细菌素是细菌在代谢过程中由核糖体合成的、对产生菌具有自身免疫性的一类具有抗菌活性的多肽类物质[1]。细菌素在生物合成、作用模式、抗性机制及抗菌活性方面与抗生素存在明显不同，被认为是抗生素的最佳替代品之一[2]。据统计，一半以上的细菌可产生不同种类的细菌素[3]。随着大量微生物基因组的公布和细菌素在线比对工具的应用，越来越多的细菌素被发现和鉴定。Xin B Y 等通过在线比对工具BAGEL3对GenBank 中的223 株苏云金芽胞杆菌基因组的细菌素基因簇进行预测，从77 个菌株的基因组中预测到了101 个羊毛硫细菌素的基因簇，通过对部分预测结果进行验证，最后获得了含有4 条肽链的新型羊毛硫细菌素thuricin4A[4]。目前研究的最多、最深入的是来源于乳酸菌的羊毛硫细菌素[5]。虽然1951 年就提出细菌素可作为防腐剂在食品中使用，然而，迄今为止仅有广谱活性细菌素nisin 和pediocinPA-1 被授权做为食品保藏剂使用[6]。所以，开发新型的、具有广谱活性的细菌素具有广泛的应用前景[7]。不同于大多数细菌素，无前导肽细菌素是细菌素家族中一类由核糖体合成的、不进行任何翻译后修饰的、N 端没有前导肽序列的细菌素[8]。该类细菌素遗传结构简单，抗菌机制独特，产生菌多来源于食品且易于在其它微生物中表达，适合通过生物工程进行规模化生产，具有巨大的商业应用潜能。目前已有近20 种无前导肽细菌素被鉴定和报道，本文对该类细菌素的类型、理化特性、生物合成、作用机制及在食品保藏中的应用进行了综述，使人们深入理解无前导肽细菌素的特性和优势，为其进一步应用提供一定的理论基础。
1 无前导肽细菌素的类型
细菌素的分类有不同的方法，目前广泛接受的是由Cotter 等在2013 年修订后的分类方案，按照该分类方案，细菌素主要分为I 类细菌素（也称为翻译后可修饰细菌素）和II 类细菌素（也称为翻译后非修饰细菌素）两类。其中I 类细菌素主要包含羊毛硫细菌素等可修饰细菌素。II 类细菌素又分为5 小类，IIa 类为pediocinPA-1 类细菌素，如pediocinPA-1；IIb 类为由两条肽链组成的具有协同作用的二肽细菌素，如lactacinF；IIc 类为环肽类细菌素，如enterocinAS-48；IId 类为非修饰的、线状的、不属于pediocinPA-1 的细菌素，如microcinS、无前导肽细菌素等；IIe 类为具有铁载体修饰的羧基末端富含丝氨酸的细菌素，如microcin E492。另外，2016 年，Alvarez 等[9]在前人基础上对来源于乳酸菌的细菌素进行了分类，该分类方案同样将细菌素主要分为修饰细菌素和非修饰细菌素两大类（I类和II 类），其中环肽类细菌素被作为I 类细菌素，无前导肽细菌素被作为II 类细菌素中的一小类。无论哪种分类方案，无前导肽细菌素都属于比较特殊的一类。
首次报道的无前导肽细菌素是1998 年由菌株E.faecium L50 产生的细菌素enterocinL50 （entL50），该细菌素含有两条肽链，分别为enterocinL50-A（entL50-A）、enterocinL50-B（entL50-B）[10]。除此之外，到目前为止已经对来自不同种属细菌的多个无前导肽细菌素进行了报道，分别有来自屎肠球菌的enterocinQ（entQ）、enterocinK1（entK1）；来自粪肠球菌的enterocinEJ97（entEJ97）、enterocin7（ent7，与报道的enterocinMR10相同），ent7 含有两条肽链，分别为enterocin7-A（ent7-A）、enterocin7-B（ent7-B）；来自金黄色葡萄球菌的aureocinA53（aurA53）、aureocinA70（aurA70），aurA70 含有4 条肽链，分别为aureocinA70-A（aurA70-A）、aureocinA70-B（aurA70-B）、aureocinA70-C（aurA70-C）、aureocinA70-D（aurA70-D）；来自表皮葡萄球菌的epidermicinNI01（epiNI01）；来自乳酸乳球菌的lacticinQ （lnqQ）、lacticinZ（lnqZ）、lsbB、lactolisterinBU（LliBU）；来自鼠链球菌的BHT-B，来自希腊魏氏杆菌的weisselicinY（welY）、weisselicinM（welM）；来自格氏乳球菌的garvicinKS（garKS），garKS 含有3 条肽链，分别为garvicinKS-A（garKS-A）、garvicinKS-B（garKSB）、garvicinKS-C（garKS-C）；来自蜡样芽胞杆菌的cereucinX（cerX）、cereucinH（cerH）、cereucinV（cerV），它们是经生物信息学预测后化学合成的无前导肽细菌素，其中cerX 含有3 条肽链，分别为cereucinX-A（cerX-A）、cereucinX-B（cerX-B）、cereucinX-C（cerXC），cerH 含有4 条肽链，分别为cereucinH-A（cerHA）、cereucinH-B（cerH-B）、cereucinH-C（cerH-C）、cereucinH-D（cerH-D），cerV 含有3 条肽链，分别为cereucinV-A （cerV-A）、cereucinV-B （cerV-B）、cereucinV-C（cerV-C）[11-12]。根据组成无前导肽细菌素的氨基酸序列，采用在线软件clustal omega 对其氨基酸序列一致性进行比对，结果如图1 所示。
由图1 可见，根据组成细菌素的氨基酸序列一致性，无前导肽细菌素可以明显分为a、b、c、d 4 类，其中a 类无前导肽细菌素肽链的N 端和C 端氨基酸序列都较保守，N 端保守序列为MXXXAKXXXK（X 为任意氨基 酸），C 端 保 守 序 列 为GWXXXKKXYXXXMQ－FIGXGW，包括welY、ent7 和entL50；b 类富含甘氨酸和丙氨酸，包括aur70、garKS、cerX、cerH、cerV；c 类N端较保守而C 端相对不保守，其中N 端保守序列为AXXGXKXV，包括lliBU、BHT-B、aur53、epiNI01、lnqQ及lnqZ；d 类C 端较保守而N 端相对不保守，其中C端保守序列为KXXXGXXPWE，包括entQ、lsbB、entEJ97 和entK1。
图1 无前导肽细菌素氨基酸序列比对结果
Fig.1 Amino acid sequence alignment results of leaderless bacteriocins
a 类N 端和C 端都较保守；b 类富含甘氨酸和丙氨酸；c 类N 端较保守而C 端相对不保守；d 类C 端较保守而N 端相对不保守。
2 无前导肽细菌素的生物合成
通常，细菌素的合成分为3 个过程，首先合成无活性的、N 端含有前导肽序列的前体肽，前体肽在修饰酶的作用下进行翻译后修饰，最后除去前体肽中的前导肽序列从而变为有活性的成熟肽[13]。前导肽是细菌素生物合成酶的识别位点，是酶-底物相互作用所必需的，并对细菌素产生菌有保护作用[14]。大部分细菌素前导肽的切割和分泌需要其专门的前导肽序列，前导肽在细菌素的生物合成中起重要作用[15]。长期以来人们认为前导肽是细菌素生物合成所必需的，然而，无前导肽细菌素的生物合成过程却不形成前导肽序列，在翻译后不经任何修饰即转变有活性的成熟肽。如aurA53 的生物合成除结构基因外几乎不需要其它遗传信息，类似简单的遗传组织在entL50 中也有发现[16]。另外，除welM、welY 的结构基因位于不同操纵子外，其余由同一菌株所产细菌素的各条肽链结构基因均存在于同一操纵子内，并且肽链之间存在协同效应，包括ent7、entL50、aurA70、garKS、cerX、cerH、cerV。无前导肽细菌素这种简单的遗传组织使其很容易与其它微生物蛋白的N 端扩展融合，因此也更容易被其它细菌、真菌或真核细胞表达。如来源于乳酸乳球菌的lnqQ 和来源于金黄色葡萄球菌的aurA53 能够在大肠杆菌E.coli BL21 中大量表达，另外lnqQ 也已在枯草芽胞杆菌中成功表达[17]。来源于E.faecium L50 的细菌素entL50-A 和entL50-B 也已经在酿酒酵母和毕赤酵母中成功表达[18-19]。
3 无前导肽细菌素的理化特征
无前导肽细菌素因其肽链N 端不含前导肽序列而得名，无前导肽细菌素通常含27 个～53 个氨基酸，肽链相对较短，相对分子质量在2.7 kDa～6.1 kDa 之间，富含赖氨酸残基而缺少半胱氨酸残基。研究显示，大多数无前导肽细菌素N 端的甲硫氨酸残基进行了甲酰化，形成了N-甲酰甲硫氨酸，如aurA53、lnqQ、lsbB、garKS、aurA70、ent7、welY、welM 等，但其功能一直未知。在大肠杆菌菌株E.coli BL21 中异源表达的lnqQ、aurA53 都不含甲酰甲硫氨酸残基，但其保持有完整的生物活性。lnqZ、lnqQ 中甲酰甲硫氨酸残基的去除也不影响其抗菌活性。可见，N 端的甲酰甲硫氨酸残基并不影响无前导肽细菌素的抗菌活性。另外，所有无前导肽细菌素都带2 个～8 个不等的正电荷，有较高的等电点，通常大于9，由于其氨基酸序列的差异，细菌素的亲水疏水作用各不相同。例如，ent7-A 和ent7-B 分别含有44、43 个氨基酸残基，7 个正电荷，等电点分别为10.68、10.95，水溶液中具有高度的结构性。lnqQ 含有53 个氨基酸残基，其中有8 个赖氨酸和4个色氨酸残基，带有8 个正电荷，等电点为10.7。aurA53 含有51 个氨基酸残基，其中10 个赖氨酸和5 个色氨酸残基，带有8 个正电荷，等电点为10.8，对蛋白酶不敏感，在水溶液中呈刚性结构[20]。lsbB 含30 个氨基酸残基，带有6 个正电荷，等电点为10.75[21]。
另外，除lsbB 仅对乳酸乳球菌有活性外，多数无前导肽细菌素有广谱抑菌活性，特别是对食品腐败菌李斯特菌属的微生物。值得注意的是garKS 对革兰氏阴性菌Acinetobacter baumannii B1162 等有抑菌活性，而ent7-A、ent7-B 对革兰氏阴性菌Brevundimonas diminuta 有抑菌活性。部分无前导肽细菌素抑菌谱见表1。
表1 部分无前导肽细菌素的抑菌谱
Table 1 Antibacterial spectrum of part leaderless bacteriocins
注：+表示有抑菌活性；-表示无抑菌活性；--表示未对该属内菌株进行抑菌活性检测。
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4 无前导肽细菌素的抗菌机制
理解细菌素抗菌机制是其能够进行广泛应用的基础和关键，而三维结构的解析对理解细菌素的抗菌机制有重要作用。第一个三维结构被解析的无前导肽细菌素是ent7-A、ent7-B，除此之外，到目前为止，aurA53、lnqQ、lsbB 的三维结构也已获得解析，因此，它们的抑菌机制可认为是无前导肽细菌素抗菌机制的代表。
核磁共振的结构解析显示，ent7-A、ent7-B、aurA53 及lnqQ 具有相似的三维结构，它们的N 末端和C 末端均由两亲性的α-螺旋构成，其三维结构高度折叠，表面含有较高的阳离子，疏水残基位于核心而亲水残基暴露于溶剂，形成亲水的表面区域，但也有某些疏水氨基酸暴露溶剂使其表面形成一定的疏水区域。如aurA53 中所有的赖氨酸残基位于表面，5 个色氨酸中有4 个暴露于表面，形成一定的疏水区域。但lsbB 的三维结构显示其N 末端为α-螺旋，C 末端无结构，在水溶液中呈非结构状态[22]。
通常细菌素通过与靶标细胞膜上的特定受体结合形成“孔道”结构破坏细胞膜或抑制细胞壁的形成，发挥抑菌作用，如羊毛硫细菌素nisin 是通过与靶标细胞膜上的细胞壁合成前体脂质II 绑定形成“孔道”并抑制细胞壁的合成从而抑制细菌生长[23]。细菌素pediocinPA-1 通过与靶标细胞膜上的甘露糖磷酸转移酶绑定形成“孔道”而获得抗菌活性[24]。与大多数细菌素的作用机制不同，无前导肽细菌素ent7-A、ent7-B、aurA53 及lnqQ 发挥抑菌作用却不需要任何受体参与。lnqQ 首先通过静电吸引与带负电的靶标细胞膜结合，然后通过渗透在靶标细胞膜上形成“环形孔”使细胞内容物泄露而杀死细菌[25]，也有报道称细菌素lnqQ并不形成“环形孔”，而是通过羟自由基的积累来杀死靶标细菌的[26]。aurA53 既不需要任何特殊受体，也不形成“孔道”结构，而是渗透到靶标细胞膜后使重要分子泄露、膜电位消失、大分子合成终止而发挥抗菌作用。有研究显示，aurA53 与中性细胞膜的相互作用强于阴性细胞膜，推测其疏水作用在与靶标细胞膜的相互作用过程中发挥重要作用。同样，ent7-A、ent7-B 也是通过静电吸引和疏水作用与靶标细胞膜结合，随后α-螺旋解旋，疏水核暴露并插入膜靶标细胞膜中[27]。然而，研究显示，lsbB 却需要受体介导来发挥抑菌作用，其C末端最外的8 个氨基酸序列为受体结合部分，lsbB 需要与靶标细胞膜上的受体锌依赖的金属肽酶结合，从而导致靶标细胞膜破坏而发挥抗菌作用，但带正电荷的lsbB 与带负电荷的靶标细胞膜之间的静电作用对其与受体的结合有重要影响。由此可见，静电吸引在无前导肽细菌素的抗菌机制中发挥重要作用，所有无前导肽细菌素均带有正电荷，这使其更易与带负电荷的靶标细胞相互作用而减少对特定受体的依赖，可能也是其拥有广谱抗菌活性的原因之一，这种机制与多细胞生物的小阳离子抗菌肽（20 个～40 个残基）的膜渗透作用类似[28]。另外，疏水作用在无前导肽细菌素的抗菌机制中也发挥重要作用，如ent7-A、ent7-B、aurA53 及lnqQ 虽然具有极其相似的三维结构，但由于氨基酸序列的差异仍使其具有不同的抗菌活性，这可能与其不同的疏水作用相关。
5 无前导肽细菌素在食品中的应用
单核细胞增生性李斯特菌（单增李斯特菌）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、芽胞杆菌等都是导致食品污染或腐败的常见微生物。如单增李斯特菌是一种食源性病原菌，其广泛存在于水、土壤、植物中。该菌可污染牛奶、肉制品、蔬菜等食品，在加工运输和冷藏条件下均可生长。单增李斯特菌是人畜共患菌，可引起人和动物脑膜炎、败血症、胃肠炎等疾病，威胁人类生命与健康[29-31]。许多无前导肽细菌素是由食品中分离的微生物产生的，如细菌素aurA53、aurA70、garKS、lsbB是由分离自商品牛奶或奶酪中的微生物产生的，ent7是从碎牛肉中分离到的微生物产生的，welY、welM 是由分离自日本泡菜桶中的微生物产生的，它们很多是食品级乳酸菌产生的，如garKS、lsbB、ent7、welY、welM等，这种特性使其在食品中的应用具有先天的安全性。多数无前导肽细菌素对革兰氏阳性细菌有广泛的抑菌活性，尤其是单增李斯特菌。虽然多数无前导肽细菌素对革兰氏阴性细菌无活性，但与其它抑菌物质的联合使用对很多食源性病原菌有协同抑菌作用。如garK 是由分离自原料牛乳中的乳酸菌Lc. garvieae KS1546 产生的含有3 条肽链的无前导肽细菌素，其与polymyxinB 联合使用对不动杆菌和大肠杆菌有协同抑菌活性，与polymyxinB、nisin 联合使用能够快速杀灭并完全根除不动杆菌和大肠杆菌，与nisin 联合使用对金黄色葡萄球菌有协同作用，与nisin、金合欢醇联合使用在低浓度下能快速根除金黄色葡萄球菌[32]。
另外，无前导肽细菌素没有毒性，易降解而不易残留，耐热、耐酸碱，对某些抗生素抗性菌株有活性。如aurA53 对真核细胞无毒，没有溶血活性，在4 ℃可至少存放48 周，在-20 ℃可保持72 周活性不变，对模拟胃液和胆盐敏感，在模拟胃液3 h 活性丧失87.5%，对胆盐90 min 丧失68.5%。aurA53 对接种单增李斯特菌的脱脂牛奶抑菌试验表明，4 ℃条件下存放7 d 后，与对照相比，aurA53 可使牛奶中的活菌总数减少107.7 CFU/mL，aurA53 可作为保鲜剂应用于牛乳产品[33-34]。ent7 除对单增李斯特菌、梭菌属的细菌有活性外，还对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及耐万古霉素的肠球菌有活性[35]。除此之外，无前导肽细菌素由于其简单的遗传组织使其更易于在其它微生物细胞中表达、更易于通过生物工程手段进行规模化生产、更易于进行分子改造而生产出新型的、更具优势功能的细菌素。如通过在原生产菌株中增加garKS 基因簇的拷贝数，优化培养基成分，优化培养条件使其表达量增加2 000 倍[36]。
6 结论
无前导肽细菌素是由核糖体合成的、N 端不含前导肽序列的一种细菌素，该类细菌素通常含27 个～53 个氨基酸，富含赖氨酸残基而缺少半胱氨酸残基，均带有正电荷，有较高的等电点。根据氨基酸序列的一致性，该类细菌素可分为4 类。无前导肽细菌素具有相似的三维结构，作用于靶标细胞时受特定受体依赖较小，静电作用和疏水作用在抑菌机制中发挥重要作用，多数具有广谱抑菌活性，特别是对食品腐败菌李斯特菌属的微生物。无前导肽细菌素不需要前导肽序列就能生物合成，翻译后不经任何修饰或简单的甲基化即可成为有活性的成熟肽，这种简单的遗传结构更易被其它细菌、真菌或真核细胞表达，有利于通过生物工程进行大规模生产，具有巨大的商业应用潜能，无前导肽细菌素未来会在食品工业及其它领域有更广泛的应用。
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