培根是低温西式肉制品重要的一类，其风味浓郁、咸味适口、食用方便。重组培根是经过真空腌制、灌装压模、蒸煮、烟熏、冷却制成。重组培根加工中以添加亚硝酸盐来达到发色及抑制微生物生长的目的，但亚硝酸盐会与其中的二级胺类物质发生反应形成致癌物N-亚硝基化合物，危害人体健康[1]。降低肉制品中亚硝酸盐残留量可以降低亚硝胺的形成。因此，应尽可能限制亚硝酸盐在肉制品加工中的使用。控制肉制品中N-亚硝胺形成常添加天然抗氧化剂，如抗坏血酸、VE、茶多酚等[2-3]。WANG 等[4]将植物多酚和α-生育酚添加到干腌培根中，发现植物多酚特别是绿茶多酚（green tea polyphenols，GTP）可以用于加工干腌培根来提高产品质量、保质期及安全性。本研究前期以冷冻牛骨肉末为原料，开发出两种调味基料[5-6]：一种是以冷冻牛骨肉末为原料，经过高压浸提、酶解、美拉德反应得到牛骨调味基料（beef flavorings，BF），另一种是在BF 的基础上为了增香而增加了发酵工艺环节，得到的发酵牛骨调味基料（fermented beef flavorings，FBF）[7]。
目前FBF 在牛肉肠、牛肉饼、红肠[8-10]上的应用已表明FBF 具有增强产品的抗氧化、抑菌效果以及提高风味的作用，可以起到降低亚硝酸盐使用量的目的。本研究将前期研制的BF 和FBF 两种调味基料应用于重组培根的加工中，通过测定各组培根的理化指标、贮藏过程中菌落总数和硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid value，TBARs）的变化以及货架期预测加速试验，研究BF 和FBF 对重组培根理化特性和贮藏品质的影响，分析BF 和FBF 是否具有抑制微生物生长及抗氧化的效果，是否可以部分替代亚硝酸盐的作用，为FBF、BF 在重组培根生产加工中的应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪背部肉（背最长肌）、猪肥膘：天津市康宁肉制品有限公司；食盐、复合磷酸盐、亚硝酸钠、抗坏血酸钠、烟酰胺、鸡蛋、白糖、葡萄糖、卡拉胶、大豆分离蛋白粉、白酒、味精、辣椒、花椒、胡椒、生姜（均为食品级）：天津市红旗农贸批发市场；VHI-41 发酵剂（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌）：意大利萨科公司；冷冻牛骨肉末、木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、维生素B1（均为食品级）：顶兴（天津）食品科技发展有限公司；高氯酸、丙酮、丹磺酰氯（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、乙腈、无水硫酸钠、硼酸（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；8 种生物胺标品（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺及亚精胺）、9 种N-亚硝胺标品[N-亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚 硝 基 二 丁 胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-亚 硝 基 哌 啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N - 亚 硝 基 二 丙 胺（N -nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基甲乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亚 硝 基 二 苯 胺（N -nitrosodiphenylamine，NDPheA）]：美国Sigma 公司。
1.2 仪器与设备
7890A 气相色谱仪（配备氮磷检测器）、1260 高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；PB-10 酸度计：德国赛多利斯科学仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DW-5120 低温泵：上海振捷实验设备有限公司；LLJ-A10T1 搅拌机：广东小熊电器有限公司；HS07-314 恒温水浴锅：天津华北实验仪器有限公 司；BJRJ-82 绞 肉 机、BVBJ-30F 真 空 搅 拌 机、BYXX-50 烟熏炉：浙江嘉兴艾博实业有限公司；ST40R离心机：美国Thermo 公司；18Basic 匀浆机：德国IKA公司；FA2004 精密电子天平：上海精科仪器公司；TU-1800 紫外分光光度计：日本SHIMADZU 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 重组培根的制备
共设置4 组产品，每组5 kg，按如下的设计方案进行加工。
1.3.1.1 工艺流程
腌制液配制→原料解冻→分割→绞肉→腌制→灌装压模→蒸煮→烟熏→脱模→冷却、速冻→切片→包装→成品。
1.3.1.2 操作要点
1）原料选择：选取猪背部的纯精瘦肉，剔除筋膜等，用绞肉机绞碎（3 mm 筛板），猪背膘用切片机切片。
2）腌制：将配制好的腌制液与绞碎的猪瘦肉和肥肉片在真空搅拌机中搅拌均匀，置于0 ℃～4 ℃的冷库中腌制24 h。
3）压模：在清洗干净的不锈钢网孔模具上铺一层聚乙烯薄膜，将腌制好的肉馅装入，固定好模盖的卡扣。
4）蒸煮、脱模：将压模完成的培根放入烟熏炉中在85 ℃的条件下蒸煮90 min，取出、冷却、脱模。
5）干燥、烟熏、冷却：将脱模后的培根再次放入烟熏炉中在65 ℃条件下干燥60 min，然后在55 ℃的条件下烟熏7 h，取出冷却。
6）速冻、切片：将加工好的培根在-35 ℃速冻箱中速冻1 h，取出用冻肉切片机切成2 mm 的薄片，真空包装。
1.3.2 试验设计方案
按照1.3.1 重组培根的工艺流程加工培根，试验设计4 组：阴性对照组（NC），腌制液配方为：猪肉5 kg、食盐90 g、复合磷酸盐15 g、抗坏血酸钠2.5 g、烟酰胺1 g、鸡蛋液2 g、白糖50 g、葡萄糖20 g、卡拉胶5 g、大豆分离蛋白8 g、白酒10 mL、味精7.0 g、香料水1 000 g（辣椒2 g、花椒2 g、胡椒1 g、生姜6 g）；阳性对照组（PC）、添加BF 的试验组（BF）和添加FBF 的试验组（FBF）分别在NC 腌制液配方的基础上，添加0.12 g/kg NaNO2（0.6 g/5 kg）、2%BF（100 g BF/5 kg）和2%FBF（100 g FBF/5 kg）。
1.3.3 重组培根货架期加速试验预测货架期公式
将4 组重组培根分别置于27、32、37 ℃下贮藏，并在不同时间间隔下测定菌落总数变化，具体方法参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》具体计算方法如下。
t2=t1Q5ΔT/5
式中：t1 为最高试验温度37 ℃下每次测试的时间间隔，h；Q5 为温度相差5 ℃时货架寿命的比值；t2 为所求较低试验温度下每次测试的最大时间间隔，h；ΔT 为两个温度的差值，℃。
综合实际试验条件，将27 ℃下的样品每12 h 测定1 次菌落总数，将32、37 ℃下的样品每8 h 测定一次菌落总数。当菌落总数超过105 CFU/g，可视为达到货架期终点，停止测定，绘制贮藏期间菌落总数增长曲线[11]。根据产品在特定温度下的货架期时间计算Q5，计算公式如下。
Q5=fT÷fT+5
式中：T 为温度，℃；fT 为在温度T 下的货架期，h；
fT+5 为在温度T+5 的货架期，h。
1.4 指标测定的方法
1.4.1 感官评定
挑选10 名人员组成感官评价小组，对4 组产品的进行感官评价。用加权平均法从重组培根的色泽、气味、滋味和质地4 个方面进行综合评分，满分5 分，色泽、气味、滋味和质地4 个因素的级别权重依次为0.4、0.3、0.2、0.1[12]。感官评价标准见表1。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
指标 得分4 分～5 分 3.5 分～3.9 分 3 分～3.4 分 3 分以下色泽 切面光泽，肌肉部分呈玫瑰红，脂肪白色无光泽，肌肉暗灰色，脂肪发黄气味 具有产品应有的熏烟香味，无酸败味 熏烟气味较香 熏烟香味较淡 无熏烟香味滋味 具有产品应有的味道，咸味适口 较具有产品应有的味道 略有异味 异味浓质地 紧密坚实，有弹力 较紧实，较有弹力 质地较疏松 质地疏松切面光泽，肌肉呈灰红色，脂肪略黄光泽不亮，肌肉暗红色，脂肪发黄
1.4.2 菌落总数的测定
按照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法测定[13]。
1.4.3 pH 值测定按照GB/T 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH 值的测定》的方法测定[14]。
1.4.4 亚硝酸盐残留量测定
参考GB/T 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》亚硝酸盐含量测定中的分光光度法进行测定[15]。
1.4.5 TBARs 值的测定
参考FAUSTMAN 等[16]的方法。
1.4.6 N-亚硝胺测定
按照GB/T 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》中的气相色谱-质谱法进行测定[17]。
1.4.7 生物胺测定
参照杜智慧[18]的方法测定样品中的8 种生物胺。样品处理：称取5 g 待测样品加入20 mL 高氯酸（0.4 mol/L）进行匀浆，4 ℃、4 000 r/min 条件下离心10 min，重复离心两次，合并上清液，用0.4 mol/L 高氯酸定容至50 mL。
标准溶液和样品的衍生化：分别称取1 mL 上述标准混合溶液和样品溶液，依次加入0.2 mL 的2 mol/L NaOH、0.3 mol/L 饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，2 mL 10 mg/mL 的丹黄酰氯溶液，40 ℃水浴避光反应30 min。反应结束后加入100 μL 水终止反应，取出残留丹黄酰氯溶液。用乙腈定容至5 mL，4 ℃、3 000×g 条件下离心5 min，上清液过膜，待上机检测；色谱条件：波长254 nm下检测，流速为1 mL/min，进样量20 μL，柱温30 ℃。
1.5 数据处理
用WPS Excel 2019 计算各指标的平均值和标准差，用Sigmaplot 13.0 进行绘图，Statistix 8.1 进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 感官评价结果
4 组重组培根感官评价结果见表2。
表2 感官评价结果
Table 2 The results of sensory evaluation
注：同列字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
?
从感官评价总分可以看出，PC 组得分最高，为4.31；FBF 和BF 组次之，分别为4.19 和4.00，NC 组得分最低，为3.48。其中FBF 组气味评分最高，为4.43±0.11，这是因为FBF 调味基料的加工中增加了发酵环节，其中含硫化合物和醛类化合物，特别是2-甲基-3-呋喃硫醇和双（2-甲基-3-呋喃基）二硫及壬醛[5]含量增加，从而使FBF 组培根香味浓郁。4 组产品的色泽得分依次为PC＞FBF＞BF＞NC，4 组之间差异显著（P＜0.05）。由此说明调味基料可明显改善产品色泽，而发酵工艺的引入对培根色泽的改善有增强作用，这是因为乳酸菌可在不添加亚硝酸盐的条件下，将高铁肌红蛋白转化，生成具有红色色泽的肌红蛋白衍生物——氧合肌红蛋白或亚硝基肌红蛋白，替代亚硝酸盐起呈色作用[19]。SEN 等[20]报道精氨酸能够提高发酵乳杆菌体内一氧化氮合酶的活性，使精氨酸转化为一氧化氮，以促进肉制品中肌红蛋白转化为亚硝基色素的反应，最终提高肉制品的a*。感官评价的结果表明，调味基料BF 和FBF 应用于重组培根的加工中，可以起到类似亚硝酸盐的作用，改善产品风味，FBF 的改善效果更佳。
2.2 对理化指标的影响
各组理化指标的变化见表3。
表3 重组培根理化指标结果
Table 3 The results of physical and chemical indexes of recombinant bacon
注：同列字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
?组别 pH 值 色差值（a*） 亚硝酸盐残留量/（mg/kg）NC 5.70±0.05B 4.38±0.42D 0.45±0.07B PC 5.89±0.14A 8.03±1.24A 14.59±0.08A BF 5.76±0.03AB 4.77±0.48C 0.29±0.04C FBF 5.74±0.006AB 5.15±0.26B 0.27±0.03C
由表3 可以看出，PC 组的pH 值最高，NC 组最低，BF 组、FBF 组与对照组差异不显著（P＞0.05），说明BF或FBF 的添加对产品的pH 值影响不大。分析4 组产品a*值的差异，a*值从高到低依次为PC＞FBF＞BF＞NC，与感官评价结果一致。PC 组含有（14.59±0.08）mg/kg的亚硝酸盐残留量，而其它3 组的亚硝酸盐残留量均处于极低的水平，说明BF、FBF 的添加可以部分取代亚硝酸盐，改善重组培根色泽，显著降低产品亚硝酸盐残留量，其中，FBF 对色泽的改善作用效果更好（P＜0.05）。
2.3 对产品中生物胺含量的影响
生物胺是一类含氮的脂肪族、芳香族或杂环类有机化合物，肉制品中生物胺的形成主要是氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用[21-22]。肉制品中的产胺菌属主要由乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌组成，且肠杆菌具有极高的脱羧酶活力[19]。乳酸杆菌中的植物乳杆菌、弯曲乳杆菌和清酒乳杆菌的部分菌株具有氨基酸脱羧酶活性。国际上对食品中的生物胺尚无统一限量标准，现有的各项法规只限定鱼类及其制品中的组胺含量。美国食品药品监督管理局规定金枪鱼、鬼头刀及相关鱼类组胺含量＜50 mg/kg。酪胺和苯乙胺含量建议上限分别为100 mg/kg ～800 mg/kg 和30 mg/kg[23]。
培根中生物胺的含量变化见表4。
由表4 可以看出，4 组中均未检测到毒性最强的组胺，亚精胺也未检测到。毒性较强的酪胺、苯乙胺在FBF 组中未检测出，而具有一定的生理作用的精氨酸产物精胺含量在FBF 组最高，与其它3 个处理组差异显著（P＜0.05），这可能是因为FBF 的加工过程中增加了VHI-41 发酵剂（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌）进行发酵，由于部分植物乳杆菌具有氨基酸脱羧酶活性导致精氨酸含量升高[2]。整体上看，FBF 的添加对除精胺和总量外的生物胺影响与其它处理组差异不显著（P＞0.05），组胺、酪胺、苯乙胺都没有形成，说明添加FBF 加工的重组培根是安全的。
表4 各组培根中生物胺的含量变化
Table 4 Changes in the content of biogenic amine in each group mg/kg
注：同列字母不同，表示差异显著（P ＜0.05）；-表示未检测到。
组别 色胺 苯乙胺 腐胺 尸胺 酪胺 精胺 总量NC 23.75±24.60A 81.84±73.80A 6.82±3.94A - 4.91±6.95A 287.23±88.25B 397.62±124.67B PC 30.21±6.91A 27.74±12.38A - - 15.39±8.09A 348.98±81.16B 422.32±82.63B FBF 31.08±9.12A - 7.42±12.38A 52.37±45.88A - 483.09±62.89A 573.96±212.9A BF 27.52±20.74A 40.10±16.49A 10.26±12.38A 25.98±26.3A 36.72±16.35A 280.16±65.87B 377.68±80.51B?
2.4 各组培根中N-亚硝胺含量变化
根据GB 2762—2017《食品安全标准食品中污染物限量》中对NDMA 限量的规定，肉及肉制品（肉制罐头除外）中NDMA 含量不得超过3.0 μg/kg。N-亚硝胺中毒性较大的分别是NDMA、NDEA 和NPYR[24]。在加工、贮藏过程中，肉中蛋白质的降解产物[25]可为N-亚硝胺的生成提供前体物。各组重组培根中N-亚硝胺的含量变化见表5。
表5 各组重组培根中N-亚硝胺胺的含量
Table 5 Changes in the content of N-nitrosamine in each group
注：同列字母不同，表示差异显著（P ＜0.05）。
组别 NDMA NMEA NDEA NDPA NDBA NPIP NPYR NMOR 总量NC 2.39±0.10B 0.50±0.03AB 1.63±0.07AB 3.39±0.09C 1.01±0.02B 0.32±0.02C 1.08±0.07AB 0.17±0.01B 10.48±0.07C PC 2.74±0.97A 0.48±0.02AB 1.88±0.17A 3.38±0.29C 1.99±0.16A 0.38±0.01B 1.24±0.13A 1.27±0.14A 13.37±1.22B BF 2.65±0.07B 0.53±0.03A 1.38±0.07B 10.91±0.49B 0.78±0.1BC 0.47±0.03A 1.09±0.08AB 1.27±0.03A 17.25±0.38A FBF 2.11±0.08B 0.44±0.03B 1.44±0.05B 13.40±0.27A 0.68±0.07C 0.37±0.01B 0.98±0.04B 1.24±0.05A 20.64±0.25A?
由表5 可以看出，PC 组中的NDMA 含量为（2.74±0.97）μg/kg，显著高于NC 组、BF 组和FBF 组（P＜0.05），这是因为PC 组中添加了NaNO2 的缘故，但4 组重组培根中的NDMA 含量均未超过3.0 μg/kg，符合国标限量要求。各组重组培根中除了NDPheA 外，其余8 种N-亚硝胺均有检测到，BF 组和FBF 组的NDPA 含量分别达到（10.91±0.49）、（13.40±0.27）μg/kg，这是导致BF 组和FBF 组N-亚硝胺总量显著高于NC 组和PC 组的主要原因。NDPA 形成可能是因为BF、FBF 的制备是牛骨肉经过高压浸提、酶解、发酵或不发酵、美拉德反应等工序，底物中的蛋白质分解形成小分子肽、氨基酸或胺类物质，成为NDPA 形成的前体物。本实验室对市售10 种西式培根品牌产品营养及安全品质分析中，10 种培根品牌产品的NDMA 含量在1.98 μg/kg～4.85 μg/kg，N-亚硝胺总量在20.89 μg/kg～33.60 μg/kg。相比较而言，本试验的BF 组和FBF 组的NDMA 含量符合国标限量要求，BF 组和FBF 组的N-亚硝胺分别为（17.25±0.38）μg/kg 和（20.64±0.25）μg/kg。
2.5 加速试验预测货架期
利用ASLT 构建的Q5 预测公式，预测得到PC、FBF、BF 组在4 ℃下货架期均为518.48 h，在25 ℃下货架期均为88.10 h；NC 组在4 ℃下货架期为239.47 h，在25 ℃下货架期为55.39 h。试验说明，PC 组、BF 组和FBF 组在4 ℃下的货架期比NC 组延长了279.01 h，25 ℃下的货架期比NC 组延长了32.71 h。由此说明，BF、FBF 和亚硝酸盐的抑菌效果类似，可以抑制产品中微生物生长，延长成品的货架期。
图1 是各组重组培根在27、32、37 ℃下的菌落总数变化情况。
图1 4 组重组培根在27、32、37 ℃贮藏期间菌落总数变化
Fig.1 Changes of arobic bacterial count of four groups during storage at 27，32 ℃and 37 ℃
由图1 可得，随着温度升高，4 组重组培根的货架期缩短；FBF 组、BF 组与PC 组结果接近，均比NC 组的货架期延长。这是因为调味料的制作过程中酶解、发酵、美拉德反应都会产生抑菌物质。发酵过程中使用的VHI-41 发酵剂中含有乳杆菌，其生长过程中可以影响有害微生物的生长繁殖。美拉德反应可以改善食品的色泽和风味，产生了大量的抗氧化和抑菌物质[26]。美拉德反应后期会形成一种棕黑色物质——类黑精[27]，这类物质有一定的抗氧化、抗诱变功能，对某些微生物也具有较好的抑菌活性[28]。
2.6 4 组重组培根在37 ℃加速氧化试验中TBARs 值变化
为了解BF、FBF 对重组培根的抗氧化效果，试验对4 组重组培根在37 ℃下贮藏期间TBARs 值的变化进行监控，如图2 所示。
图2 4 组重组培根在37 ℃加速试验中TBARs 值的变化
Fig.2 Changes of TBARs value of four groups in the acceleration experiment at 37 ℃
由图2 可以看出，4 组重组培根的TBARs 值在前8h 变化缓慢，8h 后迅速增加。8 h～24 h 贮藏期间，NC 组的TBARs 值显著高于其它3 组（P＜0.05）。贮藏32 h 时TBARs 值从低到高的顺序依次为：PC（0.409 mg/kg）＜FBF（0.463 mg/kg）＜BF（0.583 mg/kg）≈NC（0.589 mg/kg）。PC 组TBARs 值始终较低，这是因为PC 组中添加了亚硝酸盐，亚硝酸盐具有强的抗氧化性。亚硝酸钠和碳碳双键发生复杂反应，从而影响了肉质；与血红素蛋白中的铁发生反应，生成络合物，从而间接阻止了血红素蛋白与过氧化氢的结合，发生契合反应；与肉中的某些物质产生反应，生成类似抗氧化活性的物质，如亚硝基和亚硝酰基化合物，从而发挥作用[29]。试验说明，FBF 可以提高重组培根的抗氧化性，这是因为在FBF 的制备过程中，牛骨肉末经过高压浸提可以提高蛋白浸出率，再经过酶解、发酵，可以得到抗氧化肽，加之美拉德反应产物也具有一定的抗氧化性[30]，可通过自身发生氧化还原反应来抑制其它物质的氧化；然而，FBF 的制备过程中也会产生游离脂肪酸导致脂肪的氧化，所以，FBF 组可以提高产品的抗氧化能力，但效果不及添加亚硝酸盐的PC 组。
3 结论
本试验研究了两种调味料在重组培根中的应用效果。感官评价结果表明FBF 可以改善培根风味；4 组培根的pH 值没有显著差异（P ＞0.05），a*值、亚硝酸盐残留量结果表明FBF、BF 具有发色效果，能降低亚硝酸盐在重组培根中的使用量；FBF、BF 组的生物胺总含量、N-亚硝胺总量较高，但NDMA 含量小于3 μg/kg，符合国标规定的限量要求；加速试验预测货架期的试验结果表明，PC 组、BF 组和FBF 组在4 ℃下的货架期比NC 组延长279.01 h，25 ℃下的货架期比NC 组延长32.71 h。在37 ℃加速试验过程中4 组产品的TBARs由低到高顺序依次为PC＜FBF＜BF≈NC。综上所述，FBF 和BF 在重组培根中应用可以替代部分亚硝酸盐的使用，但在控制N-亚硝胺、生物胺总量的形成和抑制脂肪氧化方面仍需更进一步深入研究。
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