蜂花粉是工蜂采集植物雄蕊花药或植物小孢子囊内的花粉，加上自己特殊的腺体分泌物、唾液和花蜜初步加工而成的花粉球，呈淡黄色或绿色，味微甜、微苦[1]。向日葵蜂花粉为菊科向日葵属植物向日葵（Helianthus annuus L.）的蜂花粉粉末[2]，是我国蜂花粉大宗交易品之一[3]。向日葵蜂花粉具有提高免疫力、抗衰老及美容养颜等作用[4]，其中主要含有氨基酸、脂类、矿物质、类胡萝卜素[5]、植物甾醇[6]、类黄酮[7]、酚酸衍生物[8]及酚胺类化合物等。其中，酚胺类化合物是一类结构上由酚酰基与多胺或脱胺芳香族氨基酸偶联而成的植物次生代谢产物[9]。酚胺在植物中广泛存在，是植物生殖器官和种子中的主要酚类成分，并作为代谢中间或终产物在植物生长发育和抵御环境伤害方面发挥着重要功能作用[10]。目前，对蜂花粉中酚胺类物质开展的研究相对较少，对向日葵蜂花粉中酚胺类化合物成分解析尚未有文献报道。本研究采用高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，HPLC-Q/TOF-MS）法，对向日葵蜂花粉中的8 种酚胺类化合物进行结构鉴定并进行定量分析，同时比较不同产地向日葵蜂花粉中酚胺类化合物的含量差异，以期为酚胺类成分的生物学活性及药理学作用研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
向日葵（Helianthus annuus L.）蜂花粉：中国农业科学院蜜蜂研究所提供，采集地分别为内蒙古（5 个）、黑龙江（5 个）和宁夏（5 个）。蜂花粉样品采集后于4℃冰箱保存备用。
无水乙醇（分析纯）：北京北化精细化学品有限公司；甲醇（色谱纯）、乙酸（色谱纯）、乙酸（质谱纯）：美国Fisher 公司；三-对-香豆酰亚精胺、四-对-香豆酰精胺：哈尔滨商业大学蜂产品加工与功能评价实验室自制；所有试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
LC-6AD 型高效液相色谱仪：日本岛津公司；6520型四级杆-飞行时间质谱仪：美国Agilent 公司；BSA124S-CW 型分析天平：德国Sartorrius 公司；Merk超纯水系统、0.22 μm 微孔滤膜：美国Merk Millipore 公司；Finnpipette F1 单道移液器：美国Thermo Scientific公司；JECHERS 自动样品制备系统：中国上海净信实业发展有限公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos 型台式离心机：美国Thermo Fisher 公司；2 mL 无菌注射器：中国江苏正康医疗器械有限公司；JC-QXS-4.5L 型数控超声波清洗器：中国昆山市超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蜂花粉样品前处理
准确称取3g 向日葵蜂花粉置于样品管中，用75%乙醇溶解并定容至30 mL。样品管中加入转子后放入自动样品制备系统，于频率60 Hz 条件下运行120 s。后取出转子，蜂花粉悬浊液在5 000 r/min 条件下离心10 min，以除去蜂花粉悬浊液中的固体不溶物。将离心后的上清液倒入试管中，从试管中吸取2 mL 上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤后，用于HPLC 分析。
1.3.2 色谱/质谱条件
色谱条件：色谱柱为Phenomenex Gemini C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为水（含0.2%乙酸），流动相B 为甲醇（含0.2%乙酸）；梯度洗脱程序为0～10 min，5%～20%B；10 min～25 min，20%～24%B；25 min～45 min，24%～30%B；45 min～50 min，30%～38%B；50 min～60 min，38%～40%B；60 min～70 min，40%～42%B；70 min～80 min，42%～44%B；80 min～90 min，44%～46%B；90 min～100 min，46%～48%B；100 min～110 min，48%～50%B；110 min～120 min，50%～52%B；120 min ～130 min，52%～54% B；130 min ～140 min，54%～56%B；140 min～150 min，56%～58%B；总流速为0.7 mL/min；柱温箱温度为36 ℃；检测波长为280 nm；进样量为20 μL。
质谱条件：电离源为电喷雾离子化（electron spray ionization，ESI）；检测模式为正离子扫描；加热温度为350 ℃；离子源喷出电压为4 kV；出口电压为130 V；氮气流速为11 L/min；碰撞气体为氦气。
1.3.3 标准品溶液制备
称取一定质量的反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺（液相法制备，纯度≥95%）、反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺（液相法制备，纯度≥95%）于10 mL 容量瓶中，加入75%甲醇溶解配制成10 mL 标准品储备液。
2 结果与分析
2.1 向日葵蜂花粉中酚胺类化合物的定性分析
向日葵蜂花粉的HPLC 图如图1 所示。
图1 向日葵蜂花粉的高效液相色谱图
Fig.1 Chromatogram of sunflower bee pollen sample
1.顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺；2.顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺；3.反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺；4.顺，顺，顺，顺-四-对-香豆酰精胺；5.反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺；6.反，顺，顺，反-四-对-香豆酰精胺；7.反，反，顺，反-四-对-香豆酰精胺；8.反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺。
分离并检测出向日葵蜂花粉中所含有的8 种酚胺类化合物，这8 种化合物的名称、相对保留时间、紫外光谱最大吸收波长（λmax）、分子量及质谱有关信息详见表1。
化合物1、2、3、5 相对分子质量相同，均为583Da，4 个峰二级质谱断裂相同，见图2。
准分子离子碎片峰584 m/z[M+H]+在断裂1 个香豆酰碎片后，产生分子离子碎片峰438 m/z[M+H]+，而后继续断裂1 个香豆酰碎片产生分子离子碎片峰292 m/z[M+H]+，第3 次断裂1 个香豆酰碎片产生分子离子碎片峰146 m/z[M+H]+，最终相对分子质量145 Da即为亚精胺相对分子质量。由于反式香豆酰属于平面型结构，双键与处于同一平面的苯环容易形成π-π 共轭。对于顺式香豆酰，由于空间位阻，造成双键与苯环处于非平面，不易发生共轭，故而顺式与反式的紫外最大吸收波长略有不同[11]。所以与顺式相比，反式的最大吸收波长位于长波端。化合物1、2、3、5 的最大吸收波长分别是270、280、290、298 nm，分别对应顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺，顺，反-三-对-香豆酰亚
精胺、反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺和反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺。另外，顺式异构体是两个电负性相同的原子或原子团处在分子的同侧，造成偶极矩的叠加，增加不对称性，而不像反式那样比较对称地排列，因而顺式分子的偶极距比反式大，为偶极分子，有较弱的极性。因此顺式出峰时间早于反式，化合物1、2、3、5 分别对应顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺、反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺和反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺。李石飞等[12-14]和LI W C 等[15]运用不同的检测方法在红花中鉴定出4 种亚精胺成分并进行了结构分析，经过比对，向日葵蜂花粉中的4 种亚精胺成分与红花中4 种亚精胺成分吻合。因此，将化合物1、2、3、5 分别鉴定为顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺、反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺、反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺，其分子结构如图3 所示。化合物4、6、7、8 相对分子质量相同，均为786 Da，4 个峰二级质谱断裂相同，见图4。
表1 向日葵蜂花粉酚胺类化合物HPLC-Q/TOF-MS 分析结果
Table 1 Analysis results of phenolamides in sunflower bee pollen by HPLC-Q/TOF-MS
注：[M+H]+为质子化分子离子；[M+Na]+为分子钠的加和离子。
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图2 化合物1、2、3、5 的一级和二级质谱图
Fig.2 Primary and secondary mass spectra of compounds 1，2，3 and 5
（a）、（b）、（c）、（d）分别为化合物1、2、3、5 的质谱图。
图3 鉴定的三-对-香豆酰亚精胺化合物分子结构图
Fig.3 Molecular structures of tri-p-coumaroylspermidines identified
图4 化合物4、6、7、8 的一级和二级质谱图
Fig.4 Primary and secondary mass spectra of compounds 4，6，7 and 8
（a）、（b）、（c）、（d）分别为化合物4、6、7、8 的质谱图。
准分子离子碎片峰787 m/z[M+H]+在断裂第1 个香豆酰碎片后产生分子离子碎片峰641 m/z[M+H]+，而后继续断裂第2 个香豆酰碎片产生分子离子碎片峰495 m/z[M+H]+，第3 次断裂1个香豆酰碎片产生分子离子碎片峰349 m/z[M+H]+，第4个分子离子碎片204 m/z[M+H]+为1 个香豆酰与3 个烷基的组合断裂。
图5 鉴定的四-对-香豆酰精胺化合物分子结构图
Fig.5 Molecular structures of tetra-p-coumaroylspermines identified
鉴于目前尚未有关于四-对-香豆酰精胺的文献报导，故而依据上述分子量为583 Da 的三-对-香豆酰亚精胺的结构推导过程，对分子量为786 Da 的四-对-香豆酰精胺进行合理推测，化合物4、6、7、8 分别为顺，顺，顺，顺-四-对-香豆酰精胺、反，顺，顺，反-四-对-香豆酰精胺、反，反，顺，反-四-对-香豆酰精胺、反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺，其分子结构如图5所示。
2.2 向日葵蜂花粉中酚胺类化合物的定量分析
将反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺、反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺标准品储备液以5、10、15、20、25 μL 进样量进行HPLC 色谱分析，以峰面积为纵坐标，上样量（mg）为横坐标建立标准品标准曲线，标准品的线性回归方程和相关系数见表2。通过外标法测定不同产地向日葵蜂花粉中8 种酚胺类化合物的含量（详见表3）。其中，顺，顺，顺-三-对-香豆酰亚精胺、顺，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺、反，顺，反-三-对-香豆酰亚精胺含量以反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺计；顺，顺，顺，顺-四-对-香豆酰精胺、反，顺，顺，反-四-对-香豆酰精胺、反，反，顺，反-四-对-香豆酰精胺含量以反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺计。
由表3 可知，采收自3 个不同产地的向日葵蜂花粉中都含有上述8 种酚胺类成分，但其含量具有一定的差异性。4 种三-对-香豆酰亚精胺的总含量以黑龙江最高为21.88 mg/g，其次是内蒙古为19.13 mg/g，宁夏最少为11.61 mg/g。在4 种三-对-香豆酰亚精胺中，以反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺的含量最高，其含量分别为内蒙古8.37 mg/g、黑龙江9.16 mg/g、宁夏5.67 mg/g。4 种四-对-香豆酰精胺的总含量以内蒙古最高为7.2 mg/g，其次是黑龙江为4.4 mg/g，宁夏最少为4.3 mg/g。在4 种四-对-香豆酰精胺中，以反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺的含量最高，其含量分别为内蒙古2.76 mg/g、黑龙江1.98 mg/g、宁夏1.95 mg/g。结果显示，3 个产地的向日葵蜂花粉中反，反，反-三-对-香豆酰亚精胺和反，反，反，反-四-对-香豆酰精胺的含量均高于其另外3 种异构体形式化合物含量，这可能与其化学结构的稳定性有关。
表2 标准品线性回归方程和相关系数
Table 2 The linear regression equations and correlation coefficient sof standard compounds
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表3 不同产地向日葵蜂花粉中8 种酚胺类化合物含量
Table 3 Contents of eight phenolamine compounds in sunflower bee pollens from different province
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3 结论
本研究采用HPLC-QTOF-MS 法共鉴定出向日葵蜂花粉中存在的8 种酚胺类化合物，包括4 种三-对-香豆酰亚精胺和4 种四-对-香豆酰精胺。这是首次在向日葵蜂花粉中鉴定出这8 种酚胺类化合物。这些酚胺类化合物是一种带正电荷的小分子[16]，不仅存在于蜂花粉中，在大米[17]和一些中药材[18-20]中也有发现。酚胺类化合物有多种生物功能，例如在人体中，酚胺类化合物水平会随着年龄的增长而下降，内源性亚精胺浓度的降低和衰老之间可能存在联系[21]。最近的流行病学数据显示，增加多胺水平，包括提高膳食摄入量，通过诱导自噬机制延缓了衰老。酚胺类化合物，被看作“抗衰老维生素”[22]。此外，定量分析结果还为后期酚胺类成分的生物学活性及其药理学作用的研究提供了基础。
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