酸乳用乳酸菌抗生素耐药性研究

乳酸菌是一类发酵产物为乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，是人和动物体内具有特殊生理功能的有益菌群，具有调节人体免疫、抑制有害菌增殖、调节肠道菌群平衡、促进营养物质吸收等功能[1]。德氏乳菌保加利亚亚种又称为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus，L.bulgaricus），具有抗癌抗肿瘤、提高机体免疫力、促进胃肠道蠕动等益生功能[2]。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，S.thermophilus）在酸奶发酵前期产酸、产多糖等方面发挥着重要作用，产酸能力强的嗜热链球菌有助于酸奶产品快速发酵凝乳、缩短发酵时间、提高生产效率、降低酸奶生产成本[3-5]。乳酸菌和食品生产密切相关，长期以来，乳酸菌作为益生菌被广泛应用于食品尤其是乳制品行业中，其中嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种是目前制作酸乳最主要的菌种[6-7]。

乳酸菌的食用历史长达数千年，是世界公认的“一般公认安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物[7]。在现代医学中，抗生素是防御细菌感染的主要手段。但近年来，由于抗生素的不正当使用（过度使用和误用），许多乳酸菌产生了耐药性，乳酸菌应用所带来的安全性问题已经引起人们的关注[8-9]。研究表明耐药性的传播主要发生在临床相关的菌株中，但已有体内试验证明，在肠道益生菌之间、肠道益生菌与致病菌之间也存在耐药基因转移现象[10]。部分乳酸菌对临床常用药物产生耐药性，还可能将其携带的耐药基因通过食物链传递给其它肠道及呼吸道致病菌，并赋予其耐药性[11]。四环素类、磺胺类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类等抗生素由于其价格低廉，且有广谱性和低毒性等特点[12]，被广泛应用于畜牧及水产养殖行业，但由于其本身的副作用，在动物组织中的残留，就可能给人类带来很大的危害 [13-14]。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）确定抗生素耐药性已经成为21世纪主要的健康性问题之一 [15]。早期对细菌耐药性的研究主要集中在病原微生物上[16-17]，而近年来乳酸菌耐药性的研究逐步成为人们关注的焦点。

目前，我国酸乳发酵剂90%以上来自于国外生产，并且这些酸乳发酵剂并未提供相关的耐药性情况[18-20]。因此，研究乳酸菌抗生素耐药性并评估其安全性对食品安全具有重要意义，本研究将酸乳发酵剂中的乳酸菌进行分离鉴定，并对分离菌株进行抗生素耐药性的研究，以期为酸乳发酵剂中乳酸菌的安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

48份酸乳发酵剂样品：市售；Premix TaqTM、溶菌酶（≥20 000 U/mg）、细菌基因组DNA提取试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖：北京索莱宝科技有限公司。

12 种抗生素药敏试纸[青霉素（penicillin，P）、头孢唑啉（cefazolin Sodium，CS）、头孢唑啉先锋（cephazolin，KZ）、氯霉素（chloramphenicol，C）、万古霉素（vancomycin，VA）、四环素（tetracycline T）、复方新诺明（sulfamethoxazole，CO SMZ）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、克拉霉素（clarithromycin，CLA）、链霉素（streptomycin，SM）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、利福平（rifampicin，RD）]：杭州天和微生物试剂有限公司，剂量符合美国临床实验室标准化研究所（Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI/NCCLS）2017 版的规定。

1.2 仪器与设备

5804R高速冷冻离心机：德国EPPEENDORF公司；Olympus CX41荧光显微镜：日本Olympus公司；SPX-150FS-Ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；Infinity 3026凝胶成像系统：法国Vilber Lourmat公司；Millipore Direct 8超纯水仪：美国Milliport公司；HE-120水平电泳槽：上海天能仪器设备有限公司；JF-SX-500全自动灭菌锅：日本TOMY公司；ZHJH-C1209B超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；VERITI96聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：美国 ABI公司。.

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离与纯化

将发酵剂样品置于无菌超净工作台中，挑取适量样品，分别接种于MRS液体培养基和M17液体培养基中扩培24 h，在MRS和M17固体培养基上进行平板划线，培养48 h后，观察菌落特征，挑取单菌活化，二次划线，挑取单菌落，直至菌落形态均一致。进行革兰氏染色，观察菌体的形态。在MRS和M17液体培养基（含70%甘油）中于-80℃冰箱中保存。

1.3.2 乳酸菌基因组DNA的提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明方法操作提取分离菌株的基因组。

1.3.3 扩增乳酸菌16S rDNA基因序列

扩增的反应体系（50.00 μL）：10 × buffer 5.00 μL、Mg2+3.00 μL、2.50 mol/L 脱氧核糖核苷三磷酸 4.00 μL、10.00 pmol引物 P1 和 P2 各 1.50 μL、Taq 酶 1.50 μL、模板 DNA 5.00 μL，以双蒸水补至 50.00 μL。

PCR循环参数为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，循环35次；72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR产物检测与测序

取PCR产物5.00 μL，用1.00%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：120V，30min。电泳结束后用溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色15min，凝胶成像仪拍照观察，在1 500 bp处有清晰条带的样品送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序结果提交到BLAST进行在线比对得出结果。

1.3.5 抗生素耐药性敏感试验

表1为抗生素耐药性的判断标准。

利用纸片扩散法对分离的乳酸菌进行青霉素、头孢唑啉、头孢唑啉（先锋）、氯霉素、万古霉素、四环素、复方新诺明、氨苄西林、克拉霉素、链霉素、环丙沙星和利福平12种抗生素的耐药性敏感试验。将待测菌株活化二代，将菌液8 000 r/min，4℃，离心5 min，并以无菌水调整菌液浓度至OD600=0.5，取菌液200 μL涂布，待培养基上的菌液略干后，以无菌操作取出药敏纸片，贴于接好同种乳酸菌诱导的LB固体平板内，各纸片中心相距大于24 mm，纸片距平板内缘大于15 mm，每皿贴3个纸片，每菌株重复试验3次，同时设空白药敏纸片为对照。室温（25℃）放置0.5 h，然后置于37℃/43℃培养，24 h后测量并记录抑菌圈直径。根据美国临床和实验室标准化研究所制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》（2017年版）评价试验乳酸菌对抗生素的耐药性。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定结果

图1为部分乳酸菌16S rDNA区域的PCR扩增产物电泳图。

从48份酸乳发酵剂中共分离出202株乳酸菌，将其16S rDNA扩增产物进行电泳检测，电泳条带约在1 500 bp处，扩增条带清晰，无明显的拖尾、弥散现象，说明16S rDNA扩增成功。

表2为乳酸菌的16S rDNA基因序列同源性比对结果。

将测序拼接完成的16S rDNA基因序列使用NCBI数据库中的BLAST程序进行同源性比对。结果表明：202株单菌株测序准确度均大于99%，排除139株重复菌株，剩余63株乳酸菌，其中43株为嗜热链球菌，20株为德氏乳杆菌保加利亚亚种。

2.2 嗜热链球菌抗生素耐药性比较

表3为不同嗜热链球菌抗生素耐药性结果。

不同抗生素对不同来源的嗜热链球菌的影响不同，43株嗜热链球菌普遍对头孢唑啉、头孢唑啉先锋、氯霉素、万古霉素敏感，其中有17株菌株对12种抗生素均无耐药性。有5株菌株对12种抗生素均敏感。43株嗜热链球菌对青霉素、氨苄西林、四环素，链霉素耐药性较高，其中菌株HST-2和菌株HST-5-1对6种抗生素敏感。

2.3 德氏乳杆菌保加利亚亚种抗生素耐药性比较

表4为不同德氏乳杆菌保加利亚亚种的抗生素耐药性结果。

德氏乳杆菌保加利亚亚种对12种抗生素的耐药性要高于嗜热链球菌，20株德氏乳杆菌保加利亚亚种对头孢唑啉、头孢唑啉先锋、氯霉素、克拉霉素和利福平普遍敏感，对青霉素、复方新诺明、链霉素和环丙沙星耐药性较高，其中菌株HDB-7对8种抗生素耐药。研究表明德氏乳杆菌保加利亚亚种对大多数核酸抑制剂，如环丙沙星、利福平、复方新诺明等以及氨基糖苷类抗生素，如链霉素、万古霉素等通常具有耐药性[21]，对糖肽类抗生素万古霉素为固有耐药性[22]。但也有研究者认为这并不代表是物种的固有特性，可能存在可变性[23]。20株德氏乳杆菌保加利亚亚种对万古霉素普遍敏感，此结果也充分证明了德氏乳杆菌保加利亚亚亚种对万古霉素并非是固有耐药性。于涛等[24]从25份酸奶样品中分离得到56株乳酸菌对其耐药性进行研究，结果显示，这些菌株对链霉素、环丙沙星和四环素耐药率较高，且在相同药物，相同浓度，相同代次的情况下，嗜热链球菌对3种抗生素的耐药性明显低于保加利亚乳杆菌；同时周宁等[25]也发现嗜热链球菌对3种抗生素的敏感性明显高于德氏乳杆菌保加利亚亚种，其形成原因还有待进一步研究。

2.4 乳酸菌对不同抗生素的耐药率

表5为乳酸菌对不同抗生素的耐药率结果。

63株乳酸菌对青霉素（36.51%）、复方新诺明（33.33%）、链霉素（28.57%）、氨苄西林（26.98%）、环丙沙星（20.63%）表现出不同程度的耐药率，而对其它抗生素耐药率则比较低。其中43株嗜热链球菌对青霉素耐药率最高，达到了30.23%，其次为氨苄西林（25.58%）、四环素（20.93%），链霉素（18.60%），利福平（16.28%）和复方新诺明（13.95%），对其它抗生素耐药率则相对低；20株德氏乳杆菌保加利亚亚种对复方新诺明耐药率最高，达到了75%，其次为环丙沙星、青霉素、链霉素、氨苄西林及万古霉素分别为60%、50%、50%、30%和30%，对克拉霉素和利福平表现为敏感或中介耐药，对其它抗生素耐药率则比较低。所测菌株对抗生素的耐药情况为青霉素>复方新诺明>链霉素>氨苄西林>环丙沙星>四环素>利福平>万古霉素>头孢唑啉>头孢唑啉先锋>氯霉素>克拉霉素。

2.5 不同乳酸菌的多重耐药率

表6为不同乳酸菌的多重耐药率的结果。

63株乳酸菌中有33株存在多重耐药性，多重耐药性为52.38%，其中嗜热链球菌对12种抗生素的耐药性低于德氏乳杆菌保加利亚亚种，嗜热链球菌30.23%的菌株具有多重耐药性，而德氏乳杆菌保加利亚亚种的具有多重耐药性菌株达到了100%；有23种菌株对3种抗生素耐药，有14株菌株对4种抗生素耐药，有7株菌株对超过5种抗生素耐药。本次试验结果与之前相关学者报道较一致[10，26]。受试菌严重的多重耐药性可能是由于其本身所固有的特性，也可能是因为在生产加工过程中菌株发生变异造成的[25，27]。

3 结论

本研究采用分离自酸乳发酵剂的63株乳酸菌作为供试菌株，测试它们对12种临床常用抗生素的耐药性，结果表明：酸乳发酵剂中的乳酸菌存在一定的耐药性问题，63株乳酸菌对青霉素、复方新诺明、氨苄西林、链霉素、和环丙沙星耐药性较高，对头孢唑啉、氯霉素、万古霉素、四环素等均呈现不同程度的耐药性，63株乳酸菌中嗜热链球菌对12种抗生素的耐药性显著低于德氏乳杆菌保加利亚亚种。因此，应当制定和完善乳酸菌抗生素耐药性的相关检测标准，加强对原料乳中抗生素残留的检测及乳酸菌耐药基因检测；同时在乳酸菌被应用于食品和奶制品生产时，应首先避免选用具有耐药性的菌株，以减少发酵乳制品中抗生素残留及乳酸菌耐药问题的出现，避免乳酸菌在实际生产中带来安全隐患。

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