随着天然色素在食品、药品和化妆品等领域的广泛应用，新的天然色素的开发和应用已成为必然趋势[1]。真菌色素作为一类天然色素，具有安全可靠、色泽自然，并兼顾营养和保健作用而倍受人们的喜爱[2]。内生菌是存活于活体植物中的一类特殊微生物，在植物中广泛存在[3]，由于内生菌能够产生与宿主相同或相似的生物活性分泌物[4]，因此药用植物的内生菌具有广阔的研究前景和药用价值[5]。卷边桩菇[Paxillus involutus（Batsch Fr）]属担子菌，生长在东北、华北、西南等地区，生长力旺盛，可在多品种树下生长，常用于风寒湿痹、腰腿疼痛、手足麻木，具有良好的开发利用价值[6]。卷边桩菇的提取物还具有抗氧化、免疫调节和保护神经细胞等功效，可用于制备药物[7]。
张妍等[8]研究发现，卷边桩菇菌丝分离较适宜的培养基配方，并且菌盖与菌柄连接处为分离的最佳部位，并对分离株rDNA ITS片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，鉴定出分离的菌株为卷边桩菇的纯菌种。谢永生等[9]研究发现，怀地黄内生真菌HR-1产生的红色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉均有不同程度的抑制效果，对大肠杆菌的抑制效果与硫酸链霉素的抑制效果相当，抑菌率达95.7%。
近年来研究者多以真菌产色素作为研究对象，从而探讨真菌色素的提取及优化方法[10-11]，对于植物内生菌产生的天然色素成分组成研究甚少。因此本试验通过形态学特征及基因序列分析对一株产红色素卷边桩菇内生真菌进行菌种鉴定，将分离的菌体纯化培养后，对其脂肪酸组成进行分析，进一步探究内生真菌与常见色素的差别，为产色素资源的开发和研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
采用常规内生菌分离方法，从新鲜野生卷边桩菇菌盖与菌杆交界处分离得到在PDA培养基上能够产生红色素的内生真菌。
1.1.2 培养基
PDA培养基：马铃薯200 g，煮沸15 min后过滤，加蒸馏水至1 000 mL，葡萄糖20 g、琼脂20 g、链霉素100 mg/L，pH值为自然状态。
PDB培养基：马铃薯200 g，煮沸15 min后过滤，加蒸馏水至1 000 mL，葡萄糖20 g，链霉素100 mg/L，pH值为自然状态。
1.1.3 试剂
葡萄糖、琼脂：中国医药上海化学试剂公司；GoldviewTM DNA染料、Taq酶、dDNTP：TaKaRa公司。
1.1.4 仪器与设备
BX51-P光学显微镜：OLYMPUS公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；TanonGis—2008凝胶成像系统：天能科技有限公司；HYG-C多功能恒温摇床：上海一恒有限公司；HWS型智能恒温恒湿箱：宁波东南仪器有限公司；Agilent-6890气相色谱仪：AGILENT公司。
1.2 方法
1.2.1 产色素内生真菌卷边桩菇的分离与培养
采新鲜卷边桩菇，蒸馏水去除表面泥土，75%的酒精进行表面消毒，在无菌超净台中用无菌刀片取菌盖与菌杆交界处组织，切成1 cm左右，接种在PDA培养基上，于21℃培养3 d～5 d，待菌落均匀铺满平板，分离纯化，传代培养。
1.2.2 菌株的分子生物学鉴定
接种针取适量菌体于液氮中研磨，待菌体研磨呈粉末状后，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取总DNA，以引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-），ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-）为上下游引物PCR扩增其序列。扩增体系为：20 μL总反应体系中包括DNA模板 0.5 μL，引物 1 μL，2×MKS 10 μL，双蒸水 8.5 μL。扩增条件：95℃预变性5 min后，进行32个循环的扩增（94℃ 1 min，48℃40 s，72℃2 min），最后 72℃充分延伸10 min，4℃保存。反应结束后，取5 μL反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。将PCR产物送至华大基因公司测序，测序结果提交Gene Bank并进行BLAST比对分析，并进行同源性比对，构建系统发育树，确定其分类学地位。
1.2.3 产色素发酵条件的优化
由于组织块在普通PDA培养基上生长缓慢，因此分别添加了经消毒灭菌后的腐殖质、杨树叶，每500 mL发酵基础培养基中加入10 g，其余培养条件均相同，每组设置3个生物学重复，发酵培养3 d～5 d，以此来观察菌丝的生长状态。
1.2.4 色素的提取及鉴定
1.2.4.1 色素提取
将发酵液过滤，并用蒸馏水冲洗菌体，将菌体冲洗液与发酵过滤液合并后待用。按照体积比1∶1加入乙酸乙酯除去脂溶性杂质，将色素液浓缩至30 mL～50 mL，真空抽滤，制备色素粗提物。
1.2.4.2 色素的鉴定
称取250 mg冻干菌体，用液氮充分研磨，菌体粉末加入至50 mL离心管中，立即加入4 mL三氯甲烷和4 mL甲醇溶液并密封管口。摇匀后，超声5 min，4 500 r/min离心5 min，吸取三氯甲烷萃取液，得到粗脂质提取液。余留的残渣按上述方法重新提取两次，氮气吹干称重，计算粗脂质占菌体干重的比例。
采用三氟化硼甲酯化方法制备脂肪酸甲酯。取0.05 g油样于10 mL试管中，加入2 mL氢氧化钠-甲醇溶液，65℃下皂化30 min，冷却后加入2 mL三氟化硼/甲醇溶液（1∶3，体积比），70 ℃下皂化 3 min～5 min。使用色谱纯正己烷萃取脂肪酸甲酯，并用无水硫酸钠去除痕量水分，离心（10 000 r/min，5 min），用有机系微孔滤膜过滤后，进样。
气相色谱法，色谱条件：毛细管柱（CP Sil-88，60 m×250 μm×0.25 μm）。程序升温：60 ℃保持 3 min，以5℃/min升温至175℃，保持15min，以2℃/min升温至220℃，保持20 min；采用火焰离子化检测器，检测器温度250℃；进样口温度250℃；空气压力50 kPa；H2压力 60 kPa；载气 N2，压力 240 kPa；进样体积为 1 μL。分流比：1∶100。以归一化方法计算各脂肪酸百分含量。
1.3 数据处理
所有试验数据分析采用SPSS 19.0统计学软件，Excel绘制图表。
2 结果与分析
2.1 内生菌的分离培养及分子生物学鉴定结果
将斜面菌株接种到PDA平板培养基上培养，待菌丝生长接近培养皿边缘1 cm左右时可见菌体呈现红色，菌丝光滑，菌体呈现蔓延式点状生长，均匀的爬满培养基整个表面，有些菌落边缘呈现半透明状，真菌培养形态见图1。
图1 真菌培养形态
Fig.1 Morphology of fungus culture
2.2 菌株的分子生物学鉴定结果
PCR扩增其序列长为574 bp，提交Gene Bank进行比对并构建进化树，见图2。
图2 菌株的系统发育树
Fig.2 The phylogenetic tree of fungi
由图2可知，该序列与Fusarium petersiae（NR_156397.2）的序列同源性达到98.69%，综合其形态学特征与测序比对结果，此内生真菌鉴定为镰刀菌（Fusarium petersiae）。
2.3 色素发酵条件筛选结果
不同培养环境下菌体生长速度见表1。
表1 不同培养环境下菌体生长速度
Table 1 Fungal growth rate under different culture environments
注：-表示观察时候无菌体；+表示能观察到菌体生长；++表示菌体生长超过1 cm；+++表示菌体布满培养基。
培养环境 1 d 3 d 5 d腐殖质 ++ +++ +++杨树叶 + ++ +++PDA - + ++
不同培养条件对内生真菌产红色素周期影响较大，使用同一环境下的腐殖质、杨树叶进行培养时，其产生红色素的量较使用普通培养基明显增多，说明此内生真菌在生长环境相似的条件下菌体生长迅速，产生红色素的能力强。
2.4 色素脂肪含量的测定及成分分析
抽滤后的菌体进行称重，重复3次，脂肪含量分别为 0.075、0.080 8、0.080 8 g，其提取率分别为（30.00%、32.32%、32.32%）。采用三氟化硼甲酯化方法制备脂肪酸甲酯，其标准品气相色谱结果如图3 A所示，菌体的气相色谱结果如图3B。采用归一法计算各脂肪酸百分含量，结果如表2。
由图3和表2可知，检测到的真菌色素集中出现在15 min～26 min时间段内，根据色素脂肪酸组分进行了初步鉴别，主要包含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酯、亚麻酸。且油酸和亚油酯的含量最多，分别为36.86%、27.84%。
图3 各样本的气相色谱图
Fig.3 Gas chromatogram of each sample
A为脂肪酸甲酯标准品气相色谱图；B为菌体的气相色谱图。
表2 样品中脂肪酸成分气相色谱鉴定结果
Table 2 Gas chromatography identification results of fatty acid components in samples
序号 保留时间/min 含量/% 中文名1 15.003 0.29 豆蔻酸2 17.897 16.02 棕榈酸3 18.563 0.7 棕榈油酸4 20.620 8.43 硬脂酸5 21.167 36.86 油酸6 22.060 27.84 亚油酯7 23.107 8.96 亚麻酸8 25.453 0.36 山嵛酸
3 结论与讨论
卷边桩菇是一种具有祛风散寒，舒筋活络功效的植物，其多糖提取物可用于制备免疫调节的药物[12]。而内生菌可以产生与宿主植株相同或者相似的活性产物[13]，因此药用植物内生菌的研究在多个领域均具备研究价值[14-15]。目前的研究发现药用植物产生的色素具有一定的营养和保健作用[16-17]，但有关卷边桩菇内生真菌产红色素能力的研究目前未见相关报道。本试验从卷边桩菇中分离得到一株能产生红色素的内生真菌，经鉴定此内生菌为镰刀菌（Fusarium petersiae）。动物体内不能直接合成部分不饱和脂肪酸，必须从食物中获取，而微生物中也含有不饱和脂肪酸[18]，因此本试验对真菌色素的脂肪酸成分进行了分析，为产色素资源的开发和研究奠定了基础。
郑青波等[19]研究发现，艾草分离筛选得到的内生真菌，具有多种生理活性和营养价值，在优化了内生真菌发酵条件后，红色素产量得到显著性提高。证明了不同培养条件对内生真菌产红色素周期影响较大，本试验发现使用同一环境下的腐殖质、杨树叶进行培养时，其产生红色素的量较使用普通培养基明显增多，表明内生真菌在生长环境相似的条件下菌体生长更加迅速，产生红色素的能力更强。
李长皓等[20]研究发现，不饱和脂肪酸中的共轭亚油酸具有预防动脉粥样硬化、肿瘤生成，改善超高胰岛素血症及调节免疫活性等作用。而油酸有顺反异构体，天然油酸都是顺式结构，反式结构人体不能直接吸收，但人体自身合成的油酸不能满足需要，要从食物中摄取。本试验发现真菌色素的脂肪酸组分主要包含棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酯和亚麻酸。且油酸和亚油酯的含量最多，表明内生真菌色素可能也具有软化血管，调节新陈代谢等作用，但其功能及应用还需进一步的研究。
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