株生长和产酶。
2.2 氮源、氯化钠和pH 值优化结果
2.2.1 氮源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响
氮源种类对菌株HY-08D 生长及产酶的影响见图2。
图2 氮源对菌株HY-08D 生长和产酶的影响
Fig.2 Effect of nitrogen source on the growth and enzyme production by HY-08D strain
从图2 可以看出，在添加量相同的条件下，单独添加蛋白胨不利于菌株生长，酶活力较低；单独添加玉米浆干粉和酵母粉，OD640 和酶活相对较高，因此，针对两者复合的添加量做了进一步分析以确定最佳配比。除了培养基组分外，适宜的初始pH 值也是十分重要的。Asd 进行脱羧反应时，酸性底物（如L-Asp）的加入会引起反应液pH 值升高，不利于菌株生长，导致酶活力下降甚至失活。
2.2.2 正交试验结果
正交试验结果见表4。
从表4 可以看出，影响菌株HY-08D 生长的因子顺序为：pH 值＞玉米浆干粉添加量＞氯化钠添加量＞酵母粉添加量；影响菌株HY-08D 产酶的因子顺序为：pH 值＞氯化钠添加量＞酵母粉添加量＞玉米浆干粉添加量。结合k 值，适合菌株HY-08D 生长的最佳组合为A1B1C1D2；适合菌株HY-08D 产酶的最佳组合为A3B2C3D2。玉米浆干粉添加量对菌株生长的影响比其对产酶的影响较大，而酵母粉和氯化钠添加量对菌株产酶的影响比其对生长的影响较大，综合考虑，最佳氮源、氯化钠添加量及pH 值组合为A1B2C3D2，即玉米浆干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化钠0.7%，pH 6.0。在最佳培养基组合下进行验证试验，OD640 达到0.698，酶活达到54 837 U/mL，均高于正交试验中各试验组，表明优化后的培养基可以提高单位体积培养液中菌体浓度和酶活力。
2.3 扩培级数和接种量优化
不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液的生长曲线和酶活曲线分别见图3 和图4。
表4 菌株HY-08D 氮源、氯化钠和pH 值的正交试验结果
Table 4 Orthogonal test results of nitrogen sources，NaCl and pH by HY-08D strain
试验号 B 酵母粉添加量 C 氯化钠添加量 D pH 值 OD640 酶活/（U/mL）1 1 1 1 0.437 38 176 A 玉米浆干粉添加量0.507 54 000 3 3 3 3 0.450 51 725 2 2 2 2 0.529 47 473 5 2 3 1 0.364 47 077 4 1 2 3 0.603 47 077 7 1 3 2 0.561 50 736 6 3 1 2 0.642 45 791 9 3 2 1 0.393 47 769 8 111222333 2 1 3 OD640 0.509 0.561 0.398 0.504 0.476 0.557 0.482 0.458 0.540 0.027 0.103 0.159 45 462 43 681 44 341 48 956 49 747 50 604 48 857 49 846 48 330 3494 6 165 6 263 k1 k2酶活k3R k1 k2 k3R 0.610 0.499 0.532 0.111 47 967 47 209 48 099 890
图3 不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液生长曲线
Fig.3 The growth curve of the third stage culture solution by HY-08D strain
图4 不同接种量下菌株HY-08D 三级培养液酶活曲线
Fig.4 The enzyme activity curve of the third stage culture solution by HY-08D strain
微生物发酵种子培养通常采用逐级扩培的方式，但在实际生产中，为了降低接种过程染菌风险，通常采用二级或三级放大。目前，丙氨酸生产中，产酶菌株HY-08D 转化用培养液采用二级培养，一级利用摇瓶培养，二级利用发酵罐培养，接种量只有0.1%，培养周期需要16 h～20 h。因此，本研究对扩培级数和接种量进行了优化，从图3 和图4 可以看出，增加接种量不仅可以缩短菌株生长周期，还可以提高单位发酵液中的Asd酶活。在整个培养阶段，接种量为10%时，培养周期相较于二级扩培缩短了6 h～8 h，酶活提高了约1 倍。
2.4 通气量优化
通气量对菌株HY-08D 发酵过程的影响见表5。
表5 通气量对菌株HY-08D 发酵过程的影响
Table 5 Effects of aeration on the fermentation of HY-08D strain
通气量/（L/min）/h OD640 pH 值 酶活/（U/mL）6 11 0.695 8.2 38 475 8 12 0.776 8.4 45 468 10 11 0.764 8.6 55 100 12 12 0.711 8.9 54 042 14 12 0.759 9.1 53 109培养周期
L-丙氨酸转化菌是好氧菌，需通气培养，通气量主要影响培养液的溶氧，进而影响菌株生长代谢。从表5 可以看出，通气量对菌株HY-08D 培养周期和OD 值影响不明显，而对pH 值和酶活影响显著。通气量为10 L/min 时，酶活达到5.51×104 U/mL，但继续增加通气量并不会提高酶活力。因此，菌株HY-08D 发酵过程中最适通气量为10 L/min。
3 结论
本研究通过单因素及正交试验对睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D 培养基进行优化，获得最佳培养基配方：富马酸1.0%，L-Asp 1.0%，谷氨酸1.0%，玉米浆干粉0.6%，酵母粉0.8%，氯化钠0.7%，磷酸二氢钾0.15%，硫酸镁0.1%，pH 6.0。通过转接试验，确定了菌株HY-08D 转化液采用三级扩培，三级种子的最佳接种量为10%，发酵过程中最适通气量为10 L/min。在上述最佳培养基及培养条件下，优化后培养液中HY-08D 菌体量和酶活较初始提高约1 倍，培养周期缩短6 h～8 h，为实现L-丙氨酸的高效转化和产业化生产奠定了基础。
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