黄精属（Polygonatum）植物系百合科（Liliaceae）多年生草本植物。包含有滇黄精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl）、黄精（Polygonatum sibiricum Red）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）[1]。黄精作为传统的中药材，具有补气养阴、益肾、健脾、润肺等功效。同时，黄精作为药食同源的食材，又具有解热消暑、改善记忆力、提高免疫力等功能[2-4]。黄精的化学成分主要包括多糖、黄酮、木脂素、蒽醌、生物碱、挥发性油脂等[5-6]。其中，黄精多糖被认定为具有抗氧化、抗炎、降抗动脉粥样硬化、抗病毒、抑制癌细胞、保肝等作用[7-8]。
黄精多糖的含量是评价黄精质量的重要指标之一，目前黄精多糖的提取方法研究较多的主要有水提醇沉法、碱提取法、酶提取法、闪式提取法、超声波辅助提取法、超声微波协同辅助提取法等。超声波辅助提取工艺具有简单、环保、快速高效等特点，在很多物质提取领域有比较好的应用。酶提取法具有反应条件温和、环境友好，提取效率高等特点。本试验将超声波辅助提取法和酶提取法结合提取黄精多糖，采用单因素试验和正交试验进行提取工艺综合优化，为黄精多糖的开发利用提供一定的试验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
九蒸九晒黄精：市购；木瓜蛋白酶（酶活力≥100 000 U/g）、纤维素酶（酶活力≥30 000 U/g）、异抗坏血酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠：广东味多美食品配料有限公司；葡萄糖（标准品）：成都艾科达化学试剂有限公司；浓硫酸：衡阳市凯信化工试剂有限公司；无水乙醇、95%乙醇：天津市大茂化学试剂厂；硫酸亚铁：天津科密欧化学试剂有限公司；水杨酸：洛阳市化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。
1.2 设备
ZD-3 自动电位滴定仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；PS-40AL 超声波清洗机：深圳市华深科工设备有限公司；BS210S 电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；V-5000 可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；DHG-9076 电热恒温鼓风干燥箱：江苏省金坛市大地自动化仪器厂；HH-6 数显恒温水浴锅、JJ-2万能粉碎机：常州国华电器有限公司；RE-52B 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器设备有限公司；TD25-WS 离心机：湖南平凡科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄精多糖的提取率及含量测定
1.3.1.1 黄精多糖的提取
将购买的新鲜干黄精放入70 ℃烘箱中再次烘干2 h，取部分粉碎、过40 目筛装入自封袋中备用。按试验要求准确称取2.000 0 g 粉碎好的黄精置于三角瓶中，按比例加入一定量的纯净水，按一定配比加入木瓜蛋白酶和纤维素酶，调节pH 值后放入功率240 W超声波提取器中，设置好温度和时间进行黄精多糖提取。提取结束后，95 ℃水浴10 min 灭酶，趁热用200 目绢布过滤。滤液于60 ℃下真空旋转蒸发浓缩，浓缩至浓缩液体积小于20 mL，转移至量筒中，并用少量蒸馏水润洗剩余的浓缩液，合并浓缩液并定量到20 mL，倒入250 mL 三角瓶中，加入80 mL 无水乙醇，搅拌均匀后静置2 h，4 000 r/min 离心10 min，离心后取沉淀，依次用95%乙醇、无水乙醇、乙醚洗涤，烘干得黄精多糖[9-10]。
1.3.1.2 葡萄糖标准溶液的测定
采用苯酚-硫酸法测定[11]。准确称取0.100 0 g 葡萄糖干燥标准品置于100 mL 容量瓶内，加入蒸馏水溶解，并稀释到刻度，混匀。取上述配制好的葡萄糖溶液10 mL 稀释至50 mL 得到葡萄糖标准溶液。分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 上述标准溶液于10 mL具塞试管中，然后分别加入蒸馏水至各管溶液体积达2 mL，同时往各管中加入1.0 mL 6%苯酚溶液，充分混匀，迅速加入5.0 mL 浓硫酸溶液，混匀，静置5 min 后放入沸水浴中加热15 min，取出冷却，备用。单独取2.0 mL 蒸馏水作为对照组，按上述操作步骤进行相同操作，最后将所有溶液在487 nm 条件下测定其吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1 所示。得回归方程Y=11.643X-0.001 5，R2=0.994，在0～0.18 mg 浓度范围内有良好的线性关系。
图1 葡萄糖溶液标准浓度曲线
Fig.1 Standard concentration curve of glucose solution
1.3.1.3 多糖含量及提取率的测定
准确称取30 mg 干燥、冷却的黄精多糖样品，定容得到100 mL，用移液管量取黄精多糖溶液1 mL，按照1.3.1.2 葡萄糖标准溶液的测定方法进行测定，同时做好空白试验，利用葡萄糖标准溶液的回归方程等进行计算[12]。
式中：X 为测定溶液中的多糖溶液浓度，mg/mL；D为粗糖样品溶液的稀释倍数，为50；B 为测定溶液多糖样品的称取质量，g；W 为粗糖样品的质量，g。
多糖提取率/%=M/[F×（100-G）/100]×100
式中：M 为多糖含量，g；F 为黄精粗多糖样品的质量，取5 g；G 为样品的水分含量，%。
1.3.1.4 水分含量的测定
参照国家标准GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中“第一法直接干燥法”进行测定。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 提取方法的选择
在固定料液比为1 ∶15（g/mL）和溶液pH 5.0 条件下，分别考察超声波辅助提取（240 W 超声波50 ℃提取40 min、沸水浴提取20 min）、超声波辅助酶法提取[酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=1 ∶1，质量比）3%、240 W、50 ℃超声波提取40 min、沸水浴灭酶20 min]、常规酶法提取[酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=1 ∶1，质量比）3%（酶与底物质量比）、50 ℃水浴提取40 min、沸水浴灭酶20 min]3 种不同提取方法对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.2 木瓜蛋白酶和纤维素酶质量比的选择
在固定料液比为1 ∶15（g/mL）、溶液pH 5.0、50 ℃超声波辅助提取40 min、沸水浴灭酶20 min、复合酶（木瓜蛋白酶与纤维素酶）总量3%添加量条件下，分别按木瓜蛋白酶与纤维素酶2 ∶8、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、8 ∶2（质量比）提取黄精多糖，研究木瓜蛋白酶与纤维素酶添加质量比对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.3 复合酶酶解pH 值的选择
在固定3%复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=6 ∶4，质量比）、料液比为1 ∶15（g/mL）、50 ℃超声波辅助提取40 min、沸水浴灭酶10 min 条件下，分别将酶解pH 值调至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 提取黄精多糖，研究酶解pH 值对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.4 复合酶添加量的选择
在固定料液比为1 ∶15（g/mL）、pH 5.0、50 ℃超声波辅助提取40 min、沸水浴灭酶10 min 条件下，分别添加复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=6 ∶4，质量比）2%、3%、4%、5%、6%、7%提取黄精多糖，研究复合酶添加量对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.5 酶解温度的选择
在固定料液比为1 ∶15（g/mL）、6%复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=6 ∶4，质量比）添加量、pH 5.0、超声波辅助提取40 min，沸水浴灭酶10 min 条件下，分别按40、45、50、55、60、65 ℃进行黄精多糖提取，研究酶解温度对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.6 酶解时间的选择
在固定料液比为1 ∶15（g/mL）、6%复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=6 ∶4，质量比）添加量、pH 5.0、酶解温度为65 ℃、沸水浴灭酶10 min 条件下，分别按20、30、40、50、60、70 min 提取黄精多糖，研究酶解时间对黄精多糖提取率的影响。
1.3.2.7 料液比的选择
在固定6%复合酶（木瓜蛋白酶∶纤维素酶=6 ∶4，质量比）添加量、pH 5.0、酶解温度为65 ℃、酶解时间为50 min、沸水浴灭酶10 min 条件下，分别按料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）提取黄精多糖，研究料液比对黄精多糖提取率的影响。
1.3.3 正交试验
以单因素试验结果为基础，选取复合酶添加量、酶解温度、酶解时间和料液比作为考察因素，采用L9（34）进行正交设计，以多糖提取率为指标，进行试验。正交试验因素水平设计见表1。
表1 L9（34）正交试验因素水平
Table 1 L9（34）orthogonal experimental factor level
水平因素A 复合酶添加量/%D 料液比/（g/mL）1 5 55 45 1 ∶20 2 6 60 50 1 ∶25 B 酶解温度/℃C 酶解时间/min 3 7 65 55 1 ∶30
1.4 数据处理
每个试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。正交试验设计与数据分析采用Design-Expert 8.0.6 软件进行处理。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
2.1.1 提取方法对黄精多糖提取率的影响
不同提取方法对黄精多糖提取率的影响见图2。
图2 不同提取方法对黄精多糖提取率的影响
Fig.2 The effect of different extraction methods on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
由图2 可知，超声波辅助酶法提取多糖辅助提取率最高，常规酶法的提取率次之，超声波辅助提取法最低，这说明超声波辅助提取与酶法提取具有较好的协同作用，超声波的空化效应对酶的作用影响不大，两者结合使用可以很好的提高提取效果，这与陶涛等[13]研究结果一致。因此选择超声波辅助酶法提取进行优化工艺条件是可行的。
2.1.2 木瓜蛋白酶和纤维素酶质量比对黄精多糖提取率的影响
木瓜蛋白酶和纤维素酶质量比对黄精多糖提取率的影响见图3。
图3 木瓜蛋白酶和纤维素酶质量比对黄精多糖提取率的影响
Fig.3 The effect of the mass ratio of papain and cellulase on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
由图3 可知，在一定条件下，木瓜蛋白酶比例的增加，能提高黄精多糖提取率。在木瓜蛋白酶和纤维素酶比例为6 ∶4（质量比）时，黄精多糖提取率最高，达15.48%，可能是该比例下，纤维素酶可以适当的破坏黄精的细胞壁，使得以糖蛋白形式存在的多糖得以脱离细胞游离出来，游离出来的糖蛋白又刚好能被木瓜蛋白酶很好的分解成多糖分子和蛋白质分子。因此，可以得到较多的多糖分子。该结果与苑路等[14]研究的结果类似。当木瓜蛋白酶比例持续升高时，黄精多糖提取率有明显下降，原因可能是酶与酶之间的竞争性抑制作用使酶的整体酶解效率降低。综合考虑，选择木瓜蛋白酶和纤维素酶比例6 ∶4（质量比）为最佳复合酶复配比例。
2.1.3 复合酶酶解pH 值对黄精多糖提取率的影响
pH 值对黄精多糖提取率的影响见图4。
由图4 可知，pH 值作为影响酶解效率的重要影响因子。当pH 值为5.0 时，黄精多糖提取率最高。在其他不同pH 值条件下的多糖提取率均有不同程度的下降。其中在pH 值大于5.0 时的下降速率较大，这可能是偏酸性条件下更适合该复合酶的酶解条件。因此选择pH 值为5.0 作为复合酶的最佳酶解pH 值。2.1.4 复合酶添加量对黄精多糖提取率的影响复合酶添加量对黄精多糖提取率的影响见图5。
图4 pH 值对黄精多糖提取率的影响
Fig.4 The effect of pH on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
图5 复合酶添加量对黄精多糖提取率的影响
Fig.5 The effect of compound enzyme addition on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
由图5 可知，在一定条件下，随着复合酶添加量的增加，黄精多糖提取率不断提高。复合酶添加量由3%增加到6%的过程中，多糖提取率增加较为缓慢。当复合酶添加量达到6%时，多糖提取率达到最高。而随着复合酶的继续增加，酶解效率却出现了微量的下降，可能是由于竞争性抑制作用使酶解效率降低。因此，选择6%复合酶添加量为最佳酶添加量。
2.1.5 酶解温度对黄精多糖提取率的影响
酶解温度对黄精多糖提取率的影响见图6。
图6 酶解温度对黄精多糖提取率的影响
Fig.6 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
如图6 所示，酶解温度对黄精多糖的提取有一定的影响，当温度在40 ℃时，黄精多糖提取率较低，这可能是由于温度较低酶活性较低、分子运动也相对较弱。当温度升高至60 ℃时，黄精多糖的提取率最高。而温度再次升高至65 ℃时，黄精多糖提取率有所下降，这可能是由于温度太高对酶的活性位点起到破坏作用。因此选择60℃作为最佳酶解温度。
2.1.6 酶解时间对黄精多糖提取率的影响
酶解时间对黄精多糖提取率的影响见图7。
图7 酶解时间对黄精多糖提取率的影响
Fig.7 The effect of hydrolysis time on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
如图7 所示，黄精多糖的提取率随着酶解时间的延长不断提高，当酶解时间由20 min 逐渐延长至40 min时，黄精多糖的提取率增幅较快。随着时间继续延长，黄精多糖的提取率增幅越来越缓慢，这是由于酶解时间达到50 min 的时候，黄精粉末中的黄精多糖基本都被提取到溶液中。因此选择50 min 作为最佳酶解时间。
2.1.7 料液比对黄精多糖提取率的影响
料液比对黄精多糖提取率的影响见图8。
图8 料液比对黄精多糖提取率的影响
Fig.8 The effect of material-liquid ratio on the extraction rate of Polygonatum polysaccharide
如图8 所示，黄精多糖的提取率随着提取液溶剂比例的增加不断提高，当料液比由1 ∶10（g/mL）到1 ∶15（g/mL）时，黄精多糖的提取率迅速提高，这是由于提取液增加可以增加浓度差，使得更多溶质可以溶解出来。当料液比达到1 ∶25（g/mL）之后，提取率趋向稳定，考虑到料液比过大，后期提取液的分离时间加长，能耗大，同时提取液消耗也更多，故选择1 ∶25（g/mL）作为最佳料液比。
2.2 黄精多糖提取工艺优化
以黄精多糖提取率作为评价指标，试验结果见表2。
表2 正交试验设计方案及结果
Table 2 Design and results of orthogonal experiments
水平 A 复合酶添加量B 酶解温度因素 提取率/%C 酶解时间 D 料液比1 1 1 1 1 16.84 2 1 2 2 2 22.85 3 1 3 3 3 24.70 4 2 1 2 3 25.20 5 2 2 3 1 22.37 6 2 3 1 2 23.62 7 3 1 3 2 24.56 8 3 2 1 3 21.86 9 3 3 2 1 20.99 K1 21.463 22.300 20.773 20.067 K2 23.730 22.360 23.013 23.777 K3 22.570 23.103 23.977 23.920 R 2.267 0.803 3.204 3.853因素影响主次排序 D＞C＞A＞B最优组合条件 A2B3C3D3
由表2 可知，影响黄精多糖提取率的主次因素排列顺序为提取料液比＞酶解时间＞复合酶添加量＞酶解温度，最优组合是A2B3C3D3。即复合酶添加量6%、酶解温度65 ℃、酶解时间55 min、料液比1 ∶30（g/mL）。对此最佳条件进行补充验证试验，得到黄精多糖提取率为25.63%，大于表2 中第4 组（A2B1C2D3）得到的提取率。因此最终确定最优组合为A2B3C3D3，即黄精多糖提取率为25.63%。
3 结论
超声波辅助酶法的多糖提取率明显要比常规酶法和超声波辅助提取法的要高，影响超声波辅助酶法提取黄精多糖的主次因素顺序为提取料液比＞酶解时间＞复合酶添加量＞酶解温度，黄精多糖的最优提取条件为复合酶添加量6%，酶解温度65 ℃，酶解时间55 min，料液比1 ∶30（g/mL），得到黄精多糖提取率为25.63%。
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