灰树花（Grifola frondosa）别名贝叶多孔菌，俗称“舞菇”，是一种十分有价值的食药用真菌，其子实体和菌丝体中均含具有多种药理作用及生物活性的物质——灰树花多糖[1-3]。灰树花多糖是灰树花主要活性成分之一，是一种由葡聚糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖及少量蛋白质组成的杂多糖。其结构多为β-1，3-葡聚糖，少量为α-1，4-葡聚糖、α-1，6-葡聚糖[4-5]。其中β-1，3-葡聚糖能极大地提高人体免疫力，且具有强大的自由基清除能力[6]。随着生活水平的日益提高，人们越来越注重健康，也更加提倡天然健康食品。因此，具有调节身体机能、预防疾病的灰树花多糖逐渐受到关注[7]。
灰树花多糖以其独特的食药用价值迅速成为研究的热点，而高效的提取方法成为其研究的关键。目前多糖的提取方法主要有超声提取法、生物酶提取法、微波提取法等[8-9]。与现有方法相比较，超声提取法具有操作简单、提取率高，对设备要求较低，提取耗时短等特点，在真菌多糖的工业生产中有较大应用潜力[10-12]。近年来，有关灰树花多糖提取优化的研究主要以响应曲面法和正交试验法为主，未见采用均匀设计法进行提取条件优化。均匀设计法可自动将各试验因素进行分类和排序，能减少试验次数，提高优化进程。程凯凯等[13]采用均匀设计法对泰山赤灵芝多糖的提取工艺进行优化，结果表明优化后的提取条件稳定性更好，多糖提取率更高。为了更加高效地提取灰树花β-葡聚糖，本试验采用均匀设计法对灰树花多糖超声波辅助提取工艺进行优化，旨在获得高提取率的优化设计方案，加快灰树花多糖在医疗保健、医药、农业、食品等方面的开发利用[14]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
灰树花菌种（HZ-01）：陕西省食药用菌工程技术研究中心提供；葡萄糖（分析纯）、蛋白胨（分析纯）、KH2PO4（分析纯）、MgSO4（分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；琼脂（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；VB1：华中药业有限公司；土豆：市售。
RE-6000A 型旋转蒸发仪：上海亚荣仪器设备有限公司；SW-CJ-1D 型单人超净工作台：上海苏净实业有限公司；YXQ-LS-50S 型高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ5200DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV2550 型紫外分光光度计：日本岛津公司；XO-SM100 超声波微波协同反应工作站：南京先欧仪器制造有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的配制
基础培养基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，VB1 10.0 mg/L，琼脂19.0 g/L，pH 自然。
发酵培养基：土豆200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，VB110.0 mg/L，琼脂19.0 g/L，pH 自然。
1.2.2 菌种活化
在无菌操作台中，用手术刀取0.5 cm2 保藏菌种于25 ℃恒温培养，待菌丝长满平板后取出，置于4 ℃冰箱内保存备用。
1.2.3 灰树花多糖的超声提取工艺
将灰树花菌丝体置于烘箱中，60 ℃烘干至恒重，24 000 r/min 粉碎1 min，过40 目筛，称取灰树花菌丝体粉末10.0 g，按照水料比5∶1（mL/g），加入超纯水，调节pH 值，在一定的超声功率下提取一定时间，抽滤，按照此法提取若干次，合并滤液真空浓缩，加入3 倍体积的无水乙醇，冷藏过夜，收集沉淀物，去除乙醇得到灰树花粗多糖[15]。
1.2.4 单因素试验
在1.2.3 工艺条件下，分别比较不同浸提次数（1、2、3、4、5 次）、不同提取时间（15、35、55、75、95、115 min）、不同提取温度（26、45、60、75、90、105 ℃）对灰树花多糖和β-葡聚糖提取率的影响。
1.2.5 均匀设计试验
根据均匀设计试验原理，在预试验的基础上，结合单因素试验结果，选取超声波功率（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）和水料比（X4）为考察对象，以灰树花多糖提取率（Y1）和β-葡聚糖提取率（Y2）为考察指标，采用四因素七水平均匀试验分析法确定其最佳提取工艺条件，并对所获得试验结果进行验证。试验因素水平编码见表1。
表1 试验因素及水平
Table 1 Factors and levels
?
1.2.6 灰树花多糖含量及提取率测定
多糖含量采用苯酚-硫酸法[17]测定，以葡萄糖为标准品制作标准曲线[16]，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y1=0.062 9x-0.045 7，R2=0.997，由回归方程计算得出多糖含量。
多糖提取率/%=多糖含量/灰树花菌丝体粉末质量×100。
1.2.7 灰树花菌丝体β-葡聚糖含量及提取率测定
β-葡聚糖含量采用刚果红法[19]测定，以β-葡聚糖为标准品制作标准曲线 [18]，β-葡聚糖含量为横坐标，β-葡聚糖溶液吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y2=0.282 8x-0.252 1，R2=0.998。由回归方程计算得出β-葡聚糖含量。
β-葡聚糖提取率/（mg/g）=β-葡聚糖含量/灰树花菌丝体粉末质量。
1.2.8 体外抗氧化活性的测定
取浓缩后的提取液分别进行还原能力、DPPH 自由基清除能力及羟自由基清除能力测定。
1.2.8.1 还原能力测定
参考铁氰化钾还原法[20]，将待测样品用双蒸水分别配制成不同浓度梯度，取1 mL 依次加入2.5 mL pH 6.6 磷酸缓冲液、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混合均匀后于50 ℃水浴锅中反应20 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，于离心机中4 ℃，3 000 r/min 离心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 超纯水、2.5 mL 0.1%的三氯乙酸溶液，以蒸馏水代替上述操作中的铁氰化钾溶液为空白组，静置10 min 测定样品在700 nm 处的吸光度值。以抗坏血酸VC 作为阳性对照，重复3 次取平均值。
1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力的测定
参考DPPH 清除法[21]，将待测样品用双蒸水分别配制成不同浓度梯度，取2 mL 加入2 mL 0.1 mmol/L、95%乙醇配制的DPPH 溶液，混合均匀，暗反应30 min后5 000 r/min 离心5 min，取上清液在519 nm 处测定吸光值，以双蒸水代替上述操作中的样品溶液为空白组。以抗坏血酸VC 做阳性对照，重复3 次取平均值。并按下列公式计算DPPH 自由基清除率。
式中：AX 为2 mL DPPH 溶液+2 mL 双蒸水吸光值；AX0 为2 mL DPPH 溶液+2 mL 样品溶液吸光值；A0为2 mL 95%乙醇溶液+2 mL 样品溶液吸光值。
1.2.8.3 羟自由基清除能力的测定
参考羟自由基清除法[22]，将待测样品用双蒸水分别配制成不同浓度梯度，取0.5 mL 样品溶液分别加入0.5 mL 6 mmol/L 硫酸亚铁溶液、0.5 mL 9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液和0.5 mL 8.8 mmol/L 过氧化氢溶液，混合均匀，于37 ℃反应15 min，在波长510 nm 处测定吸光值，以双蒸水作为空白，同时以蒸馏水替代H2O2 作为损伤组，抗坏血酸VC 作阳性对照，重复3 次取平均值。
式中：AX 为0.5 mL 样品溶液+0.5 mL 硫酸亚铁溶液+0.5 mL 水杨酸－乙醇溶液+0.5 mL 过氧化氢溶液的吸光值；AX0 为0.5 mL 样品溶液+0.5 mL 硫酸亚铁溶液+0.5 mL 水杨酸－乙醇溶液+0.5 mL 双蒸水的吸光值；A0 为0.5 mL 双蒸水+0.5 mL 硫酸亚铁溶液+0.5 mL水杨酸－乙醇溶液+0.5 mL 过氧化氢溶液的吸光值。
1.3 数据处理
采用Excel2013、SPSS22.0 软件和GraphPadPrism 7软件进行数据统计、处理分析和作图，结果取3 次试验的平均值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
不同浸提次数对多糖提取率的影响见图1。
图1 不同浸提次数对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of different extraction times on polysaccharide extraction rate
由图1 可知，随着浸提次数的增加，多糖和β-葡聚糖提取率增加。浸提2 次时的提取率与3、4、5 次时相差不大，且与第1 次相比提取率有所提升，但提取次数的增加也会带来原料成本的增加，因此综合考虑选择浸提2 次。
不同提取时间对多糖提取率的影响见图2。
图2 不同提取时间对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of different extraction time on polysaccharide extraction rate
图2 表明，提取时间对灰树花多糖和β-葡聚糖提取率的影响呈先增加后降低的趋势。多糖提取率和β-葡聚糖提取率均随着时间的增加而增长，在提取时间达到70 min 时，多糖提取率和β-葡聚糖提取率均达到最高，分别为19.243%和2.531 mg/g，而长时间的超声波易使多糖的降解大于多糖的浸出，导致多糖含量降低。因此均匀设计试验选取60 min～90 min 进一步优化工艺参数。
不同提取温度对多糖提取率的影响见图3。
图3 表明，随着提取温度的升高，多糖含量逐渐上升，但过高的温度易导致大分子多糖断裂，影响多糖提取的增加量，因此多糖提取率降低。结果显示，当待测样品在室温（26 ℃）条件下时，提取率最低；当提取温度达到60 ℃时，多糖和β-葡聚糖提取率最高，分别为20.287%和2.816 mg/g，其中多糖提取率是室温时的1.8 倍，β-葡聚糖提取率为室温时的3.2 倍。因此均匀设计试验选取40 ℃～70 ℃进一步优化工艺参数。
图3 不同提取温度对多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of different extraction temperatures on polysaccharide extraction rate
2.2 均匀设计试验结果与分析
2.2.1 试验结果
均匀设计试验方案结果处理与分析见表2。
表2 均匀设计试验结果
Table 2 Uniform experimental design and results
?
根据表2 各参数的多糖提取率和β-葡聚糖提取率试验结果，分别经SPSS 22.0 统计软件进行均匀设计二次回归多项式逐步回归分析，得到相应回归模型Y1 和Y2：
方差分析见表3、表4。
表3 Y1 方差分析
Table 3 Y1 analysis of variance
?
Y1 相关系数R=0.998，F=455.452，P=0.000 02，方程具有显著意义，说明方程拟合度高，各因素交互作用对多糖提取率的影响大小为
X3X4，其中X1 和X2、X1 和X4、X3 和X4 存在交互作用，X3 和X4 呈正相关，X1 和X2、X1 和X4 呈负相关，对方程进行规划求解，Y1 值最大者为最佳，得到超声波辅助提取灰树花多糖工艺的最佳参数为：浸提2 次，提取时间64 min，超声波功率476 W，提取温度43 ℃，水料比31∶1（mL/g），Y1MAX=23.190%；Y2 相关系数R=0.997，F=306.315，P=0.0004，表明回归方程拟合度高，且具有统计学意义，各因素交互作用对多糖提取率的影响大小为
，X1 和X2、X1 和X4、X3和X4 存在交互作用，其中X1 和X2、X3 和X4 呈正相关，X1 和X4 呈负相关，对方程进行规划求解，Y2 值最大者为最佳，得到超声波辅助提取β-葡聚糖工艺的最佳参数为：浸提2 次，提取时间74 min，超声波功率452 W，提取温度68 ℃，水料比28∶1（mL/g），Y2MAX=3.061 mg/g。
表4 Y2 方差分析
Table 4 Y2 analysis of variance
?
2.2.2 工艺验证
按1.2.3 方法进行验证试验，选取上述最佳工艺参数进行提取，考虑实际操作情况，将多糖最佳超声波辅助提取功率修正为500 W；将β-葡聚糖最佳超声波辅助提取功率修正为450 W。多糖提取率分别为23.832%、23.023%和22.311%，平均值为23.055%；β-葡聚糖提取率分别为3.092、2.976、3.023 mg/g，平均值为3.030 mg/g；均与预测参数值接近，相对误差分别为0.58%和1.013%，可知结果优化后试验结果准确，且重复性好。
2.3 抗氧化活性分析
物质的还原力越高，表明其抗氧化性越好[23]。不同浓度的灰树花多糖组分的还原能力效果如图4 所示。
图4 多糖还原能力
Fig.4 Polysaccharide reduction ability
由图4 可知，样品的还原能力随着样品浓度的增加而逐渐增强，当浓度达到2.5 mg/mL 时，样品的OD700 nm值为0.561±0.005，表明其抗氧化性效果明显。灰树花多糖成分还原能力低于阳性对照VC 的还原能力。
EC50 是指清除率为50%时物质的质量浓度，物质EC50 值低于10 mg/mL 时，表明其抗氧化性良好[24]。不同浓度的灰树花多糖组分对DPPH 自由基的清除效果如图5 所示。
图5 DPPH 自由基清除能力
Fig.5 DPPH free radical scavenging ability
由图5 可知，灰树花多糖对DPPH 自由基清除能力随样品浓度的升高而增大。当样品清除率为50 %时，其质量浓度为0.796 mg/mL，即EC50 为0.796mg/mL，因此灰树花多糖具有较好的DPPH 自由基清除能力，具备较好的抗氧化能力。
羟基的化学性质极为活泼，是对机体危害最大的自由基[25]。不同浓度的灰树花多糖组分对羟自由基的清除效果如图6 所示。
图6 羟自由基清除能力
Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability
由图6 可知，样品对羟自由基具备一定的清除能力，且清除率明显高于阳性对照VC 对羟自由基的清除效果。多糖样品的清除能力随浓度的增大而增大，呈量效关系。
3 结论
试验对灰树花多糖的提取工艺进行优化研究，通过单因素试验结合均匀设计试验优化了提取工艺，获得最佳超声波辅助提取工艺：浸提2 次，提取时间64 min，超声波功率500 W，提取温度43 ℃，水料比31∶1（mL/g），在此条件下，灰树花多糖的提取率为23.055%；β-葡聚糖的提取工艺为：浸提2 次，提取时间74 min，超声波功率450 W，提取温度68 ℃，水料比28∶1（mL/g），在此条件下的提取率为3.030 mg/g；此外，对提取的灰树花多糖进行了抗氧化活性研究。结果表明，灰树花多糖具备一定的抗氧化活性，灰树花多糖的还原力OD700 mn 值为0.561±0.005，DPPH 自由基清除率为58.27%，羟自由基的清除率为89.58%，其总还原力和DPPH 自由基清除率略低于对照组，但存在线性量效关系。
本试验采用均匀设计法对灰树花多糖超声波提取工艺进行优化，工艺优化结果经验证，方法稳定可行，提取时间耗时短，对仪器设备的要求低，节约成本的同时也简化了流程，可为灰树花多糖的工业化生产提供科学的数据参考。
[1] 张冰茹,邬雨季,刘维明,等.灰树花多糖的制备及药理活性的研究进展[J].食药用菌,2019,27(2):99-105.
[2] 薛小兰, 陈少美.灰树花多糖提取工艺研究[J]. 福建农业科技,2019(1):30-32.
[3] 刘姗姗,孟丽,赵姣姣,等.泰山灰树花母种及液体菌种最佳培养条件的研究[J].食品研究与开发,2018,39(14):177-181.
[4] 刘诗瑶.灰树花对米糠多糖的酶法改性及活性研究[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2018:8.
[5] 李炳功,耿伟涛,赵琰,等.灰树花液态深层发酵条件研究[J].中国酿造,2018,37(4):61-65.
[6] 陈沛,刘会平,孙娜新,等.灰树花多糖的分离纯化及其体外抗肿瘤活性[J].现代食品科技,2018,34(6):107-114.
[7] 钟敏,汤庆莉,吴天祥,等.天麻醇提物对灰树花发酵菌丝体多糖及β-葡聚糖合成量的影响[J]. 食品科学技术学报,2019,37(1):47-53,61.
[8] 陈少美,薛小兰.菌草灰树花蛋白质提取工艺优化研究[J].福建农业科技,2018(2):30-32.
[9] 季宏更,郑惠华,全卫丰,等.灰树花液体发酵及多糖提取优化研究[J].食用菌,2018,40(1):21-23,27.
[10] 张医芝. 灰树花菌丝体液体深层发酵工艺优化及降血糖和抗肿瘤活性研究[D].长春:吉林大学,2017:5-8.
[11] 杨浣漪,崔美林,金成日,等.灰树花发酵产β-葡萄糖苷酶和胞内多糖培养基及条件优化[J].中国食品学报,2017,17(5):90-98.
[12] 张毅,吴飘,舒杰,等.灰树花多糖微波协同提取工艺研究[J].广州化工,2017,45(2):47-48.
[13] 程凯凯,郝继伟.均匀设计法优化超声提取泰山赤灵芝多糖工艺[J].食品研究与开发,2014,35(21):40-43.
[14] 陈潇筱.发酵环境影响灰树花菌丝体生长和多糖合成的研究[D].镇江:江苏大学,2016:5-8.
[15] 金凌云,华正根,李晔,等.灰树花粗多糖的提取方法比较及其分离纯化[J].菌物研究,2015,13(1):41-46.
[16] 孙耀.灰树花多糖的提取、纯化、分离及体内生物利用度的研究[D].长春:吉林大学,2019:8-10.
[17] 钟敏.天麻醇提物对灰树花菌丝体β-葡聚糖及发酵液成分的影响研究[D].贵阳:贵州大学,2018:43-42.
[18] 蔡天革,侯倩倩,唐凤德.燕麦麸皮β-葡聚糖的提取优化研究[J].辽宁大学学报(自然科学版),2017,44(4):351-356.
[19] 吴小燕.刚果红法测定燕麦β-葡聚糖的机理探讨[D].福州:福州大学,2016:18-19.
[20] 孙欣怡. 灰树花胞外多糖和胞内锌多糖的提取优化及抗氧化研究[D].济南:山东农业大学,2014:18.
[21] 解修超,刘军生,罗阳兰,等.4 株姬松茸胞外多糖含量和生物活性的对比分析[J].食品研究与开发,2019,40(12):68-75.
[22] 冯尚坤,徐海菊.灰树花菌丝体多肽的制备及其体外抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2009,30(2):47-50.
[23] ZHANG Y B,ZHANG M,CHENG Q B,et al.Relationship between HPLC fingerprint chromatogram and antioxidant activity of Forsythia suspense leaves [J].Natural Product Research and Development,2017,29:629-634.
[24] WU Y X, WANG X, JIANG H T, et al.Study on total polyphenol content and antioxidant,antimicrobial activities of different polarity fractions of Chimonanthus salicifolicus Hu leaves [J].Food & Machinery,2017,33:150-154.
[25] 吴林秀,胡荣康,雷雅婷,等.灰树花液态发酵菌丝体工艺优化及其体外抗氧化活性[J].食品工业科技,2018,39(13):187-191,197.