樱桃番茄又称圣女果、小番茄，因果实口味酸甜可口，营养丰富，深受消费者青睐。樱桃番茄富含维生素C 和酚类化合物等活性成分，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗癌和减缓心血管病的作用。樱桃番茄采摘后，果实的呼吸作用产生活性氧，激活苯丙氨酸解氨酶基因，促进了果实中酚类化合物生物合成。但是，随着贮藏时间延长，在氧化酶与活性氧作用下，维生素C和酚类化合物被消耗，含量下降[1-2]。因此，采用贮藏保鲜技术保持樱桃番茄果蔬营养品质和商业价值具有重要意义。
超声具有高效、快速、安全等优点，已经广泛应用在采后果蔬保鲜中。研究发现，由于水的超声分解而形成的自由基对植物细胞系统施加氧化应激，并诱导更高的苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性以保护细胞免受氧化损伤，苯丙烷代谢增强，使果蔬中酚类物质含量增加[3]。此外，超声处理能够抑制果蔬中维生素C 含量的降低，并提高果实抗氧化能力[4]。超声与浸渍保鲜联合使用，在维持果蔬品质特性方面具有独特优势。常用的浸渍液有钙溶液，钙（Ca2+）在调节果蔬采后生理功能过程中起着关键作用。研究表明，钙作为分子间结合剂，有助于维持果蔬硬度以及细胞膜稳定性[5]。
因此，本文以樱桃番茄为原料，研究超声协同钙浸渍处理对樱桃番茄贮藏过程中酚类物质和抗氧化能力的影响，通过对酚类物质结构特性分析，揭示超声协同钙浸渍提高樱桃番茄品质机理。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
樱桃番茄，品种“圣女1416”，采摘于河南省安阳市种植园。
乳酸钙（食品级）：洛阳昊华化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；甲酸、乙醇、乙腈（色谱级）：美国CBS 公司；没食子酸、绿原酸、芦丁、咖啡酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸（色谱级）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
恒温超声波清洗机（SBL-10DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机（GL-10000C）：上海安亭科学仪器厂；高效液相色谱仪（Waters 1525 Binary Pump）：美国Waters 公司；高效液相色谱-质谱联用仪（Esquire LC）：德国Bruker 公司。
1.3 样品处理
樱桃番茄采摘后立即送往实验室，挑选大小均匀、成熟度相似的果实分组进行试验。试验共分为4组：对照组（CK 组，未处理的新鲜果实）；超声组（U 组，20 W/L、15 ℃、15 min）；钙浸渍组（Ca 组，2%乳酸钙、15 ℃、15 min）和超声协同钙浸渍组（U+Ca 组，20 W/L、2%乳酸钙、15 ℃、15 min）。处理后的样品装入带孔保鲜盒，置于4 ℃环境中贮藏。
1.4 总酚
总酚测定参照Toor R K 等[6]方法。
1.5 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析
取20 mg 冷冻干燥后的总酚样品，溶于1 mL 流动相中（甲酸∶水=0.8∶99.2，体积比），样品过0.22 μm 滤膜，进样量为20 μL。
色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 色谱柱，柱温30 ℃，流速1 mL/min，流动相A（甲酸-水，0.8∶99.2，体积比），流动相B（乙腈，100%），紫外检测器在280 nm 和330 nm 处进行检测。梯度洗脱程序：0～10 min，5%B；10.01 min～25 min，15%B；25.01 min～40 min，20%B；40.01min～42min，40%B；42.01 min～50 min，0%B。
1.6 抗氧化能力
1，1-二苯基-2-吡啶并肼基自由基清除能力（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH） 测定参照Pataro G 等[7]方法。
1.7 酶活测定
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性测定参照Luh B S 等[8]方法。
过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定参照Zhao R 等[9]方法。
苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性测定参照Yingsanga P 等[10]方法。
1.8 液质联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析
酚类提取液经AB-8 大孔吸附树脂纯化后进行浓缩，冻干。冻干后的酚类样品过0.22 μm 滤膜，进样量为20 μL。
色谱条件：同1.5（色谱柱Zorbax SB-C18）。
质谱条件：电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI），离子源喷雾电压为4.5 kV，毛细管温度200°C，雾化器氮气8 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氮气流速20 L/min，扫描范围为m/z 50～1 000，负离子模式扫描。
1.9 数据处理
试验数据用Excel 2010，SPSS 20 和GraphPad Prism 5 进行处理，结果表示为平均值±标准偏差。
2 结果与分析
2.1 超声协同钙浸渍对樱桃番茄中酚类含量的影响
樱桃番茄酚酸高效液相色谱（HPLC）结果见图1。
酚类物质是果蔬组织重要的次生代谢产物，HPLC分析结果显示樱桃番茄中含有没食子酸、槲皮素、绿原酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、咖啡酸、丁香酸和阿魏酸，其中没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸为主要酚酸。
图1 樱桃番茄酚酸色谱图
Fig.1 The chromatogram of phenolic acid in cherry tomatoes
超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚类含量的影响见图2。
图2 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚类物质含量的影响
Fig.2 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on phenolics content of cherry tomatoes during storage
如图2（a）所示，贮藏过程中，樱桃番茄中总酚含量呈现先降低后升高的趋势，并在第15 天达到最低值。贮藏10 d ～15 d，Ca 组和U+Ca 组的总酚含量显著高于CK 组，超声作用增强苯丙烷代谢，促进酚类物质的增加，同时钙浸渍延缓了酚类物质的消耗[3]。因此，超声协同钙浸渍技术具备维持较高总酚含量的作用。
超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸含量的影响如图2（b～e）所示，没食子酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸含量总体呈现先升高后降低趋势，且在15 d 达到最高值，此时U+Ca 组各酚酸含量（26.64、1.70、1.22 μg/g）均显著高于CK（22.59、1.08、0.78 μg/g）组。没食子酸和对羟基苯甲酸含量在贮藏第0 天～第5 天呈下降趋势，可能与果实消耗对羟基苯甲酸以抵御低温逆境有关。绿原酸含量在贮藏第5 天达到最高值，此时U+Ca 组（3.97 μg/g）含量显著高于CK 组（3.53 μg/g）。贮藏末期（30 d），U+Ca 组对羟基苯甲酸和阿魏酸含量（0.77 μg/g 和0.53 μg/g）显著高于CK 组（0.41 μg/g 和0.23 μg/g）。结果表明，超声协同钙浸渍处理能够有效延缓酚酸含量的降低。
2.2 超声波协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚类抗氧化能力的影响
超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚类抗氧化能力的影响如图3 所示。
由图3 可知，樱桃番茄贮藏期间抗氧化能力呈现先降低后升高的趋势，与总酚含量变化相一致。果实中较高的酚类物质含量能够提供更多的基团参与到与自由基的反应中，提供更高的抗氧化能力[11-12]。整个贮藏期间，U+Ca 组DPPH 自由基清除率均显著高于CK 组，且在贮藏15 d 以后，U+Ca 组DPPH 自由基清除率显著高于Ca 组，表明超声协同钙浸渍处理能够有效保持樱桃番茄贮藏期间较高的抗氧化能力。
图3 超声波协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚类抗氧化能力的影响
Fig.3 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the antioxidant capacity of phenols of cherry tomatoes during storage
2.3 超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酶活的影响
超声协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酶活的影响研究见图4。
由图4 可知，贮藏过程中，樱桃番茄PPO 和POD活性呈现先升高后降低的趋势，并在贮藏第15 天达到最大值，与总酚含量变化趋势一致。贮藏末期（30 d），U+Ca 组的PPO 和POD 活性[338.33 ΔOD420 nm/（min·g）和180.00 ΔOD470 nm/（min·g）] 显著低于CK 组[（379.00 ΔOD420 nm/（min·g）和207.73 ΔOD470nm/（min·g）]。较低的PPO 和POD 活性可减少酚类物质的消耗，延缓酚类物质含量的下降[12-13]。因此，U+Ca 处理能够显著抑制贮藏期间PPO 和POD 活性。
图4 超声波协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酶活性的影响
Fig.4 The effect of ultrasonic combined with calcium impregnation on the enzyme activity of cherry tomatoes during storage
樱桃番茄PAL 酶活随着贮藏时间的延长呈现先上升后下降的趋势，并在贮藏第20 天达到最大值，这可能与次级代谢产物如酚类物质的积累不相同有关。贮藏末期（30 d），U+Ca 组的PAL 活性[252.40 ΔOD290 nm/（h·g）]显著低于CK 组和U 组[（303.87、313.20 ΔOD290 nm/（h·g）]，表明U+Ca 处理有效抑制苯丙烷类代谢系统，减少次级代谢产物（酚类物质）的生产，延缓果实成熟与衰老[14-15]。
2.4 超声波协同钙浸渍对樱桃番茄贮藏过程中酚酸结构特性的影响
以贮藏30 d 的樱桃番茄进行HPLC-MS 分析，根据樱桃番茄负离子模式下主要化合物的质谱数据，结合文献对照，已鉴别的化合物的质荷比（m/z）以及保留时间结果见图5，酚酸保留时间及质谱特征见表1[16-18]。
图5 樱桃番茄酚酸质谱图
Fig.5 The mass spectrum of phenolic acids of cherry tomato
表1 樱桃番茄酚酸保留时间及质谱特征
Table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics
样品 编号 间/min 质荷比（m/z） 化合物 相对分子质量新鲜样品保留时1 7.4 515.10[M－H]- 异绿原酸B 516 2 7.9 178.77[M－H]- 咖啡酸 180 3 9.3 343.05[M－H]- 5-没食子酸奎宁酸 344 4 10.4 353.04[M－H]- 绿原酸 354 5 10.8 353.04[M－H]- 隐绿原酸 354 6 19.4 609.11[M－H]- 芦丁 610 7 30.4 515.08[M－H]- 异绿原酸A 516 8 32.2 515.12[M－H]- 异绿原酸C 516 CK组1 7.3 178.80[M－H]- 咖啡酸 180 2 9.3 192.78[M－H]- 阿魏酸 194 3 9.9 353.05[M－H]- 绿原酸 354 4 10.4 353.06[M－H]- 隐绿原酸 354 5 19.2 609.11[M－H]- 芦丁 610 6 30.1 515.09[M－H]- 异绿原酸A 516 U 组 1 9.6 192.79[M－H]- 阿魏酸 194 2 10.7 353.04[M－H]- 绿原酸 354 3 19.1 609.13[M－H]- 芦丁 610 4 30.1 515.15[M－H]- 异绿原酸A 516 5 30.5 515.09[M－H]- 异绿原酸C 516
续表1 樱桃番茄酚酸保留时间及质谱特征
Continue table 1 Cherry tomato phenolic acids retention time and mass spectrum characteristics
样品 编号保留时间/min 质荷比（m/z） 化合物 相对分子质量Ca组1 9.1 162.66/353.03[M－H]-对香豆酸/绿原酸 164/354 2 9.6 304.8[M－H]- 表没食子酸儿茶素 306 3 18.8 609.12[M－H]- 芦丁 610 4 30.4 515.12[M－H]- 异绿原酸A 516 U+Ca组1 8.0 178.77[M－H]- 咖啡酸 180 2 9.7 192.79[M－H]- 阿魏酸 194 3 10.5 353.06[M－H]- 绿原酸 354 4 19.4 609.11[M－H]- 芦丁 610 5 30.2 515.15 异绿原酸A 516 6 30.6 515.08[M－H]- 异绿原酸C 516
新鲜樱桃番茄中共鉴别出8 种化合物，分别为5-没食子酸奎宁酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C，但仍有大量化合物未鉴别出。其中，绿原酸、隐绿原酸为同分异构体，异绿原酸A、异绿原酸B 和异绿原酸C 为同分异构体。樱桃番茄中出现隐绿原酸是由于绿原酸类成分结构母核相同，在一定条件下可以通过分子内酯基迁移发生异构化[16]。贮藏第30 天，CK 组樱桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异绿原酸A；U 组樱桃番茄主要酚酸是阿魏酸、绿原酸、芦丁、异绿原酸A 和异绿原酸C；Ca 组樱桃番茄主要酚酸是对香豆酸/绿原酸、表没食子酸儿茶素、芦丁和异绿原酸A；U+Ca 组樱桃番茄主要酚酸是咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、芦丁、异绿原酸A 和异绿原酸C。现有结果发现，隐绿原酸存在于CK 组樱桃番茄中，可能是由于贮藏第30 天CK 组果实的pH 值更接近中性，使得绿原酸更易转化为隐绿原酸[17-18]。结果表明，超声协同钙浸渍能够有效抑制贮藏期间樱桃番茄主要酚酸的消耗，维持酚类物质结构特性。
3 结论
与对照组相比，超声协同钙浸渍处理有效延缓了樱桃番茄贮藏过程中总酚含量下降。此外，贮藏末期PPO、POD、PAL 活性[338.33 ΔOD420 nm/（min·g）、180.00 ΔOD470 nm/（min·g）和252.40 ΔOD290 nm/（h·g）]显著低于CK 组[379.00 ΔOD420nm/（min·g）、207.73 ΔOD470nm/（min·g）和303.87 ΔOD290 nm/（h·g）]，表明超声协同钙浸渍技术显著抑制贮藏过程中PPO、POD 和PAL 酶活性。质谱结果表明，超声协同钙浸渍处理有效延缓樱桃番茄酚酸消耗，维持樱桃番茄酚类物质的结构特性与抗氧化活性。试验结果表明，超声协同钙浸渍处理有效抑制樱桃番茄贮藏期间多酚氧化酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性，维持较高抗氧化活性和酚类物质含量，延缓果实衰老。
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