红花籽是红花（Carthamus tinctorius L.）的种子，经机械压榨或溶剂浸提制油后的副产品即为红花籽粕[1]。红花籽粕不仅价格低廉，而且具有很高的营养和药用价值[2-3]。红花榨油后的饼粕中粗蛋白的含量约为19%，去壳榨油后的饼粕中粗蛋白的含量约为36%，且粗蛋白消化率达到77%，其蛋白质中还有人体所需的18种氨基酸，且有30%左右的氨基酸为人体必需氨基酸，除此之外红花籽中还有多种微量成分，如木脂素、黄酮类、多酚、糖苷以及苯丙烯酞-5-羟色胺等[4-5]。
从植物中以酶解法制备的天然抗氧化肽已经得到广泛研究，这充分证明植物中优质蛋白具有制备抗氧化多肽的潜力[6-7]。与合成抗氧化剂相比，植物性抗氧化肽安全性高、抗氧化活性好，被广泛地应用于功能性食品和食品添加剂等[8-9]。孙立等采用酶法制备红花籽粕抗氧化肽，采用超滤、凝胶过滤层析对红花籽多肽的抗氧化活性进行研究，证实了红花籽粕制备抗氧化肽的可行性[10-11]。
目前大孔树脂广泛用于纯化天然产物中的活性物质[12]。程云辉等发现DA201-C大孔树脂能有效分离富集麦胚蛋白酶解物中含疏水性氨基酸的肽段，从而显著提高其体外抗氧化活性[13]。玫瑰多酚粗提液经AB-8树脂分离纯化后获得的纯化多酚均比原液有更好的DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力和羟基自由基清除能力[14]。
目前大多数红花籽粕被简单地加工成廉价饲料，而忽略其中优质蛋白的研究和开发利用。对红花籽粕的研究多集中于营养分析及蛋白提取方法、酶解工艺等。本文比较不同酶解产物抗氧化性后，研究大孔树脂分离工艺对多肽含量的影响，制备抗氧化肽，为提高红花籽粕附加值，寻求植物原料抗氧化肽提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
红花籽：市售；碱性蛋白酶 Alcalase（240 000 U/g）：丹麦诺维信；中性蛋白酶（60 000 U/g）：武汉市华顺生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；AB-8、X-5、D101、D301、HPD600、D315、D450大孔树脂（纯度99%）：天津市海光化工有限公司；三氯乙酸、三氯化铁、焦性没食子酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、邻菲啰啉（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司。
超声波清洗机（KQ-100E型）：昆山市超声仪器有限公司；高速冷冻离心机（GL-21M）：湘麓离心机仪器有限公司；恒温水浴锅（HH-2）：金坛市宏华仪器厂；冷冻真空干燥机（SCIENTZ-10N）：宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度计（752型）、可见分光光度计（722E型）：上海光谱仪器有限公司；自动部分收集器（BSZ-160）、恒流泵（HL-2）：上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 红花籽预处理
将红花籽经石油醚浸出法提油后收集沉淀并烘干至恒重，放入粉碎机再次粉碎，过50目筛，收集粉末即为红花籽粕[15]。
1.2.2 红花籽粕酶解工艺
取2.5 g红花籽粕于锥形瓶中，加入50 mL磷酸盐缓冲液，酶在酶解温度下保温10 min后，按照表1方式酶解。酶解产物置于离心管中用高速冷冻离心机4 ℃，10 000 r/min离心 20 min，取上清液备用[16-20]。红花籽粕酶解工艺见表1。
表1 红花籽粕酶解工艺
Table 1 The enzymatic hydrolysis process of safflower seed meal
酶种类 pH值 酶解时间/min酶解温度/℃酶加量/（U/g）碱性蛋白酶Alcalase 8.6 120 60 7 700木瓜蛋白酶 6.5 120 55 8 400中性蛋白酶 7.2 120 45 6 400木瓜蛋白酶（超声辅助） 6.5 120 55 8 400木瓜-中性蛋白酶（1∶1） 7.0 120 45 8 400
1.2.3 酶解产物抗氧化性测定
对上清液进行还原力、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的测定[21-23]，筛选出最适酶解工艺。
1.2.4 多肽含量测定
采用双缩脲法，在540 nm波长下测定吸光值，以吸光值为纵坐标（y），牛血清白蛋白浓度为横坐标（x），通过Excel绘制标准曲线，求得样品溶液的多肽含量（mg/mL）[24]。标准曲线回归方程为：y=0.123 6x+0.002 6，R2=0.998 2（>0.99），线性关系较好，通过吸光度可计算出样品多肽含量。
1.2.5 大孔树脂的筛选
1.2.5.1 吸附率的计算
选用 AB-8、X-5、D101、D301、HPD600、D315、D450 7种大孔树脂，取不同种类的大孔树脂2.5 g于锥形瓶中，加入20 mL酶解液，放入恒温振荡箱中24 h（25℃，120 r/min）后取上清液测定溶液中剩余多肽含量[25]。根据公式（1）计算吸附率[26]。
式中：A1为吸附前溶液初始多肽含量，mg/mL；A2为吸附后溶液剩余多肽含量，mg/mL。
1.2.5.2 解析率的计算
将充分吸附24 h后的树脂取出过滤放入锥形瓶中，加入20 mL体积分数为70%的乙醇，乙醇能和大孔树脂进行分子态的物质竞争吸附，使物质转为溶解于乙醇，从而被解析下来[27]。放入恒温振荡箱中24 h（25℃，120 r/min），此时溶液中乙醇已挥发殆尽。取上清液测定溶液中剩余多肽含量。根据公式（2）计算解析率。
式中：A1为吸附前溶液初始多肽含量，mg/mL；A2为吸附后溶液剩余多肽含量，mg/mL；A3为解析后溶液多肽含量，mg/mL；V1为解析液体积，mL；V2为吸附液体积，mL。
1.2.6 动态洗脱工艺的确定
1.2.6.1 确定最佳上样流速
将层析柱垂直安装，径高比为1∶12，装柱后加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液冲洗至平衡后上样12 mL酶解产物，多肽含量约8 mg/mL～10 mg/mL。试验选用1、3、5、7、9 BV/h的流速进行收集，待酶解产物吸附完后，用恒流泵不断注入70%乙醇溶液，每管收集3 mL，按照1.2.4的方法测定多肽含量，绘制曲线，确定最佳上样流速[25]。
1.2.6.2 确定最佳上样量
根据最佳上样流速进行收集，每管收集3 mL，测定多肽含量，绘制泄漏曲线，确定最佳上样量。
1.2.6.3 确定最佳乙醇洗脱浓度
根据最佳上样量上样，控制上样流速直至吸附饱和，用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗直至平衡，选用乙醇浓度分别为60%、70%、80%进行洗脱，控制洗脱速度为0.5 mL/min[26]。每管收集5 mL，测定多肽含量，确定最佳乙醇洗脱浓度。
1.2.6.4 确定最佳洗脱速度
试验洗脱流速分别为0.25、0.50、1.00 mL/min进行洗脱。测定每管多肽含量，并绘制曲线，确定最佳洗脱速度[23]。
1.3 数据处理
试验重复3次，数据以
±s，采用Microsoft Excel作图进行处理。
2 结果与分析
2.1 酶解产物抗氧化性比较
按照1.2.2方法进行酶解，测定产物其抗氧化性，结果如表2所示。
表2 酶解产物抗氧化性试验结果
Table 2 The antioxidant activity result of enzymatic hydrolysis products
酶种类 还原力 DPPH自由基清除能力/% 羟自由基清除能力/% 超氧阴离子自由基清除能力/%碱性蛋白酶 Alcalase 1.755±0.008 39.84±0.23 26.76±0.64 25.90±0.05中性蛋白酶 1.622±0.011 36.76±1.05 30.29±1.51 20.63±0.03木瓜蛋白酶 0.792±0.004 32.36±0.46 36.67±1.09 7.56±0.09木瓜蛋白酶（超声辅助） 0.837±0.008 34.66±0.37 32.16±1.01 9.23±0.04木瓜-中性蛋白酶 1.387±0.007 35.59±1.35 23.97±0.89 22.13±0.02
根据表2可知，碱性蛋白酶Alcalase酶解液具有较高的还原力和DPPH自由基清除能力，数值分别为1.755%和39.84%；木瓜蛋白酶水解的样品羟自由基清除能力最高36.67%，但木瓜蛋白酶和超声辅助木瓜蛋白酶得到酶解液超氧阴离子自由基清除能力太低，不足10%。原因可能为：还原力、超氧阴离子自由基清除能力等均为经典的体外抗氧化试验，但侧重点略有不同；再则外界酶解工艺条件的不同造成数据有偏差。
综合分析，碱性蛋白酶Alcalase酶解得到酶解液具有最佳抗氧化性，确定该酶解产物进行大孔树脂分离。测定Alcalase酶解产物中多肽含量为（10.71±0.23）mg/mL。
2.2 大孔树脂的筛选
按照1.2.5的方法进行大孔树脂的静态吸附与解析，计算吸附率和解析率，结果如表3所示。
表3 大孔树脂的静态吸附与解析试验结果
Table 3 Experimental results of static adsorption and analysis with different macroporous resins
大孔树脂种类 吸附率/% 解析率/%AB-8 92.16±1.03 90.65±2.57 X-5 62.31±0.75 80.18±2.36 HPD600 88.45±1.72 85.35±2.94 D101 79.31±1.96 10.15±0.31 D301 53.25±0.88 58.73±1.23 D315 63.45±2.48 76.07±1.86 D450 5.14±0.19 60.00±2.12
由表3可知AB-8和HPD600的吸附率最高，分别为（92.16±1.03）%和（88.45±1.72）%；但是HPD600的解析率却远低于AB-8，且AB-8的解析率也是各类大孔树脂当中最高的，为（90.65±2.57）%。AB-8型大孔吸附树脂具有弱极性、网状结构和高比表面积，能对分子大小不同的化合物进行筛选，适合于生物工程下游技术中蛋白质、多肽、核酸类等的分离纯化[28]。由于它对多肽类的吸附不受pH值的影响，能简化工艺，可以直接上样[29]。对大孔树脂AB-8静态吸附与解析试验进行重复试验，其吸附率为（91.16±0.9）%、解析率为（87.13±0.4）%。故表明AB-8试验数据稳定可信，重复性高，因此可以使用AB-8进行后续试验。
2.3 AB-8动态洗脱工艺的确定
2.3.1 最佳上样流速的确定
按1.2.6.1试验方法收集溶液，测定每管样品多肽含量，结果如图1所示。
图1 不同上样流速洗脱曲线
Fig.1 Elution curves of different sample velocities different sample velocities
由图1可知，当上样流速大于等于5 BV/h时，曲线迅速达到峰值，流出液中多肽浓度高，说明上样速度过快导致树脂表面吸附达到饱和后，物质未被充分吸附并进入树脂内部就被冲出柱外；当上样流速为1、3 BV/h时，刚开始收集液中多肽含量缓慢增加，收集液20 mL时多肽含量达到峰值，分别为0.71、0.83 mg/mL，然后随时间推移逐渐下降。从峰形出峰位置，3 BV/h比较合理稳定，选用上样流速3 BV/h合适。
2.3.2 最佳上样量的确定
用3 BV/h上样流速1.2.6.2试验方法收集溶液，测定其多肽含量，结果如图2所示。
图2 AB-8大孔树脂的泄漏曲线
Fig.2 AB-8 leakage curve of macroporous resin
由图2可知，当柱体积不变时，多肽含量随着流出液的体积增加而增加，当收集到30 mL时，多肽含量达到最高1.31 mg/mL，随后多肽浓度处于稳定状态，说明AB-8达到吸附饱和的状态；由于收集的液体在24 mL时，多肽的浓度达到1.27 mg/mL，大于20 mL时为1.14 mg/mL，略小于30 mL的1.31 mg/mL，说明大孔树脂已经趋于饱和状态。从经济角度出发，选用24 mL作为最佳上样量适用。
2.3.3 最佳乙醇洗脱浓度的确定
采用3 BV/h上样流速，上样量为24 mL时，按试验1.2.6.3的方法进行收集，测定收集液每管多肽含量，结果如图3所示。
图3 不同浓度乙醇洗脱曲线
Fig.3 Elution curves of ethanol at different concentrations
由图3可知，70%的乙醇作为洗脱液时出峰速度最快；60%乙醇在20 mL时出峰，达到为0.91 mg/mL后迅速下降；80%乙醇出峰较慢，但目标物峰值最大，达到1.30 mg/mL左右。根据目标物回收情况，选用80%乙醇作为洗脱液进行动态洗脱。查阅文献发现，乙醇作为洗脱剂分离纯化活性产物时所用的浓度70%～80%之间，此时能解析分子量在1 500 kd以下小分子活性物质，如75%乙醇洗脱小麦蛋白得到抗氧化能力最高[30]、75%乙醇洗脱组分得到汉麻籽粕降血糖肽酶活最高[31]、75%的乙醇溶液纯化麦冬总皂苷酶解产物效果最佳等[32]。
2.3.4 最佳洗脱流速的确定
按试验1.2.6.4方法，以80%乙醇洗脱液对样品进行洗脱，结果如图4所示。
由图4可知，当流速为0.25 mL/min时峰值最低，此时多肽最高仅为0.86 mg/mL，且拖尾现象严重；当洗脱速度为0.50 mL/min时，洗脱峰较低，拖尾现象明显；流速0.50 mL/min时洗脱峰最大达到1.19 mg/mL，但峰面积较小，也存在一定的拖尾现象；1.00 mL/min洗脱时峰值最大，达到1.27 mL/min，且峰面积最大。综上所述，洗脱流速选用1.00 mL/min较合适。
图4 不同洗脱流速洗脱曲线
Fig.4 Elution curves at different elution velocities
采用上样流速3 BV/h、上样量24 mL、乙醇洗脱浓度80%乙醇、洗脱流速1.00 mL/min最佳工艺进行分离纯化碱性蛋白酶Alcalase酶解液，此时层析柱径高比为1∶12，树脂装载量大，吸附率为93.35%，解析率90.43%，多肽损失率在15.60%左右，在合理范围内。
2.4 AB-8大孔树脂分离后抗氧化性测定
采用最佳工艺对碱性蛋白酶Alcalase酶解液进行分离，收集10 mL～30 mL洗脱液，冷冻干燥后用去离子水稀释，测定AB-8分离后酶解液抗氧化性，结果如表4所示。
表4 AB-8分离后抗氧化性试验结果
Table 4 The antioxidant activity result after AB-8 separation
多肽含量/（mg/mL）还原力DPPH自由基清除能力/%羟自由基清除能力/%超氧阴离子自由基清除能力/%0.20 0.242±0.009 32.36±0.45 24.01±0.82 14.29±0.09 0.40 0.336±0.007 34.66±0.36 26.10±0.85 28.57±0.10 0.60 0.465±0.008 35.59±1.32 32.49±0.76 36.76±0.07 0.80 0.649±0.006 36.76±0.74 35.02±0.65 42.86±0.06 1.00 0.879±0.005 37.08±1.54 39.21±0.78 57.14±0.09 10.71（分离前） 1.755±0.008 39.84±0.23 26.76±0.64 25.90±0.05
由表4可知，分离后随着多肽含量的增加，抗氧化性增强；多肽含量1.00 mg/mLDPPH自由基清除能力达到37.08%，与分离前10.71 mg/mL相当；羟自由基清除能力1.00 mg/mL时达到39.21%，比分离前增加12.45%；超氧阴离子自由基清除能力57.14%，是原来的2.21倍。这说明AB-8分离后样品与之前相比，较低浓度多肽含量，其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力都有所增强。
3 结论
本文以红花籽粕为原料，比较不同工艺下酶解籽粕后得到多肽的抗氧化性，研究大孔树脂分离工艺，对比分离前后多肽抗氧化性，结果表明：碱性蛋白酶Alcalase酶解产物抗氧化性为最佳，测得还原力为1.755，DPPH自由基清除率39.84%，羟自由基清除率26.76%、超氧阴离子清除率25.90%，多肽含量达到10.71 mg/mL；比较不同大孔树脂酶解产物的吸附率和解析率，AB-8效果最好，分别为92.16%和90.65%；选择AB-8树脂分离，采用上样流速3BV/h、上样量24mL、洗脱液浓度80%乙醇、洗脱流速1.00 mL/min时为最佳分离工艺。
比较AB-8分离前后样品抗氧化性，多肽含量为1.00mg/mL时DPPH自由基清除能力达到37.08%，与分离前10.71 mg/mL相当；羟自由基清除能力1.00 mg/mL时达到39.21%，增加了12.45%；超氧阴离子自由基清除能力57.14%，是原来的2.21倍。说明AB-8分离后样品比之前酶解样品抗氧化性增强，可将其干燥后制成固体抗氧化肽，作为食品添加剂，为提高红花籽粕附加值提供参考。
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