红枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物枣树（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果实，在我国有着悠久的种植历史。红枣中含有多糖、多酚、皂苷、色素、超氧化物歧化酶和各种维生素等活性成分，其中红枣多糖是红枣中最重要的活性成分之一[1]。大量研究已经证实红枣多糖具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和促进淋巴细胞增殖等功效[2]。红枣中多糖提取是红枣产业中最关键的环节。因此，寻找绿色高效提取技术从红枣中提取多糖是当前研究的热点。
目前，红枣多糖提取主要采用传统的溶剂提取，但该方式存在耗时长、效率低和溶剂消耗量大等问题[3]，已经不能满足当前红枣产业快速发展的需求。超声辅助提取作为一种新型的物理提取技术，利用超声所产生的“机械效应”、“空化效应”和“热效应”，加速植物细胞壁的破裂，降低多糖由内向外的传递阻力，进而有效提高多糖得率[4]。植物细胞壁主要成分为纤维素、半纤维素和果胶，利用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶可以降解植物细胞壁，提高传质和扩散系数，从而提高多糖得率[5]。因此，利用超声辅助复合酶（纤维素酶 ∶果胶酶 ∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，质量比）提取（ultrasonic assisted complex enzyme extraction，UACEE）红枣多糖是一种新颖的提取技术，目前，利用UACEE红枣多糖的研究鲜见报道。除提取技术外，红枣多糖得率还取决于许多其它因素，如萃取温度、萃取时间、固液比、复合酶添加量和超声功率等参数。因此，优化红枣多糖的提取条件是提高红枣多糖得率的关键。响应面法（response surface methodology，RSM）是一种数学统计方法，常被应用于提取工艺优化，但RSM对试验点的选择有很高的要求，如果试验点选取不当，很难得到较为理想的优化结果[6]。遗传算法（genetic algorithms，GA）具有全局寻优的特点，能取得较好的预测和优化效果。将RSM与GA相结合，既能避免RSM的缺陷，又能充分发挥GA在全局优化中的优势。目前，采用RSM耦合GA法对红枣多糖的提取条件进行优化的研究鲜见报道。
鉴于此，本研究采用UACEE技术对红枣多糖进行提取，探究超声功率、提取温度、复合酶添加量、料液比和提取时间对红枣多糖得率的影响；通过RSM耦合GA优化其提取工艺，并对比研究不同提取方式对红枣多糖得率的影响，以期确定最佳的提取技术。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红枣：柳林县达滋食品有限责任公司；D-无水葡萄糖标准品（纯度>99.0%）：河北贞田食品添加剂有限公司；纤维素酶（2 000 U/g）、果胶酶（2 300 U/g）、木瓜蛋白酶（2 300 U/g）：上海金穗生物科技有限公司；苯酚：南京汇景石油化工有限公司；硫酸：杭州法玛化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
YM-1000CT超声波提取仪：上海豫明仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DK-98-IIA型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；TG18K-Ⅱ型高速离心机：上海赵迪生物科技有限公司；UV759紫外可见分光光度计：青岛聚创环保集团有限公司；FA1004分析天平：绍兴万力仪器有限公司；MSC-100恒温振荡器：上海利闻科学仪器有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机：江苏天翎仪器有限公司；MCT200烘干机：上海争巧科学仪器有限公司；JJ-2植物粉碎机：常州市万丰仪器制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
将新鲜的红枣用清水冲洗干净，然后用刀子剔除枣核并切成丝状，置于60℃干燥机中将其烘干，然后用植物粉碎机将其粉碎，过40目筛，将制得的红枣粉末密封避光保存备用。
1.3.2 UACEE红枣多糖
称取（10.00±0.05）g红枣粉末置于具塞三角瓶中，加入300 mL的蒸馏水，然后加入不同剂量的复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，质量比），用玻璃棒搅拌使其充分混合，将其置于超声提取设备中，通过仪器控制面板，设置超声时间、超声温度，待提取结束后，将提取物置于离心机中以7 000 r/min离心15 min，真空抽滤获得滤液，残渣重复上述操作，合并滤液，滤液在40℃旋转蒸发仪减压浓缩，取出浓缩液加入无水乙醇，置于4℃冰箱中过夜醇沉，将醇沉物离心，并置于真空冷冻干燥机中冻干，获得红枣粗多糖。
1.3.3 显色反应
将质量浓度为25 mg/L D-葡萄糖标准溶液和2 mL红枣多糖溶液进行充分混合，置于具塞管中，然后加入1 mL质量浓度为5%苯酚溶液及5 mL浓硫酸，置于40℃恒温水浴锅中反应30 min，待反应结束后，将其置于冰水浴中冷却，采用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，样品最大吸收波长为491 nm。
1.3.4 葡萄糖标准曲线的绘制及多糖得率的计算
将D-无水葡萄糖标准品分别配制成质量浓度为0、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L 的标准葡萄糖溶液，分别取2 mL置于具塞管中，进行显色反应，在491 nm处测定样品吸光度y，以样品吸光度y为纵坐标，葡萄糖标准品溶液质量浓度x为横坐标，利用Origin9.0软件进行线性拟合，绘制标准曲线，所得标准曲线方程为y=0.016 1x+0.107 1。
称取0.1 g红枣粗多糖，配制成一定浓度的多糖溶液，将其稀释一定的倍数，按照1.3.3进行显色反应，测定每个样品的吸光度，依据下列公式计算多糖得率。
式中：V为待测样品的体积，L；ρ为红枣多糖溶液的质量浓度，mg/L；W1为红枣粉末质量，g；W2为红枣粗多糖质量，g。
1.3.5 单因素试验
选择UACEE法作为红枣多糖的提取方法，操作同1.3.2。以10 g红枣粉末为提取对象，对超声功率、提取温度、复合酶添加量、料液比和提取时间5个因素进行单因素试验，讨论试验因素对样品多糖得率的影响。超声功率为 100、200、300*、400、500 W，提取温度为 30、35、40*、45、50℃，复合酶添加量为 0.2%、0.4%、0.6%*、0.8%、1.0%，料液比为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30*、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），提取时间为 10、20、30*、40、50 min（*代表当一个单因素在变化的时候其它单因素的取值）。每组试验重复3次，结果用平均值±标准差表示。
1.3.6 响应面法试验
在单因素试验的基础上，以超声功率（X1）、提取温度（X2）、复合酶添加量（X3）和料液比（X4）为自变量，以多糖得率（Y）为响应值。根据Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken试验设计原理设计组合试验，因素与水平设计如表1所示。
表1 试验设计因素与水平
Table 1 Experimental design factors and levels
水平因素X1超声功率/W X2提取温度/℃X3复合酶添加量/%X4料液比/（g/mL）-1 200 30 0.4 1∶20 0 300 35 0.6 1∶30 1 400 40 0.8 1∶40
1.3.7 遗传算法设计
依据单因素试验结果，选取超声功率（X1）、提取温度（X2）、复合酶添加量（X3）和料液比（X4）4 个因素为决策变量，即：
随机或设定产生1个初始试验点
作为输入向量，并设定
为第t次迭代时，求得的红枣多糖得率取极值时所对应的试验点X作为可行点，然后求
（t）的梯度，如式（4）所示。
如
满足式（5），表明迭代终止。
则最优解（输入向量）：
，对应的
为最优值，即为最佳的输出向量。此时红枣多糖得率的目标函数如式（6）所示。
红枣多糖得率目标函数
式中：f（x）为RSM模型得到的红枣多糖得率的目标函数；n为自变量个数；XiL和XiU分别为X的上限和下限。
遗传算法优化的约束条件：选择各因素水平的上下限，多糖得率最优的约束条件如式（7）所示。
1.4 不同提取方式对多糖得率的影响
1.4.1 回流法提取红枣多糖
称取10 g红枣粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸馏水，提取温度40℃，提取3次，每次提取2 h，其余操作同1.3.2，依据式（2）计算多糖得率。
1.4.2 超声辅助法提取红枣多糖
称取10 g红枣粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸馏水，密闭置于超声提取仪中，提取条件为：超声功率310 W，提取温度40℃和提取时间30 min，提取结束后，其余操作同1.3.2，依据式（2）计算多糖得率。
1.4.3 复合酶法提取红枣多糖
称取10 g红枣粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸馏水，提取条件：提取温度40℃、提取时间30 min、复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，质量比）添加量0.49%，提取结束后，其余操作同1.3.2，依据式（2）计算多糖得率。
1.4.4 超声辅助复合酶提取
称取10 g红枣粉末置于具塞三角瓶中，加入320 mL的蒸馏水，密闭置于超声提取仪中，提取条件为：超声功率310 W，提取温度40℃、提取时间30 min、复合酶（纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，质量比）添加量0.49%，提取结束后，其余操作同1.3.2，依据式（2）计算多糖得率。
1.5 数据处理
每组试验重复3次，结果用平均值±标准差表示；采用Statistix8.0软件对每组试验数据进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；采用SAS8.0软件分析结果的显著差异；采用Matlab2015b优化UACEE红枣多糖工艺参数；利用Origin9.0进行单因素绘图；Design-Expert 8.0.6设计组合试验。
2 结果与分析
2.1 不同提取方式对红枣多糖得率的影响
不同提取方式对红枣多糖得率的影响结果如图1所示。
图1 不同提取方式对红枣多糖得率的影响
Fig.1 Effect of different extraction methods on the yield of jujube polysaccharide
不同字母表示组间差异显著（P<0.05）。
由图1可知，超声辅助提取、复合酶提取和超声辅助复合酶提取法所得的红枣多糖得率均显著高于回流提取（P<0.05）。结果表明超声辅助和酶均具有强化提取多糖的效果。超声辅助提取和复合酶提取法所得的红枣多糖得率无显著差异（P>0.05）。超声辅助复合酶提取法所得的红枣多糖得率均显著高于回流提取、超声辅助提取和复合酶提取。因此，本试验采用超声辅助复合酶提取法提取红枣多糖。
2.2 单因素试验结果
单因素对红枣多糖得率的影响结果如图2所示。由图2A可知，当超声功率在100 W～300 W时，随着超声功率增加多糖得率呈显著增加的趋势（P<0.05），当超声功率为300 W时，多糖得率取得最大值（7.12±0.10）%。其原因是随着超声功率增加，超声所产生的“空化效应”破坏细胞壁，降低传质阻力，提高多糖的扩散系数和溶解速度，有利于多糖的提取[7]。当超声功率超过300 W，多糖得率随超声功率增加而呈显著降低的趋势（P<0.05）。其原因是较大的超声功率会增加杂质溶解度，并有可能破坏多糖结构，造成多糖得率降低[8]。该研究结果与Babamoradi等[9]研究超声辅助提取毛茛花多糖结果一致。综合考虑，本试验选择超声功率为200、300、400 W 3个水平进行后续试验。
图2 不同试验因素对红枣多糖得率的影响
Fig.2 Effect of different experimental factors on the yield of jujube polysaccharide
A.超声功率；B.提取温度；C.复合酶添加量；D.料液比；E.提取时间；不同字母表示组间差异显著（P<0.05）。
由图2B可知，当提取温度低于40℃时，多糖得率随提取温度升高呈现显著增加的趋势（P<0.05），在提取温度40℃时，多糖得率取得最大值（7.11±0.12）%。这是由于随温度升高，溶剂渗透速度增加，分子运动加快，使得多糖溶解度增加[10]；此外，升高的温度有利于复合酶发挥催化活性，破坏植物细胞壁，有利于多糖从细胞内溶出，增加多糖得率[11]。但当提取温度超过40℃，随提取温度升高多糖得率反而显著降低（P<0.05）。其原因一方面是高温影响多糖稳定性，易造成多糖糖链的降解。另一方面高温会使复合酶活性降低或失活，从而不利于多糖提取[12]。综合考虑，本试验选择提取温度为30、35、40℃3个水平进行后续试验。
由图2C可知，当复合酶添加量在0.2%～0.6%时，随复合酶添加量增加多糖得率呈显著增加的趋势（P<0.05），在复合酶添加量0.6%时，多糖得率取得最大值（6.97±0.11）%。这是由于随复合酶添加量增加，酶的催化活性增强，使得植物细胞壁发生不同程度的降解，多糖传质阻力显著降低，扩散系数增加，进而多糖得率增加[13]。当复合酶添加量超过0.6%时，多糖得率随复合酶添加量增加反而显著降低（P<0.05）。该研究结果与Yin等[14]采用酶辅助提取蘑菇多糖结果一致。综合考虑，复合酶添加量选择0.4%、0.6%和0.8%3个水平进行后续试验。
由图2D可知，随溶剂体积的增加多糖得率呈现先显著增加后显著降低的趋势（P<0.05），当料液比在1∶30（g/mL）时，多糖得率取得最大值（7.25±0.08）%。其原因是随溶剂增加，固液界面的浓度梯度增加，浓度梯度作为多糖由内向外的传质驱动力，驱动多糖扩散，使得多糖得率增加[15]。但如果溶剂过多，会造成大量杂质溶解；还增加后期分离纯化的成本[16]。综上考虑，料液比选择 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）3 个水平进行后续试验。
由图2E可知，当提取时间在10 min～30 min时，多糖得率随提取时间延长呈现显著增加的趋势（P<0.05）。其原因是在提取初期，超声“空化效应”促进多糖由内向外扩散，增加多糖得率[17]。但当提取时间超过30 min时，由于大多数多糖已经被溶出，故延长萃取时间多糖得率无显著变化（P>0.05）。综合考虑，本研究选择提取时间为30 min，后续不再进行优化。
2.3 响应曲面法试验结果
2.3.1 模型建立与显著性检验
通过响应面法优化UACEE红枣多糖的工艺，所得的试验方案和结果见表2。
表2 响应曲面法试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results of response surface methodology
编号 X1 X2 X3 X4多糖得率/%1 -1 -1 0 0 6.95 2 1 -1 0 0 7.03 3 -1 1 0 0 7.24 4 1 1 0 0 7.21 5 0 0 -1 -1 6.93 6 0 0 1 -1 7.16 7 0 0 -1 1 7.11 8 0 0 1 1 7.21 9 -1 0 0 -1 7.13 10 1 0 0 -1 6.89 11 -1 0 0 1 6.99 12 1 0 0 1 7.28 13 0 -1 -1 0 6.83 14 0 1 -1 0 7.38 15 0 -1 1 0 7.26 16 0 1 1 0 7.23 17 -1 0 -1 0 6.92 18 1 0 -1 0 7.06 19 -1 0 1 0 7.11 20 1 0 1 0 7.19 21 0 -1 0 -1 6.97 22 0 1 0 -1 7.16 23 0 -1 0 1 6.93 24 0 1 0 1 7.31 25 0 0 0 0 7.42 26 0 0 0 0 7.39 27 0 0 0 0 7.31 28 0 0 0 0 7.50 29 0 0 0 0 7.16
以多糖得率（Y）为响应值，对试验所得的数据进行多元回归拟合分析，得到红枣多糖得率对超声功率（X1）、提取温度（X2）、复合酶添加量（X3）和料液比（X4）的回归模型如式（8）所示。
对回归方程系数进行显著性检验，结果如表3所示。
表3 红枣多糖工艺优化回归模型系数的显著性检验
Table 3 Significance test of regression model coefficient of jujube polysaccharide process optimization
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 0.77 14 0.055 9.27 <0.000 1 X1 8.533×10-3 1 8.533×10-3 1.44 0.250 3 X2 0.20 1 0.20 34.18 <0.000 1 X3 0.072 1 0.072 12.15 0.003 6 X4 0.029 1 0.029 4.89 0.044 2 X22 0.16 1 0.16 26.72 0.000 1 X22 0.057 1 0.057 9.63 0.007 8 X32 0.075 1 0.075 12.65 0.003 2 X42 0.14 1 0.14 23.81 0.000 2 X1X2 3.025×10-3 1 3.025×10-3 0.51 0.486 9 X1X3 9.000×10-4 1 9.000×10-4 0.15 0.702 8 X1X4 0.070 1 0.070 11.84 0.004 0 X2X3 0.084 1 0.084 14.18 0.002 1 X2X4 9.025×10-3 1 9.025×10-3 1.52 0.237 8 X3X4 4.225×10-3 1 4.225×10-3 0.71 0.412 9残差 0.083 14 5.933×10-3失拟项 0.017 10 1.654×10-3 0.099 0.998 4误差 0.067 4 0.017总和 0.85 28
由表3可知，数学模型决定系数R2=0.902 8，F=9.27，P<0.000 1。结果表明通过RSM建立的数学模型极显著。该模型失拟项P=0.998 4>0.05，表明模型失拟项不显著。通过以上数据分析表明通过RSM所建立的数学模型对试验数据拟合充分，可靠性较好。
利用F值大小可以判断试验因素对响应值的影响程度，F值越大，说明该因素对响应值的影响越显著。由表 3 可知，F（X1）=1.44、F（X2）=34.18、F（X3）=12.15和F（X4）=4.89，即各试验因素对红枣多糖得率的影响顺序为提取温度（X2）>复合酶添加量（X3）>料液比（X4）>超声功率（X1），且提取温度和复合酶添加量与料液比和超声功率均对红枣多糖得率的影响达到极显著水平。
模型充分性检验图见图3。
图3 模型充分性检验图
Fig.3 Model adequacy test plot
A.真实值与预测值对比；B.正态概率；C.残差与运行对比；D.Cook′s距离。
由图3A可知，通过试验测定的多糖得率的真实值与RSM模型预测的多糖得率值基本一致，结果表明可以通过RSM模型来预测不同提取条件下多糖得率。由图3B可知，在本试验中所得的多糖得率试验值均遵循正态分布，且没有偏离方差。由图3C可知，所有试验点的学生化外残差范围均在±3范围内。此外，由图3D可知，模型中的Cook′s距离均在1.0范围之内。结果表明在试验条件下所得多糖得率没有异常值。综上进一步验证采用RSM模型预测不同提取条件下多糖得率是准确可靠的。在此基础上，进一步采用遗传算法优化UACEE红枣多糖是合理可行的。
2.3.2 交互项分析
利用等高线图形来判断因素交互作用对响应值的影响程度是否显著。当等高线图形为椭圆时，代表因素交互作用显著影响响应值变化[18]；当等高线图形为圆形时，代表因素交互作用对响应值变化无显著影响[19]。图4反应各试验因素交互作用对红枣多糖得率的影响。
图4 各试验因素交互作用的响应面和等高线图
Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors
由表 3 方差分析结果可知，X1X2、X1X3、X2X4 和X3X4的交互作用均对红枣多糖得率无显著影响（P>0.05），故在此不做分析。X1X4和X2X3的交互作用均能显著影响红枣多糖得率（P<0.05）。由图4可知，红枣多糖得率均随超声功率、提取温度、复合酶添加量及料液比增加呈现显著增加的趋势，交互作用结果与单因素试验结果一致，且多糖得率均在中心处存在极值点。图4的等高线均呈椭圆型，表明X1X4和X2X3的交互作用均显著影响红枣多糖得率。综上可知，对红枣多糖得率影响因素顺序为提取温度（X2）>复合酶添加量（X3）>料液比（X4）>超声功率（X1），该结果也与方差分析的结果一致。
2.3.3 红枣多糖提取工艺参数优化
利用Matlab R2018b软件中的遗传算法优化工具箱进行分析优化，迭代75次，红枣多糖得率取得最大值，此时超声功率（X1）、提取温度（X2）、复合酶添加量（X3）和料液比（X4）水平编码分别为 0.081、1、-0.282、0.199，即试验水平分别为308.1 W、40℃、0.487 2%和 1∶31.99（g/mL），在此条件下，所得红枣多糖得率理论值为7.45%。遗传算法M文件运行结果如图5所示。
图5 遗传算法优化结果
Fig.5 The results optimized by the genetic algorithm
2.3.4 验证试验
采用遗传算法优化红枣多糖得率工艺参数为：超声功率308.1W、提取温度40℃、复合酶添加量0.4872%和料液比1∶31.99（g/mL），所得红枣多糖得率的理论值为7.45%。为验证遗传算法的可靠性，结合实际情况，将上述工艺参数修正为：超声功率308 W、提取温度40℃、复合酶添加量0.49%和料液比1∶32（g/mL），按照上述因素水平进行3次重复试验，所得红枣多糖得率为（7.68±0.01）%，试验值和理论值的相对误差为3.09%。说明响应面耦合遗传算法可较好地模拟和预测红枣多糖得率，进一步证明利用该方法优化UACEE红枣多糖工艺参数是可行的。
3 结论
本研究通过响应面耦合遗传算法优化超声辅助复合酶提取红枣多糖工艺，得到最优工艺参数为：超声功率308 W、提取温度40℃、复合酶添加量0.49%、料液比1∶32（g/mL）和提取时间30 min，在此条件下，所得红枣多糖得率为（7.68±0.01）%。试验值和理论值的相对误差为3.09%。表明响应面耦合遗传算法可较好地模拟和预测红枣多糖得率，且优化工艺参数是可行的。研究结果为红枣多糖提取提供一种绿色高效的提取方法。
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