艳山姜为姜科山姜属植物艳山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥成熟果实，始见于《植物名实图考》，广泛分布在我国西南地区[1-2]。艳山姜具有温中燥湿、行气止痛、截疟的功效，主治心腹冷痛、胸腹胀满、消化不良、呕吐腹泻等症状，已被收录于2003 版《贵州省中药、民族药标准》[3]。艳山姜用于治疗胃溃疡，在水族的民间应用已经有数百年历史，且效果显著[3-4]。此外，在贵州，艳山姜茎、叶和果实也作为一种食品应用于日常生活中。因此艳山姜作为“药食同源”植物的开发研究具有极大的价值。
近年来研究主要集中在艳山姜抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化、抗炎、镇痛和降压等药理作用上，而对艳山姜成分及提取工艺的研究几乎为空白[5-8]。艳山姜抗氧化活性的研究中，仅对叶的醇提物成分进行了研究，对其它药用部位以及成分研究未见报道[9-10]。因此本文采用响应面分析法优化艳山姜多糖的提取工艺，并比较了不同药用部位多糖的抗氧化活性，填补了艳山姜成分及提取工艺研究的空白，为艳山姜这一特色“药食同源”植物的开发提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
UV721 型紫外可见分光光度计：上海平轩科学仪器有限公司；BSA124S 电子分析天平：赛多利斯仪器有限公司；KQ-500DE 超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司。
葡萄糖标准品（批号：MB6951）：大连美仑生物技术有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国Sigma 公司；其它化学试剂均为分析纯试剂。
1.2 材料
艳山姜：华夏药业有限责任公司，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为姜科山姜属植物艳山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt et Smith 的干燥成熟根茎。
1.3 方法
1.3.1 样品的前处理
将新鲜的艳山姜置于阴凉处晾干，除去杂质，用粉碎机粉碎，过40 目筛，即得艳山姜粉末。
1.3.2 超声辅助提取的单因素试验
分别称取艳山姜粉末5 g，按照液料比30∶1（mL/g），超声功率70 W，考察提取时间分别为30、35、40、45、50 min 时对多糖得率的影响；按照液料比30∶1（mL/g），提取时间40 min，考察超声功率分别为50、60、70、80、90 W 时对多糖得率的影响；按照超声功率70 W，提取时间40 min，考察液料比分别为20∶1、30：1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）时对多糖得率的影响。
1.3.3 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，对3 个影响因素进行三因素三水平试验，以多糖得率作为评价指标，探究艳山姜多糖的最佳提取工艺条件。利用Design Expert 10.0.7 软件进行分析，建立数学回归模型，以得到最佳的提取工艺，表1 为响应面因子水平。
表1 响应面设计试验因素水平及编码
Table 1 Response surface design test factor level and coding
水平 因素A 提取时间/min B 超声功率/W C 液料比/（mL/g）-1 30 60 30 ∶1 0 35 70 40 ∶1 1 40 80 50 ∶1
1.3.4 多糖含量的测定
1.3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制标准曲线的绘制参考文献[11-12]。得到线性回归方程为：Y=8.043 1x+0.074 5，R2=0.999 3。
1.3.4.2 样品多糖得率的测定
超声辅助提取后将提取液冷却至25℃，以4 000r/min离心2 次，每次15 min，分离上清液，在上清液中加入无水乙醇（最终乙醇浓度至80%），4 ℃冰箱内过夜，以4 000 r/min 离心10 min，收集沉淀，50 ℃干燥至恒重，即得艳山姜多糖。分别称取10 mg 艳山姜多糖，加入10 mL 蒸馏水，配制成1 mg/mL 的艳山姜多糖溶液。每份溶液各取0.1 mL，分别加入蒸馏水0.9 mL，将其稀释100 倍后分别加入1 mL 苯酚摇匀，迅速加入5 mL 浓硫酸摇匀，冷却至室温（25 ℃），测定其吸光值，根据标准曲线计算供试液中葡萄糖的含量，再按下式计算样品中多糖得率：多糖得率/%=C×D/W×10。式中：C 为样品中葡萄糖浓度，mg/mL；D 为样品溶液稀释倍数；W为样品的质量，g。
1.3.5 艳山姜多糖抗氧化活性研究
1.3.5.1 样品的前处理
分别取艳山姜粉末10 g 在提取时间35 min、超声功率70 W、液料比40∶1（mL/g）条件下提取多糖，得到母液浓度为25 mg/mL，然后取160 μL 母液置于10 mL容量瓶中，余下部分用蒸馏水补足，得到400 μg/mL 溶液，再将溶液对半稀释，分别得到50、100、200、400 μg/mL的各待测样品溶液。
1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力测定
参照文献的方法[13-14]，分别准确吸取不同浓度待测样品2 mL，再吸取2 mL DPPH 标准乙醇溶液加入到10 mL 的试管中摇匀，室温（25 ℃）下避光静置30 min后测定其在517 nm 处的吸光值。每个待测样品平行测定3 次，取平均值。按照如下公式计算清除率。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100
式中：Ao 为2 mL 样品溶剂与2 mL DPPH 混合反应后的吸光值；Ai 为2 mL 样品与2 mLDPPH 混合反应后的吸光值；Aj 为2 mL 样品与2 mL 乙醇混合反应后的吸光值。
1.3.5.3 超氧阴离子自由基的清除能力测定
参照文献的方法并进行修改[15-16]，在420 nm 处测定吸光值，每隔30 s 测一次，记录样品在300 s 内的吸光值，最后计算线性范围内的吸光值每分钟的增加值。将所得的各个吸光值带入如下公式，求出不同浓度样品对于超氧阴离子自由基的清除率。
超氧阴离子自由基清除率/%=[（ΔAo-ΔA）/ΔAo]×100
式中：ΔAo 为邻苯三酚在300 s 内每分钟吸光值的增加值；ΔA 为样品溶液在300 s 内每分钟吸光值的增加值。
1.3.5.4 羟基自由基的清除能力测定
参照张淑杰等的方法[17]，在37 ℃恒温水浴锅中温浴60 min，在536 nm 处测其吸光值，分别记录吸光值。将所得的各个吸光值带入如下公式求出不同浓度样品对于羟基自由基的清除率。
羟基自由基清除率/%=[A 样-A 损]/[A 未-A 损]×100
式中：A 样为用不同浓度待测样品1 mL 代替1 mL双蒸水测得吸光值；A 损为加入1 mL 0.01%的过氧化氢溶液后测定的吸光值；A 未为用1 mL 蒸馏水代替1 mL 0.01%过氧化氢测定的吸光值。
1.4 数据处理
将测得的数据用SPSS 17.0 软件进行统计计算，运用Design-Expert10.0.7 软件进行响应面优化分析处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
提取时间对艳山姜多糖得率的影响见图1。
图1 提取时间对艳山姜多糖得率的影响
Fig.1 The effect of extraction time on the yield of Alpinia zerumbert polysaccharides
由图1 可知，提取时间为30 min ～50 min 时，艳山姜多糖得率在35 min 达到最高值5.25%，提取时间为40 min 时多糖得率显著下降，原因可能是随着提取时间延长，其它成分也被提取出来，使得多糖含量下降，而40 min 后溶液达到饱和，无更多成分被提取出来，因此多糖得率无显著变化。
超声功率对艳山姜多糖得率的影响见图2。
图2 超声功率对艳山姜多糖得率的影响
Fig.2 The effect of ultrasonic power on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides
由图2 可知，超声功率为50 W～90 W 时，艳山姜多糖得率在70 W 达到最高值4.28%，当超声功率增大到80 W 时多糖得率显著下降，可能原因是高强度的超声波剪切作用使得部分糖键断裂，使得多糖含量下降。
液料比对艳山姜多糖得率的影响见图3。
由图3 可知，液料比为20∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）时，艳山姜多糖得率在40∶1（mL/g）时达到最高值4.19%，当液料比超过40∶1（mL/g）后多糖得率下降，过高液料比导致多糖得率下降可能是因为随着溶剂量的增大，可溶性物质溶出增大，杂质含量增高，某些未知成分可能导致部分多糖的分解。
图3 液料比对艳山姜多糖得率的影响
Fig.3 The effect of liquid-material ratio on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides
2.2 响应面方案与试验结果
利用响应面软件Design Expert 10.0.7 设计三因素三水平的试验，设计方案见表2，回归模型方差分析见表3。
表2 响应面设计及结果
Table 2 Response surface design and results
试验号 因素 多糖得率/%A B C 1 0 0 0 5.341 1 4.054 3-1 -1 0 2.551 4 0 0 0 5.430 2 0 1 1 2.794 6 0 1-1 3.885 5 1 0-1 0 3.353 8 1 0-1 3.085 7 1-1 0 -1 2.407 10 0 -1 1 4.089 11 1 1 0 3.404 12 0 0 0 5.561 13 -1 1 0 3.323 14 0 0 0 5.657 15 -1 0 1 3.039 16 0 0 0 5.746 17 0 -1 -1 3.873 9
对模型数据进行回归拟合，得到自变量提取时间（A）、超声功率（B）、液料比（C）与艳山姜多糖得率（Y）的二次多元回归方程：Y=5.55+0.16A+0.10B+0.091C-0.18AB-0.23AC-0.012BC-1.77A2-0.62B2-0.95C2。
矫正系数
=0.975 9，预测复相关系数R2=0.989 5，预测相关系数R2（Pred）=0.950 2 与预测复相关系数接近，说明偏差在合理范围内，实际值和预测值拟合度比较好。失拟项P=0.360 6＞0.05 不显著，说明选择的模型对该试验的拟合度较好。变异系数C.V.%为4.49%，说明该模型相关性好，可用该拟合回归方程对不同条件下艳山姜多糖得率的最佳工艺进行分析。
表3 响应面二次模型多糖得率的方差和回归系数分析
Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型 20.97 9 2.33 73.11 ＜0.000 1 显著A 提取时间 0.22 1 0.22 6.79 0.035 1 显著B 超声功率 0.080 1 0.080 2.51 0.157 1 C 液料比 0.066 1 0.066 2.07 0.193 6 AB 0.13 1 0.13 4.08 0.083 2 AC 0.21 1 0.21 6.68 0.036 2 显著BC 0.000 552 2 1 0.000 552 2 0.017 0.899 0 A2 13.14 1 13.14 412.42 ＜0.000 1 极显著B2 1.63 1 1.63 51.23 0.000 2 极显著C2 3.79 1 3.79 119.04 ＜0.000 1 极显著残差 0.22 7 0.032失拟项 0.12 3 0.038 1.42 0.360 7纯误差 0.11 4 0.027总和 21.19 16
由表3 可知，A、AC、A2、B2、C2 的P＜0.05，以上因素对多糖得率的影响显著；B、C、AB、BC 的P＞0.05，以上因素对多糖得率的影响不显著。由F 值可知，3 个因素对艳山姜多糖得率的影响程度的大小顺序为：提取时间＞超声功率＞液料比。
2.3 响应面分析
当液料比固定为40∶1（mL/g）时，超声功率与提取时间相互作用见图4。
图4 提取时间和超声功率对多糖得率响应面图
Fig.4 Response surface graph of extraction time and ultrasonic power versus polysaccharide yield
由图4 可知，在超声功率一定时，多糖得率随提取时间先增大然后降低；在提取时间一定时，多糖得率随超声功率先增大然后趋于平缓降低，响应面坡度较小，提取时间和超声功率的交互作用不显著。
当超声功率固定为70 W 时，提取时间和液料比相互作用见图5。
图5 提取时间和液料比对多糖得率响应面图
Fig.5 Response surface graph of extraction time and liquidmaterial ratio versus polysaccharide yield
由图5 可知，在液料比一定时，多糖得率随提取时间先增大后降低；在提取时间一定时，多糖得率随液料比先增大后降低，响应面坡度陡峭，等高线密集，接近椭圆形，说明提取时间和液料比交互作用显著。
当提取时间固定为35 min 时，超声功率和液料比相互作用见图6。
图6 液料比和功率对多糖得率的响应面图
Fig.6 Response surface diagram of the ratio of liquid-material and ultrasonic power to the yield of polysaccharide
由图6 可知，在超声功率一定时，多糖得率随液料比先增大然后趋于平缓；在液料比一定时，多糖得率随超声功率先增大然后趋于平缓，响应面坡度较小，等高线近圆形，说明液料比和超声功率的交互作用不显著，以上结果均这与回归方程方差分析的结果相符。
2.4 优化与验证试验
软件处理下最优条件为液料比40.12∶1（mL/g）、超声功率72.86 W、提取时间35.47 min，此条件预测艳山姜多糖得率为5.45%。根据实际操作条件，将最佳提取工艺修正为：提取时间35 min、超声功率为70 W、液料比为40∶1（mL/g），得到实测多糖得率为5.37%。实际值与预测值之间相差小于0.1%，偏差较小，验证了该响应面模型的有效性。因此，响应面法对艳山姜多糖最佳优化工艺为提取时间35 min、超声功率70 W、液料比40∶1（mL/g）。
2.5 艳山姜多糖抗氧化活性结果
艳山姜多糖抗氧化作用见表4。
表4 艳山姜多糖抗氧化作用
Table 4 Antioxidant effect of Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith polysaccharide
浓度/（μg/mL） DPPH 自由基清除率/%羟基自由基清除率/%50 40.26 37.65 36.96 100 62.98 60.19 59.33 200 76.89 73.13 72.56 300 90.26 89.98 89.16 400 93.17 92.07 90.17超氧阴离子自由基清除率/%
2.5.1 艳山姜多糖对DPPH 自由基清除作用
当浓度在50 μg/mL ～300 μg/mL 时，艳山姜多糖各浓度对DPPH 自由基的清除率随浓度升高而增大，表现出明显的量效依赖线性关系，当浓度大于300 μg/mL时，艳山姜多糖对DPPH 自由基的清除率基本保持不变，当浓度为400 μg/mL 时，艳山姜多糖对DPPH 自由基的最大清除率为93.17%，因此，艳山姜多糖对DPPH自由基有一定的清除作用。
2.5.2 艳山姜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
当浓度在50 μg/mL～400 μg/mL 时，艳山姜多糖各浓度对超氧阴离子自由基的清除率随浓度升高而增大，表现出明显的量效依赖线性关系。当浓度为400 μg/mL时，艳山姜多糖对超氧阴离子自由基最大清除率为92.07%。因此，艳山姜多糖对超氧阴离子自由基有一定的清除作用。
2.5.3 艳山姜多糖对羟基自由基的清除作用
当浓度在50 μg/mL～400 μg/mL 时，艳山姜多糖对羟基自由基的清除率随浓度升高而增大，表现出明显的量效依赖线性关系。当浓度为400 μg/mL 时，艳山姜多糖对羟基自由基的最大清除率为90.17%。因此，艳山姜多糖对羟基自由基有一定的清除作用。
由以上结果可知，艳山姜多糖有一定的抗氧化活性，在一定范围内具有浓度依赖性。近年研究表明，多糖一方面可直接作用于抗氧化酶，通过提高如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，发挥抗氧化作用。此外，多糖还能够与产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）所需的金属离子络合[18]。多糖含有多个羟基，这些羟基可以与Fe2+和Cu2+等产生自由基所需的金属离子络合，抑制了自由基的产生，影响了脂质的过氧化反应的起始，并最终抑制了ROS 的产生[19]。另一方面，多糖可以直接作用于自由基，可以直接捕获在脂质过氧化链式反应中产生的ROS，阻断或减慢脂质过氧化。对于羟基自由基，多糖链上的氢原子可与它们结合产生水，达到去除羟基自由基的目的。对于超氧阴离子自由基，多糖类可以引起氧化反应，从而达到清除的目的[20]。
3 结论
本试验利用超声辅助提取法获得艳山姜多糖，进一步通过响应面法优化了多糖的提取工艺。结果表明，影响艳山姜多糖得率的顺序为：提取时间（A）＞超声功率（B）＞液料比（C）。艳山姜多糖最佳超声辅助提取工艺条件为：提取时间35 min、超声功率70 W、液料比40∶1（mL/g），在此工艺条件下，艳山姜多糖得率为5.37%。本研究首次对艳山姜多糖提取工艺进行研究，并优化了多糖的提取工艺。此外，艳山姜多糖具有较强的抗氧化能力。
综上所述，超声辅助提取艳山姜多糖的优化工艺可行，且艳山姜多糖有较强的体外抗氧化能力，本研究为艳山姜产品的研究与开发提供理论依据。
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