板栗花（chestnut flower）通常指板栗的雄性花序，其味微苦涩、性微温。大量研究表明，板栗雄花序中含有蛋白质、脂肪酸、雌二醇[1]等人体所需营养成分，同时含有挥发油[2]、犬尿喹啉酸[3]、黄酮[4-6]和多酚[7-9]等生物活性物质。中医认为，板栗花具有清热、燥湿、止血、散结消肿的功能，主治泄泻、便血、痢疾、消化不良等疾病[10]，也可用于夏季驱蚊[11]，具有一定的食用及药用价值。板栗花期时，雄花数量过多，远远超出雌花授粉需要，同时消耗板栗树大量养分从而影响板栗产量和质量，其作为板栗种植过程中的过盛产物，在板栗生长前期被随意丢弃，造成资源浪费[12]。
随着生活质量的提高，具有一定保健功能的花卉酒逐渐吸引了消费者的目光。国内许多学者研究并利用食用花卉酿造花卉酒，但是尚未见利用板栗花为原料酿制板栗花啤酒的报道。本研究以板栗花浸提液作为原料发酵酿造板栗花啤酒，研究了板栗花啤酒的生产工艺参数。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
板栗花浸提液：河北省迁西县板栗花研究所制备；CN36 安琪啤酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；大麦芽、SAAZ SPECIAL 啤酒花：市售。
1.1.2 试剂
葡萄糖（分析纯）：天津化学试剂一厂；邻苯二胺（分析纯）：上海凯赛化工有限公司；重铬酸钾（分析纯）、亚硝酰铁氰化钠（分析纯）：南京化学试剂股份有限公司。
1.2 仪器与设备
WZS 32 Brix 0-32%型WZS 手持式折射仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；附温比重瓶（25mL）：河南九和共创仪器有限公司；XS-1B 型EBC 色度分析比色计：杭州大吉光电仪器有限公司；UV-6100 型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；XFH-30CA 型高压蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
具体操作：粉碎后的大麦芽与水的料水比为1 ∶4（g/mL），进行浸出糖化及过滤，得到麦汁。将麦汁进行过滤并煮沸，煮沸过程保持沸腾60 min，期间分3 次加入酒花，酒花添加总量为0.06%，测定煮沸过程中的麦汁浓度为10°P 时，煮沸结束。煮沸结束后将混合液迅速降温及过滤。进行啤酒酵母接种后进入主发酵阶段，采用传统发酵工艺进行板栗花啤酒的发酵，进行主发酵7 d，啤酒后酵及贮酒10 d，贮酒结束后进行感官评定及理化分析。
1.3.2 试验设计
本试验通过设置不同板栗花浸提液添加量（5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL）、板栗花浸提液投入阶段（麦汁煮沸后10 min、煮沸后30 min、煮沸后50 min、接种阶段、后酵阶段）和主发酵温度（10、13、15、17、20 ℃），进行单因素试验，分别对不同的板栗花浸提液添加量、板栗花浸提液投入阶段和主发酵温度下所得到的板栗花啤酒进行理化分析和感官评定，探究不同板栗花啤酒工艺参数对发酵过程的影响；然后设置正交试验，通过三因素三水平的正交试验的感官评定结果来确定板栗花啤酒的最佳发酵工艺条件[17-18]。
1.3.3 感官评定
参照国标法GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[19]，通过用眼、鼻、口等感官器官去感知评价啤酒的特征，对板栗花啤酒的色泽、口感、泡沫、气味和酒体5 个方面进行感官品评，要求对板栗花啤酒进行感官评定的人必须有啤酒品评的学习背景和经验，选取10 人，感官品评满分为100 分，最终取10 位打分者所给分数的平均值。感官评分标准见表1。
1.3.4 酒精度的测定
参考文献[20-21]方法，制备样品后通过蒸馏法去除不挥发性物质，使用附温度计密度瓶，采用密度瓶法测出样品在20 ℃时的密度；然后，参照“酒精水溶液的相对密度与酒精含量对照表”得出板栗花馏出液中酒精含量的体积分数，即样品的酒精度(%vol）。
表1 板栗花啤酒品尝评分标准
Table 1 Criteria for chestnut flower beer
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1.3.5 总酸的测定
参考许秀丽[22]方法并进行修改，根据酸碱中和原理，采用电位滴定法，用标准溶液直接滴定板栗花啤酒中的总酸。公式如下。
X=2×c×V
式中：X 为样品总酸的含量，mL/100 mL；c 为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；V 为消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；2 为换算成100 mL 样品的系数。
1.3.6 双乙酰的测定
参考田玉红等[23]方法，采用紫外分光光度法进行双乙酰含量测定。
1.3.7 色度的测定
参考金德强[24]方法，采用EBC 色度分析比色计进行色度的测定。
2 结果与分析
2.1 板栗花浸提液添加量对板栗花啤酒的影响
按照1.3.1 具体操作，将得到的麦汁经过滤后分装于三角瓶中，麦汁体积为300 mL，进行煮沸。需要注意的是，麦汁在煮沸终了前10 min 时，分别向麦汁中添加经过高压灭菌的5%板栗花浸提液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL。发酵时主发酵温度为15 ℃，其他工艺条件参数保持一致。采用传统发酵工艺进行板栗花啤酒的发酵，进行主发酵7 d，待啤酒后酵及贮酒10 d 结束后，进行酒精度测定及感官评定，结果如图1。
图1 板栗花浸提液添加量对板栗花啤酒的影响
Fig.1 The effect of the addition of chestnut flower extract on chestnut flower beer
由图1 可知，随着板栗花浸提液添加量的增加，酒精度变化较小，感官评分呈现先增高后降低的趋势，当板栗花浸提液的添加量为10.0 mL 时，酒精度为3.62%vol，感官评分为85 分，花香突出，风味独特。这是由于板栗花浸提液的加入能赋予啤酒的独特风味，板栗花浸提液的过少添加会使板栗花香味不明显，过多会覆盖啤酒酒花的香味，使啤酒中各类风味物质的协调性降低，进而影响板栗花啤酒感官品评的口感和香味，所以将板栗花浸提液的添加量选为10.0 mL 较为合适。
2.2 板栗花浸提液投入阶段对板栗花啤酒的影响
按照1.3.1 具体操作，采用5%板栗花浸提液，添加量为10.0 mL，按不同阶段投入，主发酵温度为15 ℃，其他工艺条件参数保持一致。采用传统发酵工艺进行板栗花啤酒的发酵，进行主发酵7 d，待啤酒后酵及贮酒10 d 结束后，进行酒精度测定及感官评定，结果如图2。
图2 板栗花浸提液投入阶段对板栗花啤酒的影响
Fig.2 The effect of the chestnut flower extract on the chestnut flower beer
由图2 可知，随着板栗花浸提液投入阶段的延后，酒精度基本保持稳定，感官评分呈现先增加后减小的趋势。在麦汁煮沸阶段过早加入板栗花浸提液，混合液长时间处于沸腾状态，板栗花香散失，无板栗花特有香气；在接种阶段投入板栗花浸提液时，发酵的板栗花啤酒板栗花香味突出，酒精度为3.76%vol，感官评分最高，为78 分。在啤酒后酵阶段加入板栗花浸提液，整体发酵环境温度低，酵母数量少且活性不高，使板栗花浸提液在发酵液中存在的时间较短，板栗花香气成分不能充分融入发酵液中，从而影响板栗花啤酒口感和气味的协调性。说明板栗花浸提液最佳投入阶段为主发酵前的接种阶段。
2.3 主发酵温度对板栗花啤酒的影响
按照1.3.1 具体操作，采用5%板栗花浸提液，添加量为10.0 mL，投入阶段为接种阶段，主发酵温度分别为10、13、15、17 ℃和20 ℃，进行主发酵，后发酵及贮酒，取酒进行酒精度测定及感官评定，结果如图3。
图3 主发酵温度对板栗花啤酒的影响
Fig.3 Effect of main fermentation temperature on chestnut flower beer
由图3 可知，随着主发酵温度的不断增加，感官评分也随之逐渐增加，当主发酵温度为15 ℃时，酒精度为4.00%vol，感官评分为85 分；当主发酵温度继续增加时，感官评分呈明显下降趋势。板栗花啤酒中酒精含量在10 ℃时最低，为3.72%vol；在17 ℃时最高，为4.17%vol。这可能是主发酵的温度过高或者过低，对啤酒酵母的活性产生影响。温度过低，酵母增殖过程慢，麦汁中糖的转化率低，从而使酒精含量低；温度过高，酵母过快增殖，从而影响麦汁的发酵情况，使啤酒风味失调，涩味重，口感差。因此主发酵温度为15 ℃较为适合板栗花啤酒的发酵。
2.4 板栗花啤酒最佳发酵条件研究
从图1 至图3 的单因素试验的结果可知，主发酵温度、板栗花浸提液添加量以及板栗花浸提液投入阶段的不同，都会影响板栗花啤酒的酒精度和口感风味。因此选择主发酵温度、板栗花浸提液添加量、板栗花浸提液投入阶段作为正交试验的3 个因素，每个因素设置3 个水平，进行板栗花啤酒的酿制，在酿制结束后取酒并以感官评分作为检测指标。正交试验因素水平及结果如表2、表3 所示。
表2 板栗花啤酒发酵工艺正交试验因素水平
Table 2 Level of orthogonal test factors for the fermentation process of chestnut blossom beer
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表3 板栗花啤酒发酵工艺正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results of chestnut flower beer fermentation process
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由表3 进行直观分析可知，4 号试验感官评定分数最高，对应的发酵工艺较好方案为A2B1C3。从正交试验结果计算分析，根据各因素最大K 值所对应的水平，最佳的试验方案为A2B2C2；根据极差R，RA＞RB＞RC，说明发酵过程中主发酵温度对酿制板栗花啤酒的影响比较大，板栗花浸提液添加量的影响次之，板栗花浸提液投入阶段的影响最小。根据表3 进行方差分析，方差分析数据如表4 所示。
表4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
注：F0.1（2，2）=9.00，F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00。
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由表4 可知FA＞FB＞FC，F0.05（2，2）=19＜FA＜F0.01（2，2）=99，FB＜F0.1（2，2）=9.00，FC＜F0.1（2，2）=9.00，说明主发酵温度对板栗花啤酒发酵的影响较大，其可信度在95%～99%之间，而板栗花浸提液添加量和板栗花浸提液的投入阶段对板栗花啤酒口感影响较小，这与正交试验结果得到的分析一致。
由于直观分析（较好方案A2B1C3）和正交试验结果计算分析（较优方案A2B2C2）的发酵工艺方案不一致，因此需要进行验证试验。通过两组方案进行板栗花啤酒的发酵，进行4 组验证试验，并在相同条件下对发酵效果进行感官评定，验证试验结果如表5 所示。
表5 发酵工艺最优方案验证试验
Table 5 Validation test results of the optimal fermentation process plan
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由表5 可知，两种方案发酵的板栗花啤酒的平均感官评定分数均在85 以上，其中发酵工艺方案A2B2C2发酵酿制的板栗花啤酒平均感官评定分数为85.8，优于发酵工艺方案A2B1C3。
综上，得出最佳的发酵工艺为：主发酵温度15 ℃、板栗花浸提液添加量为10.0 mL、板栗花浸提液投入阶段为接种阶段，在该条件下板栗花啤酒的发酵效果最好。
2.5 最佳工艺条件下发酵结果理化分析
2.5.1 成分分析酒精度
根据GB/T 4928—2008 《啤酒分析方法》、GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》，对最佳试验组A2B2C2 进行理化分析，测定该工艺条件发酵的板栗花啤酒的酒精度、总酸、双乙酰及色度，结果见表6。
表6 板栗花啤酒的理化分析结果
Table 6 The results of the sensory evaluation of chestnut flower beer
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结果表明最佳试验组发酵的板栗花啤酒的各项理化指标基本符合GB/T 4928—2008 和GB 5009.225—2016 的标准，说明正交优化的板栗花啤酒发酵工艺合理可行。
2.5.2 感官评定
板栗花啤酒颜色金黄，均匀透亮，有光泽感，无肉眼可见杂质；泡沫较洁白细腻，一般持久；具有板栗花特有香气，花香和酒香协调；酒体醇厚，口感细腻，无明显异味和酸味。
2.5.3 卫生标准
检测出板栗花啤酒的菌落总数≤20 CFU/mL，大肠菌群≤2 MPN/100 mL，未检出沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，符合GB 4927—2008《啤酒》的标准。
3 结论
本试验对板栗花啤酒的发酵生产工艺进行了研究，以大麦芽为原料，加入板栗花浸提液，酿制板栗花啤酒。经过正交试验优化后的最佳发酵工艺条件为：主发酵温度15 ℃、板栗花浸提液添加量为10.0 mL、板栗花浸提液投入阶段为接种阶段。在该条件下发酵的板栗花啤酒符合国标啤酒理化指标要求，酒液呈金黄色，有光泽度，泡沫细腻，具有板栗花特有香气，口感细腻醇厚，无明显酸味和异味，花味和酒香协调。板栗花啤酒具有很大的发展潜力，该条件下酿制的板栗花啤酒仅考虑到3 个主要影响因素，在后期可通过扩大研究试验影响因素进一步优化发酵工艺，以期形成规模化生产。
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