板栗，隶属于板栗属和壳斗科，又叫中国板栗、栗子等。板栗最早起源于中国，是我国重要的经济果树，《论语》中就有“夏后氏以松，殷人以柏，周人以栗”的记载，这就说明了我国板栗的栽培已有4 000 多年的历史。板栗是众多经济价值较高的干果之一，它的淀粉含量高，是必需脂肪酸、矿物质、维生素和膳食纤维的良好来源[1]，特别是板栗中的蛋白质含量高于稻米，其中的异亮氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和颉氨酸等氨基酸的含量丰富[2]。板栗是一种营养价值较高的药食同源的植物，明朝的李时珍曾在《本草纲目》中记载“栗治肾虚、腰腿无力，能通肾益气，厚肠胃也，肾主大便，栗能主肾”[3]。发酵是广泛应用在食品工业中的一种技术，不仅可以改善风味，也有助于保存和提高食品的营养价值[4]。黄酒又称为米酒，是我国传统的酒精饮料，常以糯米作为原料，由传统米酒曲经有益微生物发酵而成[5]，它因香气浓郁、口感柔和、酒精度低、营养价值高而在中国流行了几千年。
作为板栗种植大国，我国板栗的生产和出口一直位居世界第一。然而，由于缺乏对产品的深加工技术，板栗通常就只作为原料出口，属于低附加值产品[6]，而且板栗不耐贮藏，随着贮藏时间的延长，板栗内的营养成分会发生变化[7]。目前对板栗的深入开发利用正在逐步开展，例如开发板栗饮料[8]、板栗清酒[9]和板栗制酱[10]，以及利用纳豆芽孢杆菌发酵板栗，使发酵后的板栗中总酚、总黄酮和维生素C 的含量显著提高[11]。淀粉是板栗的主要成分，其含量高达70%，其中支链淀粉含量约为50%左右[12]，如果以板栗为原料酿造特种黄酒，板栗中的淀粉和其他营养成分将被充分利用并且能够改善黄酒的特性。板栗黄酒因其独特的风味和丰富的营养价值而具有较高的经济价值，目前关于板栗黄酒的研究较少，对于其发酵工艺并没有进行系统的优化。因此，本文借鉴了传统的黄酒发酵技术对板栗黄酒的发酵工艺进行系统的优化，通过单因素和正交试验得到其最佳工艺配方，并对其中的游离氨基酸进行测定，这为板栗资源的精深加工开辟了新的方向并奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
早丰板栗：河北迁西县；糯米：市售；红曲：浙江丽水生物科技公司；小曲：湖南华伟铭化工科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HL-10D 蒸饭柜：浙江宁波赵记电器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；FE20 pH 指示计：梅特勒-托利多仪器有限公司；CJM-2474 酒精计：河北省冀州市耀华器械仪表厂；L530 台式低速离心机：湖南湘仪仪器设备有限公司；L-8900 型氨基酸自动分析仪：日本日立公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 工艺操作要点
1.3.2.1 原料的选择
筛选出大小均匀，颗粒饱满的糯米。挑选出无腐烂变质的板栗。
1.3.2.2 原料的预处理
板栗去皮后清洗干净，随后将板栗仁切碎直至无大颗粒。糯米经清洗后，在室温16 ℃～18 ℃下浸泡16 h后捞取沥干。将板栗与糯米按比例放入蒸饭柜中，在100 ℃下蒸45 min。将红曲和小曲分别在22 ℃适量的水中浸泡2h。
1.3.2.3 冷却搅拌
将蒸熟后的板栗和糯米立即取出放在无菌纱布上，用冷水将其淋冷至30 ℃左右为止。将板栗和糯米按比例与浸泡好的红曲和小曲一起搅拌至均匀。
1.3.2.4 糖化和主发酵
将搅拌均匀后的板栗和糯米放入陶罐中搭窝，再用3 层无菌纱布覆盖，在20 ℃下恒温培养96 h 后再加入1.5 倍体积的水冲缸进行主发酵，并且每隔8 h 进行1 次搅拌。
1.3.2.5 陈酿
经过主发酵的板栗黄酒，用无菌纱布进行粗过滤，过滤后的酒在15 ℃低温下进行陈酿，促进酒体的澄清和稳定。
1.3.2.6 煎酒
煎酒的目的就是为了灭菌，将陈酿后的板栗黄酒在65 ℃的条件下煎酒20 min 再进行装瓶。
1.3.3 单因素试验
在经过预试验的基础上，将板栗黄酒发酵的初始条件设为：主发酵温度为20 ℃、小曲添加量为0.7%、红曲添加量为13%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为8 d。为了优化板栗黄酒的发酵工艺，按照上述的工艺流程，首先对主发酵温度（16、18、20、22、24 ℃）、小曲的添加量（0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%）、红曲的添加量（10%、11%、12%、13%、14%）、糯米/板栗质量比（4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2）和主发酵时间（6、7、8、9、10 d）进行单因素试验，以感官评分为评价指标筛选出影响显著的因素。
1.3.4 正交优化试验
在单因素试验的基础上，筛选出影响显著因素进行L9（34）的正交试验，并以感官评分为评价指标获得板栗黄酒的最佳发酵条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation condition optimization
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1.3.5 感官评价
评价小组由10 名专业人员（5 男，5 女）组成，每个指标分别评分，所有指标综合作为总分。要求评价小组成员每天对板栗黄酒进行评分，以评价小组评分的平均值作为评价结果，板栗黄酒的评分规则见表2。
1.3.6 理化指标的测定
酒精度、总糖、总酸、氨基酸态氮和pH 值参照国家标准GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法进行测定[13]。酒精度：蒸馏法；总糖：亚铁氰化钾滴定法；总酸：电位滴定法；氨基酸态氮：甲醛滴定法。
表2 板栗黄酒的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of chestnut rice wine
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1.3.7 游离氨基酸的测定
板栗黄酒中的游离氨基酸参照国家标准GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法进行测定[14]。取10 mL 酒样于30 mL 的水解管中，加入15 mL 6 mol/L 的盐酸溶液，随后冷冻5 min 再抽真空后充入氮气封口。水解管放入电热鼓风恒温箱中水解22 h 后冷却至室温16 ℃～18℃，水解液随后过滤到50 mL 容量瓶中并用蒸馏水定容至刻度线处。取1 mL 滤液于15 mL 的试管中，用平行蒸发仪减压干燥至蒸干状态，随后加入2 mL pH2.2 柠檬酸钠缓冲溶液到试管中，振荡摇匀后，吸取溶液通过0.22 μm 的滤膜再移至氨基酸自动分析仪的进样瓶中进行测定。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 主发酵温度的确定
在小曲添加量为0.7%、红曲添加量为13%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为8 d 的条件下，考察主发酵温度在16 ℃～24 ℃范围内对感官评分的影响，结果见图1。
温度最主要是通过作用在微生物生长代谢的酶系从而影响发酵的进行。发酵温度在一定的时间段内越高，糖化、发酵速度就会越快，发酵的时间也就会相应的缩短，从而导致在较短的时间内发酵液中的总糖和酒精就会得到大量的积累[15]。由图1 可知，随着发酵时间的增加，感官评分也在逐渐增加，并在不同的温度下在第7 天达到最大值。由于低温发酵不仅可以减少香气的损失，还可以提高酒精的产量，因此本试验选择16、18、20、22、24 ℃。在相同的试验条件下，在不同温度下发酵的板栗黄酒，自第7 天后，其感官评分趋于相同。因此，这说明主发酵温度对于板栗黄酒的发酵来说，不是显著的影响因素。
图1 不同主发酵温度对发酵的影响
Fig.1 Effect of different main fermentation temperature on fermentation
2.1.2 小曲添加量的确定
在主发酵温度为20 ℃、红曲添加量为13%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为8 d 的条件下，考察小曲添加量在0.5%～0.9%范围内对感官评分的影响，结果见图2。
曲，是利用微生物的发酵作用，将小麦、大米、豆类等分解成食品原料的制品[16]。而小曲是使用米粉、米糠等材料，有的还添加了一些中草药，再接入种曲，加入适量的水并在合适的温度、湿度下培养而成[17]。由图2 可知，在不同小曲的添加量中，0.8%和0.9%的发酵体系，由于初始小曲含量较高，产生的酒精和香气等成分越来越多，其感官评分在最初阶段分数较高。但是随着后期酵母菌早衰发生自溶现象，导致发酵提前终止，酒精的生成量就会减少，感官评分就会变低。因此，当小曲添加量为0.7%时，更利于板栗黄酒的发酵。
图2 不同小曲添加量对发酵的影响
Fig.2 Effect of different Xiao Qu content on fermentation
2.1.3 红曲添加量的确定
在主发酵温度为20 ℃、小曲添加量为0.7%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为8 d 的条件下，考察红曲添加量在10%～14%范围内对感官评分的影响，结果见图3。
图3 不同红曲添加量对发酵的影响
Fig.3 Effect of different Hong Qu content on fermentation
由图3 可知，在最初发酵的时间里，红曲的含量越高，酒体的香气和酒精产生的越多，但随着发酵时间的延长，不同红曲添加量的感官评分在第7 天都达到了最大值。由于过多的红曲在发酵的后期可能会产生一些抑菌生理活性物质，进而就会抑制酵母的生长发酵，最终会导致发酵后期酒体的感官评分降低[18]。不同的红曲添加量对板栗黄酒的发酵时间有影响，但在发酵结束后，板栗黄酒的风味差异不大，因此，当红曲的添加量为12%时，更利于板栗黄酒的发酵。
2.1.4 糯米/板栗质量比的确定
在主发酵温度为20 ℃、小曲添加量为0.7%、红曲添加量为13%、主发酵时间为8 d 的条件下，考察糯米/板栗质量比在4 ∶6～8 ∶2 的范围内对感官评分的影响，结果见图4。
图4 不同糯米/板栗质量比对发酵的影响
Fig.4 Effect of different glutinous rice/chestnut quality ratio on fermentation
糯米与板栗淀粉中的支链淀粉含量较高，这就在蒸煮的过程易于糊化，并且会使酒的风味增加醇厚感。但由于板栗中的蛋白质和脂肪的含量较为丰富[19]，应将板栗和糯米按比例配比，再用于酿酒原料中。由图4 可知，在糯米/板栗质量比例在4 ∶6、5 ∶5 和6 ∶4时，由于存在蛋白质的含量较高，这就会导致原料的消化性变弱、细菌会过度繁殖产酸，并且还会导致酒体浑浊，进而导致其感官评分显著低于糯米/板栗质量比为7 ∶3 和8 ∶2 的酒。但当酒中的糯米含量较高时候，整体就会缺乏板栗黄酒特有的板栗香气和甘甜风味，所以糯米/板栗质量比为7 ∶3 时的感官评分最高。
2.1.5 主发酵时间的确定
在主发酵温度为20 ℃、小曲添加量为0.7%、红曲添加量为13%、糯米/板栗质量比为7 ∶3 的条件下，考察主发酵时间在6 d～10 d 范围内对感官评分的影响，结果见图5。
图5 不同主发酵时间对发酵的影响
Fig.5 Effect of different main fermentation time on fermentation
在板栗黄酒发酵前期，发酵液中的糖含量较低，酵母菌也未大量繁殖，故导致酒精和风味物质形成较少。在上述其他因素对感官评分的影响再结合图5 可知，随着主发酵时间的增加，感官评分呈先升高后降低的趋势，不同主发酵时间之间的感官评分差距明显。主发酵时间较短，发酵不完全，原料的利用率和酒体的风味也较低；但主发酵时间较长，酵母的活力就会衰退，霉菌会因繁殖过量而导致它自身的衰落并自溶，这就会使酒的酸味和苦味明显[20]，导致感官评分较低。因此，板栗黄酒的主发酵时间为7 d 时的感官评分最高。
2.2 正交试验的结果与分析
在单因素试验的基础上，筛选出的3 个显著影响因素进行正交试验，以优化板栗黄酒的最佳配方。正交试验的结果见表3，方差分析见表4。
表3 发酵工艺优化正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results of fermentation process optimization
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表4 方差结果分析
Table 4 Analysis of variance results
注：**表示差异极显著P＜0.01，*表示差异显著P＜0.05。
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由表3 和表4 可知，因素A、B、C 均是显著影响因素，影响板栗黄酒感官评分的最主要因素是小曲的添加量，其次是糯米/板栗质量比和主发酵时间。通过比较3 个因素的k1、k2 和k3 值，确定了以A2B3C2 为最佳组合，即板栗黄酒发酵工艺的最佳条件为小曲添加量为0.7%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为7 d。
2.3 正交试验结果验证试验
对优化后的板栗黄酒发酵工艺进行验证试验，工艺参数以主发酵温度20 ℃、小曲添加量0.7%、红曲添加量13%、糯米/板栗质量比7 ∶3、主发酵时间7 d，设计3 组平行试验，对发酵结束后的酒样进行感官评分的测定，其结果见表5，验证试验中的3 组实测值与预测值之间的相对偏差均小于5%，得到平均感官评分为92.53，符合正交试验的结果，并且各指标均好于基础试验。
表5 正交试验的验证结果
Table 5 Verification results of orthogonal test
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2.4 理化指标
板栗黄酒的理化指标见表6。
表6 板栗黄酒的理化指标
Table 6 Physical and chemical indexes of chestnut rice wine
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由表6 可知，根据板栗黄酒的最佳发酵条件酿造出的黄酒，各项理化指标均符合国家标准。
2.5 氨基酸分析
板栗黄酒中游离氨基酸分析结果见表7。
表7 板栗黄酒中游离氨基酸分析结果
Table 7 Free amino acid analysis results of chestnut rice wine
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氨基酸在黄酒中不仅充当营养成分，它还可以作为香气化合物的前体，直接促进了黄酒的风味[21]。由表7 可知，在板栗黄酒中共测出16 种氨基酸，总含量为0.573 g/100 g。其中必需氨基酸共有6 种，含量为0.187 g/100 g，占总含量的32.64%；非必需氨基酸共10 种，含量为0.388 g/100 g，占总含量的67.71%。与市售陈酿5年的干型黄酒中的氨基酸含量0.404 g/100 g 相比，板栗黄酒的氨基酸含量明显高于传统黄酒，其中必需氨基酸含量约是普通黄酒的1.4 倍。特别是，板栗黄酒中的天冬氨酸和谷氨酸分别是普通黄酒的3.5、4 倍。
3 结论
本文以感官评价分数为指标，在单因素的基础上，筛选出的影响显著因素进一步优化板栗黄酒发酵工艺，得到的最佳条件：主发酵温度为20 ℃、小曲的添加量为0.7%、红曲的添加量为13%、糯米/板栗质量比为7 ∶3、主发酵时间为7 d。按照此工艺酿造的板栗黄酒的实际感官评分为92.53，与预测值相比，相对偏差小于5%，并且其各理化指标符合国家标准，口感醇厚、风味独特，营养成分丰富，氨基酸含量明显高于传统黄酒。
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