刀豆别名为刀鞘豆、葛豆、刀板豆等。因其豆荚很长，其形如刀，顾得其名，是一种双子叶植物纲蔷薇目豆科刀豆属植物[1]。其喜温怕冷和强光，对土壤的适应性较好，种植生长周期短，其价格低廉、且营养丰富，因此被广泛种植。据记载，该种起源于南美洲，现遍及美国西南部、非洲等地，我国主要集中于广西、四川、云南、湖北、湖南等地[2]。它是药食同源的蔬菜，其嫩荚可煮汤、炒食，多作腌制，肉厚鲜美，爽脆可口，且具有温补作用[3]。湖南省年出口盐渍刀豆300多吨，畅销日本、东南亚等地[4]，深受人们喜爱。刀豆中含有多种营养成分如蛋白质、纤维素、刀豆氨酸、矿物质等，食用后可以满足人体对能量的需求，可健脾胃，增进食欲，滋补五脏，补充精力。
李宁等[5]对刀豆进行化学分离得到主要药用成分为尿素酶、血细胞凝集素、刀豆球蛋白、刀豆氨酸、黄酮类成分等。其中刀豆球蛋白是有效抗肿瘤成分，能刺激淋巴细胞转变成淋巴母细胞，对白血病、鼻咽癌等有明显的疗效[6]。黄酮类化合物具有多方面的功效，可以改善血液循环、降低胆固醇、抑制炎性生物酶的渗出、强化细胞膜、活化细胞、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用[7]。
目前，国内外对刀豆的研究主要集中于刀豆球蛋白成分提取和活性成分分析，但基于研究刀豆总黄酮的提取及其抗氧化活性报道较少[8-10]。孔子铭等[11]采用超声辅助提取藏药刀豆总黄酮，得到总黄酮得率为0.675%。牛改改等[12]采用加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮，提取率高达83.43%。但用微波辅助提取刀豆壳中的总黄酮尚未见报道。
近年来，刀豆壳作为刀豆的废弃物被农民大量的丢弃或焚烧，这样不仅造成资源浪费，还导致环境严重污染。因此为了提高刀豆壳的利用率，充分发掘其潜在价值。本试验将具有提取效率高、快速高效、溶剂消耗少、受热体系温度均匀、节能等优点的微波辅助技术应用于刀豆壳总黄酮的提取[13-15]，并通过响应面法对刀豆壳中总黄酮的工艺条件进行优化并研究其抗氧化性，以期为刀豆壳的利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料
刀豆壳：亳州市众益堂中药材销售有限公司，经广西科技师范学院特色瑶药资源研究与开发重点实验室张鹏博士鉴定为刀豆壳。
1.1.2 供试试剂
芦丁（超纯级）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢（均为分析纯）：西隆科学股份有限公司。
1.1.3 仪器与设备
FW135型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；FA2004B型电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；XH-MC-1型微波合成反应仪：北京祥鹄科技发展有限公司；KQ-300DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（III）型循环水多用真空泵：巩义市科瑞仪器有限责任公司；C-20型玻璃仪器气流烘干器：上海贝仑仪器设备有限公司；UV-9600型紫外/可见分光光度计：北京北分瑞利分析仪器（集团）公司。
1.2 方法
1.2.1 刀豆壳预处理
使用剪刀将块状刀豆壳进行适当的剪碎，放置电热恒温鼓风干燥箱，将仪器的温度设置为60℃烘干其水分，用粉碎机粉碎，过60目筛，将刀豆壳粉装袋密封后常温保存备用[16]。
1.2.2 刀豆壳的提取
称取刀豆壳粉末2.0 g置于三颈烧瓶中，加入一定量的乙醇为提取溶剂，摇匀后用塞子塞住，静置30min，然后用微波合成反应仪进行提取，最后将提取后的溶液抽滤，取滤液用相同体积分数的乙醇定容至容量瓶中，即可得刀豆壳提取溶液[17]。
1.2.3 刀豆壳总黄酮提取单因素试验
1.2.3.1 乙醇体积分数
准确称量5份2.0 g预处理后的刀豆壳粉，放置250 mL三颈烧瓶中，分别加入40 mL的不同体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇，摇匀，用塞子将其塞住，静置30 min。设定微波温度60℃，微波功率400 W，微波4 min，取出冷却，抽滤，定容至容量瓶中。测定刀豆壳的总黄酮提取量，做3组重复试验，找出较佳乙醇体积分数。
1.2.3.2 液料比
准确称量5份2.0 g预处理后的刀豆壳粉，放置250 mL 三颈烧瓶中，分别按液料比 11∶1、14∶1、17∶1、20∶1、23∶1（mL/g）加入 50%乙醇摇匀，用塞子将其塞住，静置30 min。设定微波温度60℃，微波功率400 W，微波4 min，取出冷却，抽滤，定容至容量瓶中。测定刀豆壳的总黄酮提取量，做3组重复试验，找出较佳液料比。
1.2.3.3 微波时间
准确称量5份2.0 g预处理后的刀豆壳粉，放置250 mL三颈烧瓶中，分别加入40 mL的50%乙醇摇匀，用塞子将其塞住，静置30 min。设定微波温度60℃，微波功率 400 W，在不同微波时间（2、4、6、8、10 min）微波后取出冷却，抽滤，定容至容量瓶中。测定刀豆壳的总黄酮提取量，做3组重复试验，找出较佳微波时间。
1.2.3.4 微波功率
准确称量5份2.0 g预处理后的刀豆壳粉，放置250 mL三颈烧瓶中，分别加入40 mL的50%乙醇摇匀，用塞子将其塞住，静置30 min。设定微波温度60℃，微波时间 6 min，在不同微波功率（300、400、500、600、700 W）微波后取出冷却，抽滤，定容至容量瓶中。测定刀豆壳的总黄酮提取量，做3组重复试验，找出较佳微波功率。
1.2.4 响应面法优化试验
响应面优化分析法是利用科学的试验设计并进行操作得到相应的数据，采用多元二次回归方程来拟合响应值与因素之间的函数关系，通过对指定设计空间内的样本点的集合进行有限的试验设计，拟合出输出变量（系统响应）的全局逼近来代替真实响应面[18-19]。
在单因素试验结果的基础上，选取最佳乙醇体积分数（%）、液料比（mL/g）、微波时间（min）、微波功率（W），使用Box-Behnken设计四因素响应面试验，试验因素及水平见表1。
表1 响应面试验因素及水平
Table 1 response surface test factors and levels
水平 A乙醇体积分数/%B液料比/（mL/g）C微波时间/min D微波功率/W-1 40 17∶1 4 500 0 50 20∶1 6 600 1 60 23∶1 8 700
1.3 项目测定
1.3.1 总黄酮提取量的测定
将1.2.2的溶液定容后取2.0 mL于具塞试管中，加入浓度为5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，将其充分摇匀后静置6 min，再加入浓度为10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，最后再加入浓度为10%氢氧化钠溶液3.0 mL，摇匀静置15 min使其充分反应。用可见分光光度计测定其在510 nm波长处的吸光值，按以下公式计算刀豆壳总黄酮的提取量[20]。
式中：C为刀豆壳总黄酮提取液质量浓度，mg/mL；V为抽滤后提取液定容的总体积，mL；D为稀释倍数；m为刀豆壳的质量，g。
1.3.2 芦丁标准曲线制作
参照张晓静等的方法略微修改[21]。用70%乙醇将0.020 0 g芦丁配制成0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，备用。分别移取标准溶液 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 到10 mL的比色管中，加入70%乙醇，使得溶液总体积为2 mL，然后按1.3.1的步骤操作。以70%乙醇为空白，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线线性回归方程：y=13.105x+0.029 3（R2=0.999 1）。
1.3.3 刀豆壳总黄酮抗氧化活性研究
将最佳工艺条件下得到的刀豆壳总黄酮浓缩液加无水乙醇配制成质量浓度分别为0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL 的样品溶液。参考王彦兵等[22]的方法进行羟自由基清除活性测定，同时以L-抗坏血酸为阳性对照。按照公式计算羟自由基清除率。
式中：A为蒸馏水2 mL+2.5 mmol/L水杨酸溶液2 mL+5.0 mmol/LFeSO4溶液2 mL+5.0 mmol/L H2O2溶液2 mL的吸光度值；A0为样品溶液2 mL+2.5 mmol/L水杨酸溶液2 mL+5.0 mmol/LFeSO4溶液2 mL+5.0 mmol/L H2O2溶液2 mL的吸光度值；A1为样品溶液2 mL+2.5 mmol/L水杨酸溶液2 mL+5.0 mmol/L FeSO4溶液2 mL+蒸馏水2 mL的吸光度值。
1.4 数据分析
所有试验数据重复3次取平均值，采用SPSS 22.0软件进行数据统计及分析。
2 结果分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响
乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响见图1。
由图1可知，在乙醇体积分数为40%～50%刀豆壳总黄酮提取量是不断增大的；在乙醇体积分数为50%时，刀豆壳总黄酮提取量出现了最大值；在乙醇体积分数超过50%后提取量逐渐减小。出现这种情况的原因可能是因为刀豆壳粉末和乙醇的渗透压会根据乙醇体积分数的增大而增加，从而有利于总黄酮的浸出[16]，当大于一定限值时，一些醇溶性的其它物质大量溶出，导致总黄酮浸出量下降[19]。因而确定提取总黄酮所需乙醇体积分数为50%，此时总黄酮的提取量为2.146 mg/g。
图1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响
Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction
不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。
2.1.2 液料比对总黄酮提取量的影响
液料比对总黄酮提取量的影响见图2。
图2 液料比对总黄酮提取量的影响
Fig.2 Effect of liquid to material ratio on total flavonoid extraction
不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。
由图2可知，随着液料比的增加，总黄酮提取量先增大后减小，当液料比为20∶1（mL/g）时，总黄酮提取量达到峰值。出现这种情况的原因可能是在一定范围内，液料比的增大可以增强溶剂和原料的接触效果，增大浓度差，有利于提高扩散速度，从而可提高黄酮类化合物的提取量。但是当乙醇的用量过高时，体系中的其它可溶性物质与黄酮竞争溶剂，从而影响总黄酮的提取率[23]。综合经济效益确定液料比为 20∶1（mL/g）为最佳，此时总黄酮的提取量为2.171 mg/g。
2.1.3 微波时间对总黄酮提取量的影响
微波时间对总黄酮提取量的影响见图3。
图3 微波时间对总黄酮提取量的影响
Fig.3 Effect of microwave time on the extraction of total flavonoids extraction
不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。
由图3可知，在微波时间为2 min～6 min时，刀豆壳总黄酮提取量不断增大；在微波时间为6 min时出现了最大值；当微波时间超过6 min后，刀豆壳中总黄酮提取量逐渐减小。这可能是因为微波时间过长导致黄酮类物质被氧化分解，造成刀豆壳总黄酮提取量下降[19]。因而确定提取总黄酮最适宜微波时间为6 min，此时总黄酮的提取量为2.239 mg/g。
2.1.4 微波功率对总黄酮提取量的影响
微波功率对总黄酮提取量的影响见图4。
图4 微波功率对总黄酮提取量的影响
Fig.4 Effect of microwave power on total flavonoids extraction
不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母表示差异不显著（P>0.05）。
由图4可知，微波功率在300 W～600 W时，刀豆壳中总黄酮提取量逐渐增大；在微波功率为600 W时总黄酮得率达到最大值；之后随微波功率增大而逐渐下降。出现这种情况的原因可能是在300 W～600 W时微波功率较低，刀豆壳细胞不能被充分的破碎，总黄酮的溶出量较少[24]。因此，确定提取总黄酮的微波功率为600 W，此时总黄酮的提取量为2.352 mg/g。
2.2 响应面法优化刀豆壳总黄酮提取工艺
2.2.1 响应面试验条件与结果
以乙醇体积分数（A）、液料比（B）、微波时间（C）、微波功率（D）为自变量，刀豆壳总黄酮提取量（Y）为响应值，设计四因素三水平试验，共有29个试验点，其中24个析因点，5个中心点。试验设计的条件及其结果见表2。
表2 响应面试验条件与结果
Table 2 Response surface test conditions and results
编号 A B C D 试验值 预测值1 0 0 0 0 2.29 2.32 2 0 1 -1 0 2.08 2.12 3 1 1 0 0 2.03 1.99 4 0 1 0 -1 1.94 1.94 5 0 0 0 0 2.36 2.32 6 0 -1 0 -1 2.10 2.08 7 0 1 0 1 2.07 2.09 8 0 0 0 0 2.35 2.32 9 0 -1 1 0 2.13 2.12 10 -1 0 1 0 1.97 1.99 11 0 0 1 1 2.17 2.16 12 1 0 -1 0 2.16 2.14 13 0 -1 -1 0 2.15 2.16 14 0 1 1 0 1.92 1.95 15 1 0 1 0 2.12 2.12 16 -1 -1 0 0 2.04 2.05 17 -1 0 -1 0 2.20 2.19 18 0 0 0 0 2.26 2.32 19 -1 0 0 1 2.19 2.19 20 1 0 0 -1 2.09 2.12 21 0 0 -1 1 2.18 2.16 22 1 0 0 1 2.10 2.10 23 -1 0 0 -1 1.92 1.95 24 0 0 1 -1 1.97 1.95 25 -1 1 0 0 2.09 2.03 26 1 -1 0 0 2.15 2.18 27 0 0 0 0 2.33 2.32 28 0 0 -1 -1 2.18 2.18 29 0 -1 0 1 2.17 2.16
使用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验，确定刀豆壳总黄酮最佳提取工艺条件。
得到拟合的回归方程模型为：Y=2.32+0.020A-0.051B-0.056C+0.056D-0.042AB+0.048AC-0.065AD-0.033BC+0.015BD+0.048CD-0.12A2-0.14B2-0.092C2-0.11D2。
2.2.2 方差分析
响应面回归方程的方差分析见表3。
表3 响应面回归方程的方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface regression equation
注：*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性A 0.004 76 1 0.00 3.24 0.093 6 B 0.032 1 0.03 21.64 0.000 4 **C 0.037 1 0.04 25.21 0.000 2 **D 0.038 1 0.04 25.74 0.000 2 **AB 0.007 06 1 0.01 4.8 0.045 9 *AC 0.009 22 1 0.01 6.27 0.025 3 *AD 0.017 1 0.02 11.58 0.004 3 **BC 0.004 42 1 0.00 3.01 0.104 9 BD 0.000 93 1 0.00 0.63 0.439 7 CD 0.009 22 1 0.01 6.27 0.025 3 *A2 0.087 1 0.09 58.89 <0.000 1 **B2 0.12 1 0.12 83.6 <0.000 1 **C2 0.055 1 0.06 37.58 <0.000 1 **D2 0.083 1 0.08 56.24 <0.000 1 **模型 0.39 14 0.028 18.70 <0.000 1 **残差 0.021 14 0.001 471失拟项 0.013 10 0.001 34 0.75 0.679 4误差 0.007 189 4 0.001 797总离差 0.41 28 R2 0.949 2
由4个单因素的F值可知，模型一次项B、C、D与交互项 AD 以及二次项 A2、B2、C2、D2对刀豆壳总黄酮提取量有极显著的影响（P<0.01）；二次项 AB、AC、CD对刀豆壳总黄酮提取量有显著的影响（P<0.05）；一次项A与二次项BC、BD对刀豆壳总黄酮提取量影响不显著（P>0.05）。4个单因素对刀豆壳总黄酮提取量影响程度为：D>C>B>A，微波功率对其影响最大。由表3可知，该模型回归极显著（P<0.000 1）；失拟项不显著（P=0.679 4>0.05），说明该模型可行。模型R2=0.949 2，说明模型拟合度较高，该方法可靠。综上所述，此模型分析和预测微波辅助提取刀豆壳总黄酮提取量是合理的。
2.3 响应面优化图形分析
响应面图是由二维等高线图和三维空间曲面图组成的，通过拟合出响应面值的形状，分析各因素对刀豆壳总黄酮提取量的影响[25]。
2.3.1 乙醇体积分数和液料比的交互作用
在微波时间6 min、微波功率600 W时，乙醇体积分数和液料比对刀豆壳总黄酮提取量的等高线和响应面见图5。
由图5和表3可知，乙醇体积分数在40%～60%、液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势；液料比曲面较乙醇体积分数曲面陡峭，说明液料比对刀豆壳总黄酮提取量影响较为明显。等高线图呈椭圆形，说明乙醇体积分数和液料比之间有明显的交互作用。
图5 乙醇体积分数和料液比对总黄酮提取率影响的等高线和响应面曲面
Fig.5 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and liquid- solid ratio on total flavonoids extraction rate
2.3.2 乙醇体积分数和微波时间的交互作用
当液料比 20∶1（mL/g）、微波功率 600W 时，乙醇体积分数和微波时间对刀豆壳总黄酮提取量的等高线和响应面见图6。
图6 乙醇体积分数和微波时间对总黄酮提取量影响的等高线和响应面曲面
Fig.6 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and microwave time on total flavonoids extraction rate
由图6和表3可知，乙醇体积分数在40%～60%、微波时间在4 min～8 min时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势；微波时间曲面较乙醇体积分数曲面陡峭，说明微波时间对刀豆壳总黄酮提取量影响较为明显。等高线图呈椭圆形，说明乙醇体积分数和微波时间之间有明显的交互作用。
2.3.3 乙醇体积分数和微波功率的交互作用
当液料比 20∶1（mL/g）、微波时间 6 min 时，乙醇体积分数和微波功率对刀豆壳总黄酮提取量的等高线和响应面见图7。
图7 乙醇体积分数和微波功率对总黄酮提取量影响的等高线和响应面曲面
Fig.7 Contour lines and response surface of the effects of ethanol volume fraction and microwave power on total flavonoids extraction rate
由图7和表3可知，乙醇体积分数在40%～60%、微波功率在500 W～700 W时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势；微波功率曲面较乙醇体积分数曲面陡峭，说明微波功率对刀豆壳总黄酮提取量影响较为明显。等高线图呈椭圆形，说明乙醇体积分数和微波功率之间有明显的交互作用。
2.3.4 液料比和微波时间的交互作用
当乙醇体积分数50%、微波功率600W时，料液比和微波时间对刀豆壳总黄酮提取量的等高线和响应面见图8。
图8 液料比和微波时间对总黄酮提取量影响的等高线和响应面曲面
Fig.8 Contour lines and response surface of the effects of liquid-solid ratio and microwave time on total flavonoids extraction rate
由图 8 和表 3 可知，液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）、微波时间在 4 min～8 min 时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势；微波时间曲面较液料比曲面陡峭，说明微波时间对刀豆壳总黄酮提取量影响较为明显。等高线图呈圆形，说明料液比和微波时间之间没有明显的交互作用。
2.3.5 液料比和微波功率的交互作用
当乙醇体积分数50%、微波时间6 min时，料液比和微波功率对刀豆壳总黄酮提取量的等高线和响应面见图9。
图9 液料比和微波功率对总黄酮提取量影响的等高线和响应面曲面
Fig.9 Contour lines and response surface of the effects of liquid-solid ratio and microwave power on the extraction rate of total flavonoids
由图 9 和表 3 可知，液料比在 17∶1（mL/g）～23∶1（mL/g）、微波功率在500 W～700 W时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势。等高线圈趋于圆形，3D曲面图中顶端凸面较为均匀圆润，其交互作用不显著。
2.3.6 微波时间和微波功率的交互作用
当乙醇体积分数 50%、液料比 20：1（mL/g）时，微波时间和微波功率对刀豆壳总黄酮提取量的等高线图和响应面图见图10。
由图10和表3可知，微波时间在4 min～8 min、微波功率在500 W～700 W时，刀豆壳总黄酮提取量呈先升高后降低趋势；微波功率曲面较微波时间曲面陡峭，说明微波功率对刀豆壳总黄酮提取量影响较为明显。等高线图呈椭圆形，说明料液比和微波功率之间有明显的交互作用。
图10 微波时间和微波功率对总黄酮提取量影响的等高线和响应面曲面
Fig.10 Contour lines and response surface of the effects of microwave time and microwave power on the extraction rate of total flavonoids
2.4 最优工艺参数的确定
根据响应面优化分析，得到预测刀豆壳总黄酮最大提取量为2.332 mg/g，此时提取工艺条件为：乙醇体积分数 50.16%，液料比 19.54∶1（mL/g），微波时间5.56 min，微波功率618.62 W。根据实际操作调整为：乙醇体积分数 50%，液料比 20∶1（mL/g），微波时间5.6 min，微波功率600W，重复试验3次，得到平均值为2.330 mg/g，与预测值偏差较小，表明该方案是可行的，优化后的工艺条件参数可靠，具有一定参考价值。
2.5 刀豆壳总黄酮抗氧化活性分析
不同质量浓度总黄酮提取液、VC对羟自由基清除率影响见图11。
图11 不同质量浓度总黄酮提取液、VC对羟自由基清除率影响
Fig.11 Effects of total flavonoid extract and VCwith different mass concentrations on hydroxyl radical scavenging rate
由图11可知，刀豆壳总黄酮、VC浓度在0.15mg/mL～0.5 mg/mL范围内，对羟自由基的清除能力较好。与相同质量浓度的VC相比，在质量浓度低于0.25 mg/mL时，刀豆壳总黄酮提取液对羟自由基表现出更强的清除能力；质量浓度大于0.25 mg/mL时，则VC对羟自由基表现出更强的清除能力[26]。当质量浓度为0.50mg/mL，刀豆壳总黄酮提取液达到最大清除率为80.72%，比同质量浓度VC的最大清除率97.25%稍弱，但刀豆壳总黄酮也表现出较强的清除羟自由基的能力。
3 结论
本试验采用乙醇-微波辅助的方法提取刀豆壳总黄酮，并对其羟自由清除率进行探讨。再通过响应面试验，根据实际操作得到刀豆壳总黄酮最大提取量为2.330 mg/g，此时提取工艺条件为：乙醇体积分数50%，液料比 20∶1（mL/g），微波时间 5.6min，微波功率 600 W。羟自由基清除率研究表明，当质量浓度为0.50 mg/mL，刀豆壳总黄酮提取液达到最大清除率为80.72%，比同质量浓度VC的最大清除率97.25%稍弱，但刀豆壳总黄酮也表现出较强的清除羟自由基的能力。虽然本试验刀豆壳总黄酮的提取量较少，但其具有较强的羟自由基清除率，若能得到较好的开发，将能充分利用刀豆壳资源，提高其利用价值。
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