中国主流的饮用性凉茶是由鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶共7种植物药物煎制而成。近年来，随着凉茶产业的快速发展，凉茶渣的排放在逐年增加，日产量达到680 t[1]。目前国内对凉茶渣的资源化利用研究比较缺乏，仅在直接作为饲料添加剂或生物质能源方面有少量的报道[1-2]，大量的凉茶渣依然采用直接堆放、填埋或焚烧等方式处理，造成了严重的资源浪费和环境污染。
植物细胞壁主要由纤维素、木聚糖和果胶组成，共同保护细胞免受伤害，同时也阻碍了动物对营养的消化利用。纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶可以将对应的大分子底物降解成单糖或寡糖，消除抗营养因子，促进细胞内营养和活性物质的释放[3]，为动物提供易于消化吸收的糖类化合物[4]，因此，纤维素酶[5-6]、果胶酶[7-9]和木聚糖酶[10-12]在食品、饲料等工业中具有广泛的应用。由于木聚糖酶和果胶酶的存在能够更好地促进纤维素酶降解底物[13]，因此，发酵产物中不进行分离的纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力的高低也代表了菌株转化利用植物细胞的能力[4]。黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见的无毒性曲霉属真菌[14]，发酵后能够产生多种生物酶[15-17]。因此，探索以黑曲霉为菌种发酵凉茶渣生产纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶等生物酶的廉价工艺，具有一定的经济价值和社会意义。内切葡聚糖酶是纤维素酶的重要组成之一，本文拟通过单因素试验和正交试验，研究利用黑曲霉发酵凉茶渣生产内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的最佳工艺，为凉茶渣的资源化利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑曲霉GIM3.562：广东省微生物菌种保藏中心；凉茶渣：清远加多宝草本植物科技有限公司。
3，5-二硝基水杨酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：Ruibio公司；羧甲基纤维素钠（分析纯）：Aladdin公司；果胶、D-木糖（优级纯）：华迈科公司；D-一水半乳糖醛酸（分析纯）：Fluka公司；木聚糖（分析纯）：Sigma公司；其余试剂均分析纯：国药集团化学试剂有限公司。
5804R高速冷冻离心机：Eppendorf公司；XS205DU电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）公司；LDZX-50KB立式高压灭菌器：上海申安医疗器械厂；BHC-1300IIA2生物安全柜、Elx50酶标仪：BioTek Instruments公司；BME生物显微镜：上海莱卡公司。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g去皮，切成块，煮沸30 min，纱布过滤，加入葡萄糖20 g，琼脂20 g，补水至1 000 mL，然后121℃湿热灭菌20 min。
固态凉茶渣培养基：将新鲜凉茶渣晒干粉碎，取粉末2 g，加入硫酸铵0.08 g，葡萄糖0.04 g，磷酸二氢钾0.01 g，磷酸氢二钾0.008 g，水8 g，121℃湿热灭菌20 min，灭菌后 pH 值为 5.03±0.01。
1.3 方法
在80%湿度，30℃的恒温恒湿培养箱中，利用PDA平板培养基将黑曲霉培养120 h，连续传代两次。制备黑曲霉孢子悬液，利用血球板计数法，调节孢子浓度为2×109CFU/mL，将菌种按照10%接种量接种至固态凉茶渣培养基中，然后按照各部分设定的试验条件进行培养。
1.3.1 单因素试验
分别考察氮源种类（尿素、氯化铵、硫酸铵、豆粕和无补充氮源）、碳源种类（葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和无补充碳源）、含水量（65%～85%）、发酵时间（48h～144h）、浸泡液 pH 值（5.00～9.00）、温度（28℃～37℃和室温25℃）共6个因素对内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的活力影响。在单因素试验、正交试验以及验证试验中除特别说明外，培养基成分不变，硫酸铵含量、葡萄糖含量、含水量以及接种量均按凉茶渣的干重计算。
1.3.2 正交试验
在单因素试验的基础上，将内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶的酶活力权重均设定为1，以3种酶的活力总和作为考察指标，对含水量A、浸泡液pH值B、发酵温度C、发酵时间D共4个因素进行三水平正交试验优化，各因素水平见表1。
表1 凉茶渣固态发酵正交试验因素水平
Table 1 Factor levels of orthogonal experiment for solid state fermentation of herbal tea residue
水平 A含水量/% B浸泡液pH值 C温度/℃ D发酵时间/h 1 60 7.00 31 72 2 70 8.00 34 120 3 80 9.00 37 168
1.3.3 酶活力测定
发酵结束后，向三角瓶中加入15 mL生理盐水，振荡后过夜；经过5 000 r/min离心10 min，采用DNS显色法检测上清液中内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶活力[4，18]；沉淀烘干后即为发酵样品干重。
1.3.3.1 酶活力测定方法
取底物溶液0.4 mL，发酵上清液0.1 mL，混匀后，40℃水浴进行酶促反应10 min；然后加入DNS 0.5 mL，再次混匀后，沸水浴10 min，以蒸馏水代替底物溶液为对照，测定特定波长吸光度，计算酶活力。
用0.2 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 5.0），配制6.25 mg/mL羧甲基纤维素钠溶液为底物，用终浓度0、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖制定标准曲线，测定530 nm的吸光度，计算内切葡聚糖酶活力[13]；用0.2 mol/L的磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲溶液（pH 5.0），配制0.5%的果胶溶液为底物，用终浓度0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL 的 D-半乳糖醛酸制定标准曲线，测定540 nm的吸光度，计算果胶酶活力[19]；用与配制果胶溶液相同的方法，配制0.5%的木聚糖溶液为底物，用终浓度 0、100、200、300、400、500、600 μg/mL的D-木糖制定标准曲线，测定550 nm的吸光度，计算木聚糖酶活力[20]。
1.3.3.2 酶活力计算
规定：某种酶在40℃时，每分钟产生1 μmol产物的酶量为1个酶活力单位（U）。
酶活力计算公式如下。
式中：C0根据标准曲线，查得的酶促反应前还原糖浓度，μmol/mL；C1酶促反应后还原糖浓度，μmol/mL；V1参与反应的酶溶液体积，mL；V2酶溶液总体积，mL，包括发酵前培养基含水量，加入菌种以及调节pH值引入的水分，和发酵后加入的生理盐水；t酶促反应时间，min；m 发酵样品干重，g。
1.4 数据处理
采用SPSS 21软件对单因素试验中的同一种酶活力进行方差分析。以P＜0.05作为差异显著标准；以P＜0.01作为差异极显著标准。所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 氮源种类对酶活力的影响
以2%葡萄糖为碳源，含水量为80%，分别向凉茶渣培养基中添加4%尿素、氯化铵、硫酸铵、豆粕和无补充氮源，31℃发酵72 h，考察氮源种类对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响见图1。
图1 氮源种类对酶活力的影响
Fig.1 Effects of nitrogen sources on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
从图1可以看出，内切葡聚糖酶活力按照无补充氮源、豆粕、氯化铵（或尿素）、硫酸铵的顺序极显著增加（P＜0.01），其中氯化铵和尿素对应的内切葡聚糖酶活力无显著差异（P>0.05）；硫酸铵对应的果胶酶活力极显著高于尿素、氯化铵、豆粕和无补充氮源对应的果胶酶活力（P＜0.01），其中尿素、氯化铵、豆粕对应的果胶酶活力无显著差异（P>0.05），但是尿素对应的果胶酶活力显著高于无补充氮源对应的果胶酶活力（P＜0.05）；硫酸铵对应的木聚糖酶活力极显著高于尿素和氯化铵的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中尿素和氯化铵的木聚糖酶活力无显著差异（P>0.05），但是极显著高于豆粕和无补充氮源对应的酶活力（P＜0.01）。因此4%硫酸铵是黑曲霉发酵凉茶渣的适宜氮源。
2.1.2 碳源种类对酶活力的影响
以4%硫酸铵为氮源，含水量为80%，向凉茶渣培养基中分别添加2%的葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和无补充碳源，31℃发酵72 h，考察碳源种类对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响，结果见图2。
图2 碳源种类对酶活力的影响
Fig.2 Effects of carbon source on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
从图2可以看出，葡萄糖、蔗糖和糖蜜对应的内切葡聚糖酶活力无显著差异（P>0.05），但是均极显著高于α-乳糖和无补充碳源对应的内切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜对应的果胶酶活力极显著高于α-乳糖和无补充碳源对应的果胶酶活力（P＜0.01），其中蔗糖和葡萄糖对应的果胶酶活力无显著差异（P>0.05），但是蔗糖对应的果胶酶活力显著高于糖蜜对应的果胶酶活力（P＜0.05）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜对应的木聚糖酶活力无显著差异（P>0.05），但是均极显著高于无补充碳源对应的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中葡萄糖和蔗糖对应的木聚糖酶活力显著高于α-乳糖对应的木聚糖酶活力（P＜0.05）。α-乳糖对应的内切葡聚糖酶和果胶酶活力显著低于无补充碳源的酶活力（P＜0.05），而且对应的木聚糖酶活力与无补充碳源的酶活力无显著差异（P>0.05）。综上所述，2%葡萄糖是黑曲霉发酵凉茶渣的较优碳源。
2.1.3 含水量对酶活力的影响
基质的含水量影响着胞外酶的分泌和转移，影响菌体生长。一般来说真菌发酵时需要相对更低的含水量，如利用黑曲霉对三七渣进行固态发酵生产蛋白饲料时，含水量为60%[21]；利用黑曲霉和产朊假丝酵母发酵三七渣生产蛋白饲料时，含水量可以低至50%[22]。在本试验中，向凉茶渣培养基补充4%硫酸铵，2%葡萄糖，31℃发酵72 h，考察65%～85%含水量范围对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响，结果见图3。
由图3可知，65%和70%含水量对应的内切葡聚糖酶活力无显著差异（P>0.05），75%、80%和85%含水量对应的内切葡聚糖酶活力无显著差异（P>0.05），但是65%和70%含水量对应的内切葡聚糖酶活力显著高于75%、80%和85%含水量对应的内切葡聚糖酶活力（P＜0.05），极显著高于85%含水量对应的内切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；65%、70%和 75%含水量对应的果胶酶活力无显著差异（P>0.05），但是极显著高于85%含水量对应的果胶酶活力（P＜0.01），其中70%含水量对应的果胶酶活力最高，且显著高于80%含水量对应的果胶酶活力（P＜0.05）；含水量对木聚糖酶活力没有显著影响（P>0.05）。因此，黑曲霉发酵凉茶渣的适宜含水量是70%。
图3 含水量对酶活力的影响
Fig.3 Effects of moisture content on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
2.1.4 发酵时间对酶活力的影响
如果发酵时间过短，发酵不完全；发酵时间过长，菌种老化，产生有害的次级代谢产物，甚至造成菌体自溶[23]。向凉茶渣培养基补充4%硫酸铵，2%葡萄糖，温度为31℃，含水量为80%，考察时间从48 h延长到144 h，对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响，结果见图4。
由图4可知，内切葡聚糖酶活力随着时间延长先增加后降低，其中120 h对应的内切葡聚糖酶活力最高，且显著高于48 h对应的内切葡聚糖酶活力（P＜0.05）；72 h 后果胶酶活力变化不显著（P>0.05），但是144 h对应的果胶酶活力显著高于48 h对应的果胶酶活力（P＜0.05）；96 h后木聚糖活力变化不显著（P>0.05），但是均极显著高于48 h和72 h对应的木聚糖酶活力（P＜0.01）。综合分析，黑曲霉发酵凉茶渣适宜时间是120 h。
图4 时间对酶活力的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
2.1.5 浸泡液pH值对酶活力的影响
向凉茶渣培养基中补充4%硫酸铵，2%葡萄糖，含水量为80%，31℃发酵72 h，考察浸泡液pH值对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响，结果见图5。
图5 浸泡液pH值对酶活力的影响
Fig.5 Effects of pH of soaking solution on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
由图5可知，发现浸泡液pH值从5.00变化到8.00时，内切葡聚糖酶活力无显著变化（P>0.05），当浸泡液pH值为9.00（培养基pH值实测值约7.24）时，则显著降低（P＜0.05）。随着pH值从5.00变化到9.00时，果胶酶活力呈现“V”型变化，在pH值为7.00时最低。木聚糖酶活力随pH值变化不大，但是pH值为8.00的酶活力显著高于pH值为7.00时的酶活力（P＜0.05）。因此，黑曲霉发酵凉茶渣的较适宜pH值为8.0。
2.1.6 温度对酶活力的影响
向凉茶渣培养基中补充4%硫酸铵，2%葡萄糖，含水量为 80%，发酵 72 h，考察 28、31、34、37℃以及室温25℃对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响见图6。
图6可以看出，34℃内切葡聚糖酶活力极显著高于25℃和37℃内切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；31℃果胶酶活力极显著高于25、28℃和37℃果胶酶活力（P＜0.01），显著高于 34 ℃果胶酶活力（P＜0.05），而 34℃果胶酶活力显著高于25、28℃和37℃果胶酶活力（P＜0.05）；34℃木聚糖酶酶活力极显著高于25℃和37℃木聚糖酶活力（P＜0.01），显著高于28℃木聚糖酶活力（P＜0.05）。因此，34℃是黑曲霉发酵凉茶渣产酶的较适宜温度。
图6 温度对酶活力的影响
Fig.6 Effects of temperature on enzyme activity
同一种酶上标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）；上标不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；上标相同字母表示差异不显著（P>0.05）。
2.2 正交试验
单因素试验发现，发酵时间越长，含水量越低，酶活力越高，因此在正交试验中将发酵时间延长至168h，含水量降低至60%，以探索更宽的时间和含水量范围对内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶活力的影响。向凉茶渣培养基中补充4%硫酸铵和2%葡萄糖，对含水量（A）、浸泡液pH（B）、温度（C）以及发酵时间（D）4个因素进行3个水平正交试验，结果见表2。
含水量（A）、浸泡液 pH（B）、温度（C）以及发酵时间（D）对3种酶活力总和的极差（R）表现为：RD（10.28）>RC（9.21）>RB（4.74）>RA（2.65），因此，对3种酶活力总和的影响显著性顺序依次为发酵时间、发酵温度、浸泡液pH值和含水量。
由表2可知，在A因素中，K2>K3>K1；在B因素中，K3>K2>K1；在C因素中，K1>K2>K3；在D因素中，K3>K2>K1。因此，各因素水平对3种酶活力总和的影响强弱顺序是：A2>A3>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，D3>D2>D1，即，当含水量为 70%（第2水平），浸泡液pH值为9.00（第3水平），发酵温度为31℃（第1水平），时间为168 h（第3水平），对应的酶活力总和最高，因此该条件组合（A2B3C1D3）是3种酶的最佳生产工艺。
表2 凉茶渣固态发酵正交试验结果
Table 2 Orthogonal experiment result of herbal tea residue fermentation
注：酶活力总和是指每个样本内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶活力之和，结果以3个重复样本酶活力总和的平均值±标准差表示。
试验编号A含水量/%B浸泡液pH值C温度/℃D发酵时间/h内切葡聚糖酶/（U/g）木聚糖酶/（U/g）果胶酶/（U/g）酶活力总和/（U/g）1 60 7.00 31 72 3.31±0.83 31.31±1.23 18.69±0.59 53.31±1.46 2 60 8.00 37 120 4.89±0.28 30.99±0.98 16.70±0.67 52.59±0.06 3 60 9.00 34 168 4.97±0.40 35.66±1.45 21.47±0.39 62.10±1.51 4 70 7.00 37 168 5.72±1.33 32.91±3.49 18.40±0.90 57.03±5.13 5 70 8.00 34 72 4.51±0.42 31.43±2.33 14.62±0.27 50.56±2.90 6 70 9.00 31 120 5.84±0.31 41.37±0.64 21.15±0.11 68.37±0.81 7 80 7.00 34 120 5.06±0.66 37.38±5.29 14.79±1.78 56.64±7.76 8 80 8.00 31 168 5.40±0.47 42.96±1.18 17.95±0.36 66.31±1.95 9 80 9.00 37 72 4.95±0.39 32.32±2.47 13.45±1.18 50.73±1.84 K1 56.00 55.66 62.66 51.53 K2 58.65 56.49 56.43 59.20 K3 58.05 60.40 53.45 61.81 R 2.65 4.74 9.21 10.28
2.3 验证试验
以硫酸铵为氮源，葡萄糖为碳源，菌种浓度为2×109CFU/mL，当菌种接种量为10%时，经验证，含水量为70%，浸泡液pH值为9.00，发酵温度为31℃，发酵168 h，即最佳工艺条件（A2B3C1D3）下，内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶活力均较高，分别为（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，3 种酶活力总和为（77.96±1.08）U/g，与正交试验结论相符。
3 讨论与结论
黑曲霉发酵产酶是一个复杂的生物转化过程，菌株种类、基质成分、培养条件、培养方式等对酶活力都有重要影响。经过紫外诱变的黑曲霉NW1在察氏培养基中发酵84 h，纤维素酶活力达到1.52 U/mL[24]，比未诱变的菌株提高了1.58倍。黑曲霉CICC40616发酵含有豆粕和木聚糖的培养基，经优化后木聚糖酶活力为82.43 U/mL[25]；黑曲霉WS003发酵豆粕和麸皮混合培养基，果胶酶活力达到81.06 U/mL[26]。
在检测酶活力时，不同的对照设置方法会造成酶活力有较大差异。由于物料渣或其它培养基在发酵过程中产生了大量的还原糖，同时培养基自身含有一定的还原糖，因此，在利用3，5-二硝基水杨酸显色法检测发酵液的酶活力时，如果利用蒸馏水代替发酵液作为对照，必然会使发酵液中原有的大量还原糖都被计为酶促反应而产生的，造成酶活力偏高。对于本试验，凉茶渣发酵液中还原糖浓度是内切葡聚糖酶产生的葡萄糖浓度的5倍以上，也是果胶酶反应产生的还原糖浓度，或木聚糖酶反应产生的还原糖浓度的50%甚至数倍。解决这个问题的办法就是以蒸馏水代替底物溶液作为对照，或者以灭活的酶液作为对照[26-27]，这样仅仅引入较小的干扰。
本文以黑曲霉GIM3.562为菌种对凉茶渣进行发酵，通过对较多单因素进行试验考察，为凉茶渣发酵生产内切葡聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶提供比较丰富的数据支撑；通过正交试验优化，发现含水量为70%，浸泡液pH值为9.00，发酵温度为31℃，发酵168 h，是产内切葡聚糖酶、木聚糖酶和果胶酶的最佳工艺，该工艺条件下，3种酶活力均较高，分别为（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，总和为（77.96±1.08）U/g。本研究为凉茶渣的资源化利用提供了参考。
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