红曲霉[1]是一种常见的小型丝状腐生真菌，为食品发酵常用菌种，自然状态下常见于树木、土壤和堆积物等处，具备耐酸、耐湿、耐高温和耐酒精等特点。红曲[2]是将红曲霉（Monascus spp.）接种于大米等淀粉含量丰富的原料中并经发酵制成的传统发酵产品，自古以来红曲米被认为具有改善食物消化特性和促进血液循环的作用。目前，红曲因其多样化的产品和丰富有益代谢产物而举世瞩目，根据用途可将红曲分为色曲、功能曲和酿造曲；酿造曲因具有较高的糖化酶、酯化酶及蛋白酶活力，常用于发酵酒类和酱油。
柿子[3]，是柿科植物浆果类水果，大约在每年10 月左右成熟。柿子中含有丰富的生物活性物质，以柿子为原料经多种工艺酿造而成的柿子酒，具有柿子独特的颜色和果香味，同时还具有促进人体消化和生津健脾等多种功能；但柿子由于缺少像葡萄、苹果等常见酿酒果实中所具有的构成果酒品质特性的多种有机酸，对酵母菌的发酵不利，并且发酵而成的柿子酒往往风味不佳[4]。将红曲引入果酒发酵体系，可使柿酒具有独特的风味、绚丽的色彩和更大的营养保健价值3种特色，从而克服柿子酒风味欠佳、营养成分不足的缺点，使生产的果酒具有更好的感官风味和营养保健功能。
本研究以广西桂林脆柿为原料酿制红曲柿酒，对柿酒发酵工艺进行优化，确定红曲柿酒制备的最佳工艺参数，并对成品酒进行理化指标和挥发性成分分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；红曲米：福建省宁德市古田县；柿子：广西桂林市恭城县；蔗糖：广西凤糖生化股份有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）、果胶酶（3×104 U/h）：拉氟德LAFFORTFX 公司。
1.2 仪器与设备
LRH-800F 恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；RE-2010 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；UV1800-PC 紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；XMT-F9 型电热恒温水浴锅：上海洪记仪器设备有限公司；7890A 型安捷伦气相色谱－质谱联用仪：美国安捷伦科技公司。
1.3 方法
1.3.1 红曲柿酒工艺流程
柿子清洗→脱涩→去果柄和花盘→果浆调配→主发酵→倒酒→后发酵→倒酒→陈酿→澄清→原酒
1.3.2 发酵工艺条件的优化
1.3.2.1 单因素试验
分别以不同发酵时间（0、2、4、6、8、10、12 d）、初始糖度（14%、16%、18%、20%、22%、24%）、酵母添加量（200、250、300、350、400、450 mg/kg）、红曲添加量（0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.5%、4.0%）、发酵温度（18、20、22、24、26、28 ℃）作为单因素，以发酵酒样中还原糖、酒精度、总酸、可溶性固形物作为评价指标确定最优单因素条件，为下一步响应面优化试验提供依据。
1.3.2.2 响应面试验
以单因素试验为依据，通过响应面试验设计，选择红曲米添加量（A）、初始糖度（B）、酵母添加量（C）3个因素为响应变量，以模糊数学得到的感官评分为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验，因素水平见表1。
表1 Box-Behnken 方案设计的因素及水平编码
Table 1 Factors of Box-Behnken scheme design and horizontal coding
水平因素A 红曲添加量/% B 初始糖度/% C 酵母添加量/（mg/kg）-1 2.5 18 250 0 3.0 20 300 1 3.5 22 350
1.3.3 模糊数学综合评价
设柿酒的评价因素集合为U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3、u4 分别代表产品的色泽、香气、余味、口感；设柿酒的评价评语集合为V=（v1，v2，v3，v4）=（95，80，65，40），v1、v2、v3、v4 分别代表优、良、中、差4 个等级，每个等级分别对应95、80、65、40 分。权重集合表示各评价因素的重要程度，通过采用强制对比法确定产品的权重 集 合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.20，0.25，0.35，0.20），即色泽、香气、余味、口感，分别占比0.20、0.25、0.35、0.20。
由10 名评价人员按表2 标准对产品进行感官评价。模糊关系综合评价结果：Yi=aRi，其中a 为权重集，Yi 为评价得分，Ri 为评判矩阵。
1.3.4 理化指标测定方法
可溶性固形物（残糖量）用手持糖度仪测定；酒精度：分光光度法[5]；还原糖：二硝基水杨酸法[6]；总酸：酸碱滴定法[6]。
1.3.5 挥发性成分分析
用顶空固相微萃取（headspace solid phase microex－tr-action，HS-SPME）结合气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定红曲柿酒中的挥发性成分[7]。
表2 感官评价标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation
项目 分数 级别特征 项目 分数 级别特征色泽 1 很差 香气 1 很差2缺乏品种特性和颜色 2 风味强度低，结构不平衡3颜色寡淡，浑浊，光泽差 3 有香味，无异味，风味不平衡4颜色鲜艳，酒体有光泽 4 具有任意一种原料香味5颜色鲜艳，酒体有光泽 5 水果和红曲米香味平衡余味 1 很差 口感 1 很差2余味不良、苦涩味强 2 酸甜严重失调，颗粒感严重3较好 3 轻微酸甜失调，较弱的颗粒感4余味适中、令人愉悦 4 轻微的酸甜失调，无颗粒感5余味悠长、回味优雅 5 酸甜平衡、口感融合
GC 条件：DB-WAX 色谱柱（60m×0.25mm×0.5μm），载气为氦气（He），流速19 mL/min；进样口温度为230 ℃，采用程序升温，起始温度为60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至160 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至230 ℃保持1 min。MS 条件：电子电离（electronic ionization，EI），电子能量70eV，离子源温度为230℃，连接杆温度150 ℃。采用全扫模式收集信号，扫描范围33 m/z～550 m/z。使用NIST14 质谱库检索进行定性分析，面积归一化法进行定量分析。
1.4 数据分析
每组试验重复3 次，试验结果以平均值±标准差表示，SPSS20.0 用于数据分析，Origin8.5 用于数据作图。
2 结果与分析
2.1 红曲柿酒酿造工艺单因素分析
2.1.1 发酵时间的确定
发酵时间对柿酒品质的影响见图1。
图1 发酵时间对柿酒品质的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of persimmon wine
如图1 可知，酒精度与发酵时间呈正相关，还原糖和可溶性固形物与发酵时间呈负相关，总酸在0～12 d的发酵时间内先升高后降低，而后逐渐趋于稳定。当发酵时间在2 d～6 d 时，酒精度增长速度最快，还原糖、可溶性固形物含量下降速度最快。由此可推测0～2 d期间，发酵体系中的菌株处在适应新环境阶段，生长缓慢，糖的消耗也较慢，酒精生成量较少，导致产酸量增加，此阶段为适应期；2 d～8 d 期间，发酵微生物迅速增长，糖迅速被利用，酒精生成速率快，4 d 之后总酸含量开始降低；8 d～12 d 期间，酵母菌生长基本停止，酒精生成速率变慢，糖基本没有消耗，总酸趋于稳定[8]，因此，发酵时间确定为8 d 左右。
2.1.2 红曲添加量对发酵品质的影响
红曲添加量对柿酒品质的影响见图2。
图2 红曲添加量对柿酒品质的影响
Fig.2 Effect of added quantity of red koji on the quality of persimmon wine
红曲米中的红曲霉菌、发酵用酶[9]、活性物质、红曲色素[10]等对红曲柿酒的质量有直接的影响。由图2可知，红曲添加量与柿酒还原糖含量呈负相关，与酒精度呈正相关。添加红曲后，酒精度最大可增加到13%vol 左右，原因可能是红曲米中的糖化酶可催化糖化速率，糖化后降低了酒醪中还原糖的浓度，从而减轻高渗透压对酵母生长及发酵产酒精的抑制[11]；红曲添加量越多，还原糖消耗越快，还原糖降低可推测是酵母生长消耗、红曲霉生长消耗、糖化酶糖化反应同时作用的结果；随着红曲添加量增多，可溶性固形物消耗加快，2 d～6 d 消耗速率最大。在红曲添加量达到2%以上时，8 d 左右基本达到发酵终点（可溶性固形物减少缓慢），而不加红曲的柿酒在10 d之后初始糖度仍在8%以上，发酵仍在进行，因此可得添加红曲可以有效提高发酵速率，增加可溶性糖利用率。因而，初步确定发酵时添加红曲的适宜量为3%左右。
2.1.3 酵母添加量对发酵品质的影响
酵母添加量对柿酒品质的影响见图3。
图3 酵母添加量对柿酒品质的影响
Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of persimmon wine
酵母接种量的多少，直接影响酒体酒精含量风味品质[12]。如图3 所示，随着酵母菌添加量的增加，酒精含量呈先升高后下降的趋势，还原糖含量略有下降。酵母通过无氧呼吸产生酒精，随着酵母添加量的增多，酒精含量升高，产酸量下降；而当酵母菌添加量过多时，酵母菌自身进行过度繁殖将消耗原料中大量的营养成分，使糖度降低，酒精生成量减少，总酸含量略微上升。酵母添加量对柿酒成品品质影响很大，添加酵母过多时，会导致酒体发酵剧烈，影响酒体口感；而酵母添加量过低时，环境中酵母数过少，发酵不彻底，导致酒精度偏低，还会引起杂菌生长导致酒的品质降低[13]，综合考虑，酵母添加量应在250 mg/kg～350 mg/kg。
2.1.4 初始糖度对发酵品质的影响
初始糖度对柿酒品质的影响见图4。
图4 初始糖度对柿酒品质的影响
Fig.4 Effect of initial sugar content on the quality of persimmon wine
由图4 试验结果可知：随着发酵体系中初始糖度的提高，酒精含量先增大而后趋于平缓，还原糖、可溶性固形物含量升高，总酸含量影响不显著（P ＞0.05）。初始糖度超过20%后，糖分未能被完全利用，酒精度不再继续上升，造成发酵体系中还原糖、可溶性固形物含量偏高。当初始糖度过低时，会使红曲柿酒酒精度偏低，发酵风味不突出，而初始糖度过高则会造成残糖过多，口味过甜，影响感官。由初始糖度单因素试验结果表明，较优初始糖度为20%。
2.1.5 发酵温度对发酵品质的影响
发酵温度对柿酒品质的影响见图5。
图5 发酵温度对柿酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on the quality of persimmon wine
发酵温度是影响柿酒品质的一个主要因素。由图5可见，随着发酵温度的升高，产酒精速率随之加快，总酸含量升高，还原糖含量降低。温度过高会使酵母的代谢增快，加速酵母的衰亡，并且也不利于红曲霉的生长，导致主发酵的时间缩短；而在较低温度下，酵母、红曲霉等代谢速率低，不会有明显的旺盛发酵阶段[14]，不利于酒精以及风味成分的形成。虽然适当低温可以阻碍醋酸菌、乳酸菌以及杂菌的过度生长，从而起到降酸的作用[15-16]，但温度过低，会导致发酵不完全，残糖含量过高等问题。当温度在20 ℃～24 ℃时，红曲柿酒产酒精速率较为理想，在第8 天发酵基本终止（酒精度不再上升），还原糖、总酸含量趋于稳定，因此确定20 ℃～24 ℃为适宜发酵温度。
2.2 基于模糊数学感官评价的响应面试验结果分析
按1.3.3 中方法计算感官评分，作为响应面试验结果，结果见表3，方差分析见表4。
通过响应面优化试验回归模型的建立，得到红曲柿酒感官评分多元二次回归方程：Y=84.06+2.59A+1.20B-0.16C-0.53AB+1.19AC-1.07BC-6.50A2-1.86B2-0.30C2。
由表4 可知，失拟项不显著（P=0.776 8 ＞0.05），感官评分所选模型极显著（P ＜0.01）；在模型的一次项中，红曲添加量（A）对感官评分影响极显著（P＜0.01），初始糖度（B）对感官评分影响为显著（P＜0.05）；二次项中，A2 对红曲柿酒感官评分影响极显著（P ＜0.01），B2 对感官评分影响显著（P＜0.05）。3 种因子对红曲柿酒感官评分的影响程度依次为：红曲米添加量（A）＞初始糖度（B）＞酵母添加量（C）。
表3 红曲柿酒响应面试验设计与结果
Table 3 Response surface methodology design and results of hongqu persimmon wine
因素试验号感官评分A 红曲添加C 酵母添加量/（mg/kg）1 3.5 20 350 80.125 2 3.0 20 300 82.280 3 3.0 20 300 84.950 4 3.0 20 300 83.400 5 2.5 18 300 71.300 6 3.0 18 350 81.740 7 3.5 20 250 78.875 8 3.0 22 350 82.550 9 2.5 20 250 76.775 10 3.0 20 300 83.285 11 2.5 22 300 74.200 12 2.5 20 350 73.250 13 3.0 18 250 79.100 14 3.0 20 300 86.400 15 3.5 22 300 79.025 16 3.0 22 250 84.200量/%B 初始糖度/%
由表4 可知，多元二次回归方程的因变量和自变量之间的线性关系良好（R2=0.954 0），说明该模型可解释红曲柿酒中95.4%的响应值变化，且变异系数较低（C.V=1.73%），试验重现性较好。
以感官评分为响应值，最佳发酵条件为：红曲添加量3.00%，初始糖度21%，酵母添加量275 mg/kg，红曲柿酒的感官评分的理论值为84.657 分。在此条件下进行验证试验，得到最优发酵条件下感官评分为86.542分，与理论预测值相差1.87 分，说明参数准确可靠，有一定实用价值。
表4 回归方程方差分析
Table 4 Analysis results of regression and variance
注：*P＜0.05 统计结果差异显著，**P＜0.01 统计结果差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 显著性模型 278.14 9 30.90 16.12 0.000 7 **A 53.85 1 53.85 28.10 0.001 1 **B 11.47 1 11.47 5.98 0.044 4 *C 0.21 1 0.21 0.11 0.752 4 AB 1.14 1 1.14 0.59 0.466 7 AC 5.70 1 5.70 2.97 0.128 3 BC 4.60 1 4.60 2.40 0.165 2 A2 178.14 1 178.14 92.94 ＜0.000 1 **B2 14.62 1 14.62 7.63 0.028 0 *C2 0.38 1 0.38 0.20 0.667 7残差 13.42 7 1.92失拟项 2.94 3 0.98 0.37 0.776 8净误差 10.47 4 2.62总离差 291.55 16
2.3 柿酒香气成分分析
发酵8 d 后的普通柿酒和红曲柿酒经顶空固相微萃取-气质联用分析后得到主要的风味物质，其相对含量对比结果见表5。
表5 柿酒挥发性成分分析结果
Table 5 Results of analysis of volatile components in persimmon wine
成分类别酯类序号12 345 67 89 1 0 11化合物名称 占比/% 香气描述红曲柿酒 普通柿酒乙酸乙酯（ehyl acetate） 5.05 果香和酒香乙酸异戊酯（isoamyl acetate） 0.47 0.95 有愉快的香蕉香味正己酸乙酯（ethyl caproate） 0.33 3.89 有水果香气味庚酸乙酯（ethyl heptanoate） 0.03 有菠萝香气味辛酸乙酯（ethyl octanoate） 3.11 4.41 白兰地酒香壬酸乙酯（ethyl nonate） 0.14 油脂水果和白兰地味正辛酸异丁酯（lsobutyl caprylate） 0.11癸酸甲酯（methyl decanoate） 0.04癸酸乙酯（ethyl caprate） 2.33 1.2 醇香、甜香、花香辛酸3-甲基丁酯（octanoic acid 3-methyl butyl ester） 0.37 果香琥珀酸二乙酯(diethyl succinate) 0.1 有愉快气味12 13 乙酸苯乙酯（phenethyl acetate） 0.81 玫瑰、蜂蜜香14 月桂酸乙酯（ethyl laurate） 1.37 0.13 花果香15 癸酸3-甲基丁酯（3-methyl butyl decanoate） 0.09 浓郁的玫瑰香味16 琥珀酸二乙酯（diethyl succinate） 0.06 有愉快气味苯乙酸乙酯(ethyl phenylacetate) 0.12 蜂蜜香气
续表5 果酒挥发性成分分析结果
Continue table 5 Results of analysis of volatile components in persimmon wine
成分类别酯类序号17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28化合物名称 占比/% 香气描述红曲柿酒 普通柿酒肉豆蔻酸乙酯（ethyl myristate） 0.3 鸢尾油香壬酸乙酯（ethyl nonate） 0.09 油脂水果和白兰地味棕榈酸乙酯（ethyl palmitate） 1.6 0.15 坚果香、可可香9-十六碳烯酸乙酯（ethyl 9-hexadecanoate） 0.58 0.43硬脂酸乙酯（ethyl stearate） 0.06 略呈蜡香油酸乙酯（ethyl acetate） 0.45 呈鲜花香气反油酸乙酯（elaidic acid ethyl ester） 0.16 有花香和果香香气。亚油酸乙酯（ethyl linoleate） 0.2 有花香和果香香气。邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate） 0.08 微有芳香气味。亚麻酸乙酯（ethyl linolenate） 0.05邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate） 0.12 微具芳香气味水杨酸-2-乙基己基酯（2-ethylhexyl salicylate） 0.17醇类 29 乙醇（ethanol） 56.94 63.51 酒香及辛辣味30 异丁醇（2-methyl-1-propanol） 0.6 3.94 酒精味、青草味31 异戊醇（3-methyl-1-butanol） 0.09 9.03 白兰地香气和辛辣味32 苯乙醇（phenethyl alcohol） 10.16 具有玫瑰香气酸类 33 醋酸（acetic acid） 2.35 3.21 食醋酸味34 异丁酸（isobutyric acid） 0.22 强烈刺激性气味35 异戊酸（isovaleric acid） 0.2 微量有水果香36 己酸（hexanoic acid） 0.24 0.19 微量有水果、奶油香37 辛酸（octanoic acid） 1.24 0.6 稀释后呈水果香气38 癸酸（decanoic acid） 0.32 0.29 有香味39 棕榈酸（palmitic acid） 1.23 40 壬酸（nonanoic acid） 1.11 微有特殊气味其它 41 对二甲苯（p-xylene） 0.03 0.12 42 1-十二烯（propylene tetramer） 0.08 43 十三烷（n-tridecane） 3.62 44 1-十三烯（1- tridecene） 0.03 45 2-壬酮（2-nonanone） 0.22 水果、花、油脂、药草味46 椰子醛（gamma-nonanolactone） 0.02 椰子香气47 癸醛（decyl aldehyde） 0.24 甜橙油、柠檬油香的后韵48 2，4-二叔丁基苯酚（2,4-di-tert-butylphenol） 0.14 0.32 49 苯乙烯（styrene） 5.35 有芳香气味50 正己醛（hexanal） 0.19 生油脂/青草气及苹果香51 2-己烯醛（hex-2-enal） 0.08 52 甲基庚烯酮（6-methyl-5-hepten-2-one） 0.39 水果、新鲜清香香气
红曲柿酒共检测出45 种挥发性物质，其中酯类27 种，醇类4 种，酸类7 种，其它类7 种。普通柿酒中共检测出23 种，其中酯类8 种，醇类3 种，酸类5 种，其它类物质7 种。两种果酒相比，添加红曲后柿酒风味物质的种类增加，特别是酯类物质。
红曲柿酒中酯类化合物种类最多，醇类化合物、酸类化合物其次，醛酮类化合物最少。酯类物质由高级醇和脂肪酸在酶的催化作用下形成，是红曲柿酒中种类最多的香气物质，这些物质使酒具有果香、花香、蜂蜜香、乳香等，增加了酒体的复杂性、多样性和愉悦性。酯类物质中，以乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯为主。乙酸乙酯微带果香和酒香[17]，榈酸乙酯有蜡香和奶油的香气是红曲黄酒中特有的香气物质[18]，月桂酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯带有花香和果香。一般的发酵果酒中不可能有如此高含量的脂肪酸[19]，推测高含量的酯类成分可能是红曲米中酯化酶催化相应的脂肪酸和乙醇反应后形成的酯，具体的形成机理，仍需要进一步研究。
醇类物质也是酒中重要的香气组成成分，适当含量的高级醇能赋予酒体清甜的水果香，同时还是形成酯类物质的前体有利于红曲柿酒特征香气成分的形成。乙醇、苯乙醇是主要的醇类物质。苯乙醇具有玫瑰香与蜂蜜香，被认为对黄酒香气有重要影响[20]，同时苯乙醇也是水果当中最重要的香气成分。
酸类物质能与醇类物质反应生成相应的酯类物质，从而赋予酒体香味。棕榈酸、乙酸、辛酸为果酒中主要的酸类物质，棕榈酸具有腐败脂肪气味，有水果香；乙酸具有食醋内酸味及刺激性气味；少量辛酸有水果香气。适量含量的酸能丰富酒的口感，提高红曲柿酒整体协调性，过高或过低都会给酒风味、口感带来负面影响，适当调整果酒的糖酸比例有助于改善果酒风味，提高感官品质。
3 结论
通过单因素及响应面试验优化确定红曲柿酒的最佳发酵工艺为：红曲添加量3.00%，初始糖度21%，酵母添加量275 mg/kg，红曲柿酒的感官评分值为86.542 分。
在上述优化条件下，对红曲柿酒进行顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）分析，并用未加红曲米的柿酒作为对照，结果表明，红曲柿酒共检测出45 种挥发性物质，其中酯类物质27 种，醇类物质4种，酸类物质7 种，其它类物质7 种。普通柿酒中共检测出23 种挥发性成分，其中酯类物质8 种，醇类物质3 种，酸类5 种，其他类物质7 种。两种果酒相比，添加红曲后柿酒风味物质的种类增加，特别是酯类物质。红曲柿酒中含有较高含量的脂肪酸酯以及苯乙醇，这些被认为是黄酒中的主要成分，说明添加红曲后柿子酒风味结构改变，能有效改善柿酒风味寡淡问题、口感不佳等问题。
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