柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，包含丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等14种氨基酸。柞蚕属于野蚕，主要分布在辽宁、河南等地。目前，我国柞蚕原料茧和蚕丝产量约占世界总产量的3/4。长期以来，柞蚕丝最为主要价值在于纺织，但是随着时代的不断发展，许多科学家对其不断开发，范围覆盖了多个领域，比如手术后的缝合线、涂料、分离膜及生物活性物的固定化和智能型水凝胶等，目前柞蚕丝有很大的发展空间。
丝素蛋白主要应用于两大领域，生物材料和生物医学。但是近几年来，研究人员对丝素蛋白在食品方面的应用也有所探究。如韩建华等[1-2]称取柞蚕丝素纳米粉产品12 g加水至40 mL混匀，按40 mL/kg给予小鼠灌胃，观察14 d结果显示，柞蚕丝解酒保肝产品未对小鼠产生急性毒性反应，以期证明柞蚕丝食品有一定的安全性。
本试验在大鼠生长试验的基础上开展试验，通过测定大鼠对柞蚕丝素蛋白的消化吸收状况，以及通过喂养实验和氮代谢实验，来检测柞蚕丝素蛋白营养价值及食用安全性，对柞蚕丝素蛋白的营养价值作进一步探索。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级SD大鼠：亿斯实验动物技术有限公司，试验用鼠均SPF级别，动物饲养室温度为（20±2）℃，通风频率≥10次/h，生长环境均为12 h光照、12 h黑暗，作息规律。
1.2 饲料配方
参考美国官方分析化学师协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）中蛋白质功效比值（protein efficiency ratio，PER）测定方法中的饲料配方要求设计蛋白喂养饲料，以含酪蛋白的饲料为阳性对照，饲料配方如表1所示。
表1 柞蚕丝素蛋白试验饲料配方
Table 1 Formula of tussah silk fibroin experiment feed%
注：—表示未添加该组分。
正常组组分 高蛋白组 低蛋白组 酪蛋白组酪蛋白 — — 10柞蚕丝素蛋白 20 10 —玉米淀粉 49 59 59花生油 15 15 15混合盐 4 4 4混合维生素 2 2 2纤维素 10 10 10白面 — — —麸皮 — — —玉米面 — — —豆粉 — — —无蛋白组10—59 15 4 2 1 0— —— — — —4 2 —4 0 15 25 14
1.3 仪器与试剂
SPD80全自动定氮仪：优品培养基实验器材有限公司；D2大鼠代谢笼：冯氏实验动物设备有限公司；TU-1810型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；BS-600L电子天平：江苏南京俱全仪器有限公司。
酪蛋白（含氮量13%）：天津大茂化学试剂厂；无氮饲料：天津天垚有限公司；正常组饲料：长春亿斯实验动物技术有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 动物选择与准备
清洁级SD大鼠（SPF级，雄性，体重为90 g～110 g，日龄28 d）：亿斯实验动物技术有限公司。饲养温度为21℃～23℃，室内相对湿度（relative humidity，RH）为70%～75%，自然光照，自由采食和饮水。每日给予大鼠足够的特定饲料，大鼠饮水来自纯净的自来水[3]。
1.4.2 大鼠28 d喂养实验
实验前将大鼠随机分为5组，分别为高蛋白组、低蛋白组、酪蛋白组、无蛋白组、正常组（空白对照），每组5只，组内体重差不大于10 g。实验期间分别喂不同配方饲料，并进行相应指标检测和观察。
1.4.3 柞蚕丝素蛋白氨基酸测定
由吉林省蚕业科学研究院进行测定待测柞蚕丝素中的各种氨基酸所占比例。
1.4.4 氮代谢实验
喂养实验的第6天起进行5 d的氮代谢实验。氮代谢实验的第1天及代谢期结束的次日早上在柞蚕丝素蛋白饲料中加入胭脂红作为标记，每只鼠首次排出红色粪便为开始收集的信号，将大鼠的粪便全部收集到塑封袋中进行冻干放置-20℃保存。每天将代谢笼漏斗下每只鼠的尿液收集于玻璃瓶中，置-20℃冰箱保存。粪便用凯氏定氮法定氮，尿液用考马斯亮蓝法定氮[4]。大鼠消化中食物氮是柞蚕丝素蛋白饲料中含氮量；粪氮是大鼠吃过饲料后排泄物的含氮量；粪代谢氮是大鼠食用无氮饲料后排泄物中的含氮量；粪内源氮指无氮（蛋白质）膳食条件下，机体由粪便排出的氮；尿内源氮指无氮（蛋白质）膳食条件下，机体由尿排出的氮。
1.4.5 柞蚕丝素蛋白消化实验
待大鼠生长稳定，开始进行消化实验测定柞蚕丝素蛋白在大鼠体内的消化、吸收、代谢等数值。饲养一段时间后，每天称量食物消耗，收集每天未消化的饲料、排泄物和尿液，并且小心分离，将排泄物在100℃真空干燥箱过夜研磨，排泄物根据氮代谢实验相关数值进行计算相关消化指标。
1）蛋白质功效比值（protein efficiency ratio，PER）是大鼠体重的增加与所摄取的蛋白质之比，表示将蛋白质用于生长的效率。
PER=实验期内动物体重增加克数/实验期内摄入的蛋白质克数
2）蛋白质消化率反映蛋白质在消化道内被分解程度，同时还反映消化后的氨基酸和肽被机体吸收的程度。其中，消化率分为真消化率（true digestibility，TD）和表观消化率（apparent digestibility，AD）。
TD/%=[食物氮-（粪氮-粪代谢氮）]÷食物氮×100
AD/%=（食物氮-粪氮）÷食物氮×100
3）生物价（biological value，BV）是机体的氮储留量与氮吸收量之比。尿内源氮是机体在无氮膳食条件下尿中所含有的氮，它们来自体内组织蛋白质的分解。主要用来评价蛋白质的价值，它表示食物中的蛋白质成分在体内真正被利用的程度。
BV=储留氮÷吸收氮
储留氮=吸收氮-（尿氮-尿内源氮）
吸收氮=摄入氮-（粪氮-粪内源氮）
摄入氮=粪氮十尿氮
4）蛋白质净利用率（net protein utilization，NPU）是机体的氮储留量与摄入氮量之比，表示蛋白质实际被利用的程度。
NPU/%=储留氮÷食物氮=生物价×表观消化率
测定相关消化指标后，进行进一步柞蚕丝素蛋白安全性能检查。
1.4.6 大鼠血液生化指标测定
大鼠喂养实验结束后，给予麻醉药15 min，从大鼠肛门处向胸腔剪开，在肠胃后部的脊柱动脉扎入抽血针，进行抽血[5-6]。每组各鼠取0.5 mL大鼠血液送到吉林市龙潭区铁东医院测其血液中各项生化指标。
1.4.7 柞蚕丝素蛋白对大鼠组织病理学的影响
抽血后处死各组大鼠，仰位固定于板上，剖腹取出心、肝、脾、肺、肾和睾丸，先肉眼观察高蛋白组合低蛋白组大鼠的各个器官与正常组之间的差异，外形、体积、颜色、质地有无改变。然后进行器官取样放入0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（phosphat buffer saline，PBS）配制的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定送到吉林医药学院病理教研室进行切片观察。
1.5 统计方法
实验结果用平均值±标准差（
±SD）表示，实验中各组之间计量数据的显著性差异采用统计学方法，使用SPSS 17.0软件进行分析。方差齐时，各组间两两比较采用最小显著性差异法（least—significant difference，LSD）；方差不齐时，各组间两两比较采用Tamhane法。P<0.05认为具有显著性差异[7-8]。
2 结果与分析
2.1 柞蚕丝素蛋白氨基酸组成
柞蚕丝素蛋白氨基酸组成见表2。该蛋白中丙氨酸（Ala）含量最高，占氨基酸总量的45.952 5%，蛋氨酸（Met）含量最少仅含0.0648 7%。
表2 柞蚕丝素蛋白各种氨基酸含量
Table 2 Amino acid content of tussah silk fibroin
注：-表示未检出。
氨基酸名称 含量/%天门冬氨酸 5.758 8苏氨酸 -丝氨酸 12.542 4谷氨酸 1.318 9甘氨酸 13.352 5丙氨酸 45.952 5缬氨酸 0.312 9蛋氨酸 0.064 87异亮氨酸 0.305 1亮氨酸 0.160 1酪氨酸 4.582 5苯丙氨酸 0.437 0赖氨酸 -组氨酸 0.932 6精氨酸 4.579 1脯氨酸 0.264 8
柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质掺杂着少量杂质，经过检测发现包含丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸等14种氨基酸。柞蚕丝素蛋白含有5种人体必需氨基酸：苯丙氨酸（phenylalanine）、蛋氨酸（methionine）、异亮氨酸（isoleucine）、亮氨酸（leucine）、缬氨酸（valine）。其中甘氨酸和丝氨酸具有降低血液中胆固醇浓度；丙氨酸有促进酒精代谢的作用；酪氨酸具有预防老年痴呆的作用[9]。所以，柞蚕丝素蛋白在食用方面有很高的营养价值。
2.2 柞蚕丝素蛋白对大鼠体内机能影响
2.2.1 柞蚕丝素蛋白对大鼠体重的影响
柞蚕丝素蛋白对大鼠体重的影响见表3。
如表3所示，经统计学处理，28 d喂养后，大鼠的体重、摄食量在高、低蛋白组和正常组间比较存在显著性差异，即摄入柞蚕丝素蛋白可以降低大鼠体内脂肪，减少食物摄取，可能发挥减肥作用。
表3 柞蚕丝素蛋白对大鼠体重的影响
Table 3 Effect of tussah silk fibroin on rat weight
注：*表示与正常组比较差异显著P<0.05，**表示与正常组比较差异极显著P<0.01。
组别 增重量/g 摄食量/g正常组 85.7±7.17 524±31.75无蛋白组 -22.42±4.77 197.7±18.2酪蛋白组 64.56±5.78 321.6 ±14.3低蛋白组 -33.99±2.18** 238.7±134.42*高蛋白组 -34.35±1.21** 225.12±96.84*
2.2.2 柞蚕丝素蛋白对大鼠消化指标的影响
柞蚕丝素蛋白对大鼠消化指标的影响如表4所示。
表4 柞蚕丝素蛋白对大鼠消化指标的影响
Table 4 Effects of tussah silk fibroin on digestive indexes of rats
注：*表示与正常组比较差异显著P<0.05。-表示辅助参数，参与计算，无得数。
组别 真消化率TD/% 表观消化率AD/% 生物价BV 蛋白质净利用率NPU/% 蛋白质功效比值PER正常组 69.46±0.85 64.31±0.62 99.14±0.03 69.96±3.48 2.62±1.25无蛋白组 - - - - -酪蛋白组 - - - - -低蛋白组 57.77±5.08 33.36±1.19 96.35±2.66 60.40±5.65 -1.26±0.26*高蛋白组 54.65±4.00 35.83±2.60 98.13±1.74 56.67±2.93 -0.99±0.43*
如表4所示，28 d喂养后，使用凯氏定氮仪测得储留氮和吸收氮数值，与正常组比较，高蛋白组和低蛋白组的PER显著性降低（P<0.05）。PER计算得到负值，与正常组相比存在差异原因在于大鼠在28 d的柞蚕丝素蛋白饲料饲养过程中，体重不断减轻。高蛋白组和低蛋白组的生物价与比正常组相比略低，分别达到了（98.13±1.74）和（96.35±2.66），蛋白质被机体利用程度越高，食物被消化后产生的含氮废物就越少，有利于减轻肝、肾的负担[10-12]，所以正常组的饲料对大鼠吸收消化略优于柞蚕丝素蛋白饲料。
2.2.3 柞蚕丝素蛋白对大鼠生化指标的影响
柞蚕丝素蛋白对大鼠血清生化指标的影响见表5。
如表5所示，经统计学处理，28 d喂养后，发现低蛋白组与高蛋白组总蛋白、血白蛋白、球蛋白、总胆红素、乳酸脱氢酶、甘油三酯较正常组均有显著性改变；低蛋白组高密度脂蛋白、低密度脂蛋白也有显著性改变，其余的生化指标与正常组比较，均未见显著性改变（P>0.05）。其中，低、高蛋白组总蛋白、血白蛋白、高密度脂蛋白、总胆红素、乳酸脱氢酶、球蛋白均在正常范围内，高蛋白组白球比略低于正常值（1.08 g/L～1.31 g/L）。
表5 柞蚕丝素蛋白对大鼠血清生化指标的影响
Table 5 Effects of tussah silk fibroin on rat serum biochemical indicators
注：*表示与正常组比较差异显著P<0.05，**表示与正常组比较差异极显著P<0.01。
指标总蛋白/（g/L）141.70±8.48 4.56±0.50 149.68±1.00 4.41±1.33 156.45±76.42 4.615±0.51 141.26±29.77 4.25±0.02高蛋白组 34.82±9.72*15.65±1.45*19.17±3.76 0.82±0.01*12.59±0.02** 5.59±3.86 7.00±3.35谷草转氨酶/（U/L） 谷草/谷丙 球蛋白/（g/L）正常组 49.18±2.82 25.6±2.121 23.575±0.70无蛋白组 29.98±7.50 13.85±5.45 16.13±4.36酪蛋白组 44.80±2.18 23.95±0.05 20.85±1.98低蛋白组 33.57±0.15*16.2±0.18*17.36±0.66*血白蛋白/（g/L）谷丙转氨酶/（U/L）31.2±1.61 38.58±0.3 33.37±7.14 33.27±5.28白球比1.09±0.06 0.87±0.04 1.15±0.01 0.94±0.0.1总胆红素/（μmol/L）间接胆红素/（μmol/L）2.11±0.25 0.64±0.08 1.47±0.33 15.79±0.49 6.49±0.22 9.3±7.68 2.45±0.01 0.91±0.05 1.54±0.01 9.63±0.08** 4.06±1.34 5.57±2.08结合胆红素/（μmol/L）低密度脂蛋白/（mmol/L）正常组 515±49.50 2 002.5±24.75 5.21±0.44 17.17±1.36 6.05±0.49 1.4±0.07 1.51±0.36 0.73±0.01 0.10±0.00无蛋白组 224±50 1 409±392 1.91±1.55 14.24±2.83 5.8±0.02 1.82±0.21 0.27±0.01 0.54±0.02 0.29±0.01酪蛋白组 491±18 1 911.5±140.5 3.78±0.25 21.34±3.13 7.9±0.02 1.8±0.10 0.6±0.03 0.72±0.01 0.29±0.02低蛋白组 334.5±40.5 1 140.5±960.5** 3.00±2.40 15.91±23.53 6.2±0.18 1.74±0.09 0.28±0.01*0.62±0.01* 0.33±0.01*高蛋白组 319±42 1628.5±760.5 2.82±0.52 19.42±7.00 7.0±0.08 2.37±0.19 0.44±0.02* 0.74±0.03 0.22±0.01 31.47±8.02 154.94±8.67 5.12±3.23指标 碱性磷酸酶/（U/L）乳酸脱氢酶/（U/L）尿素氮/（mmol/L）血肌酐/（μmol/L）空腹血糖/（mmol/L）总胆固醇/（mmol/L）甘油三酯/（mmol/L）高密度脂蛋白/（mmol/L）
低蛋白组和高蛋白组甘油三酯低于正常范围（0.67 mmol/L～1.85 mmol/L），且与正常组存在显著性差异。究其原因发现甘油三酯与大鼠体重有关，说明柞蚕丝素蛋白对甘油三酯影响较大。从而发现蚕丝蛋白具有减肥效果，但是过高剂量柞蚕丝素蛋白对体内生化指标有影响，进而产生副作用，所以考虑食用剂量应该低于低剂量[13]。
2.2.4 柞蚕丝素蛋白对大鼠组织病理学的影响
高蛋白组与低蛋白组的大鼠与正常组比较，低蛋白组均和正常组无明显差别，且无病变。但是高剂量柞蚕丝素蛋白组的大鼠肝细胞发现水肿的现象，如图1所示。
图1 高剂量柞蚕丝素蛋白对大鼠组织病理学的影响
Fig.1 Effect of high-dose tussah silk fibroin on histopathology of rats
其他肺、肾、脾、心、睾丸均未见显著性改变，即低剂量的柞蚕丝素蛋白对大鼠体内各个器官无明显影响，但是高浓度的高柞蚕丝素蛋白饲料喂养可能存在肝损伤风险，食用需适量。
3 结论
综合上述实验结果，柞蚕丝素蛋白在作为饲料喂养大鼠，大鼠消化柞蚕丝素蛋白后，主要显著特征是体重有所减轻，高蛋白组真消化率和表观消化率分别为（54.65±4.00）%和（35.83±2.60）%，生物价为 98.13±1.74，蛋白质净利用率为56.67±2.93，功效比值为-0.99±0.43，低蛋白组TD 和AD 分别为（57.77±5.08）%和（33.36±1.19）%，BV 为 96.35±2.66，NPU 为（60.40±5.65）%，PER 为-0.99±0.43。从实验结果可知，柞蚕丝素蛋白在大鼠体内吸收率较低，但是吸收入血后生物价基本大于95，说明机体对该蛋白利用率较高，但是PER为负值意味着大鼠体重有所减轻，由此判定柞蚕丝素蛋白维持大鼠体内氮平衡时，可保存相应肌肉和能量，减少部分多余脂肪量。根据生化指标测定和大鼠组织病理学探究发现柞蚕丝素蛋白在饲料中比重过大对肝有一定影响，所以柞蚕丝素蛋白在减肥食用方面大有潜力但不宜大量食用，影响身体健康。
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