香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa L.）植物所结果实。香蕉香气浓郁，营养价值高，含有丰富的氨基酸、有机酸、多酚、总黄酮等活性物质[1]。研究表明，香蕉具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多种保健功能[2-3]。香蕉因其独特的香味和丰富的营养价值被人们喜爱，香蕉极不耐储藏，容易氧化褐变，香蕉加工是保存香蕉的有效手段。目前市场上的香蕉加工产品以香蕉片、香蕉饮料为主。开发高值化、具有竞争力的香蕉深加工产品有助于我国香蕉产业的持续发展。
果醋是以水果或果品加工下脚料为主要原料，经酒精发酵酿制而成的酸性产品。果醋不仅具有水果常见的营养素，还在发酵过程中产生具有特殊功效的次生代谢产物，具有降脂、降糖[4]等保健作用。固定化发酵是指将微生物高度密集地固定在活性炭、玉米芯等载体上，微生物在适宜条件下迅速增殖的生物技术。经固定化后的微生物在发酵过程中可重复利用，简化了菌种扩大培养过程，缩短发酵时间，节约生产场地，提高设备利用率和生产率，易于实现自动化控制和生产连续化，所得产品品质稳定[5]，已广泛应用于发酵工业及医药等各领域[6]，目前国内外尚未见采用此法生产香蕉醋的研究报道。
本研究以酒精度4%vol～5%vol 的香蕉果酒为原料，选用市售优良的醋酸菌，采用玉米芯吸附包埋法进行固定化醋酸菌发酵，研究香蕉醋发酵过程中主要成分的含量变化，以及这些变化对成品风味品质的影响，为香蕉醋品质评价提供参考依据，同时为香蕉醋的工业化生产提供一定的理论指导和技术经验，丰富市场果醋种类。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
香蕉果酒：广西农业职业技术学院果酒生产车间；玉米芯：市购；醋酸菌：陕西易腾达有限公司；牛血清白蛋白溶液：Luminex 公司；没食子酸（分析标准品）、芦丁（分析标准品）：上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝G250：国药集团化学试剂有限公司；福林酚、无水碳酸钠、无水乙醇、茚三酮、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、葡萄糖、磷酸二氢钠、3，5-二硝基水杨酸、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、苯酚、硫酸、邻苯二甲酸氢钾、磷酸、柠檬酸（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司。
MC-SH2112 电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；电炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；HWS-26 电热恒温水浴锅：上海齐欣科学有限公司；XHC 涡旋混合器：江苏金怡仪器科技有限公司；3H16RI 智能高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；BCD645WKPZM电冰箱：合肥美的电冰箱有限公司；DNP-9272 电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；WZS32 手持阿贝折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；T6 型新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；YTD-200 固定化细胞连续反应器：陕西易腾达酿造科技有限公司；TZE-60L 高效节能雾化蒸煮器（电热）：广州市准食品机械有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 香蕉醋制备工艺
1.2.1.1 工艺流程
固定化载体→醋酸菌活化→醋酸固定化发酵→过滤→香蕉醋
1.2.1.2 操作要点
1）固定化载体：选用无黑芯、无异味、不发霉的玉米芯作固定化载体，灭菌后加入固定化反应器中，玉米芯填满反应器的2/3 以上。
2）醋酸菌活化：按0.1%～0.5%（以发酵液质量计）的添加量计算醋酸菌添加量，将醋酸菌均匀的撒在玉米芯上，开启物料泵将香蕉酒泵入发酵罐，开启发酵罐循环泵，当醋床温度升温至35 ℃左右并保持不变时，活化完毕。
3）固定化发酵：设定冷却泵启动温度为36.5 ℃，冷却泵停止温度为35.5 ℃。将酒精度为4%vol～5%vol香蕉酒分批泵入固定化反应器中进行发酵，检测发酵过程中的酒精度和酸度值，当酒精度降为0%vol 时完成一批香蕉醋发酵阶段，将香蕉醋泵入储罐后，再按同样的方法进行下一批的香蕉醋发酵。
1.2.2 测定方法
样液预处理：定期从固定化连续反应器中取适量发酵液，在8 000 r/min，0～5 ℃的离心机中离心15 min，取上清液作为待测液。
1.2.2.1 pH 值、酸度和酒精度的测定
pH 值：采用pH 计直接测定[7]。
酸度：采用氢氧化钠滴定法测定[6]。酒精度：采用蒸馏法测定[8]。
1.2.2.2 透光率、褐变值和可溶性固形物的测定
透光率：取适量待测液，在波长670 nm 处由分光光度计直接测得。
褐变值：参考黎星辰等[9]的研究方法。
可溶性固形物：采用阿贝折光仪直接测定。
1.2.2.3 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法测定[10]。
1.2.2.4 还原糖和总糖含量的测定
还原糖：采用二硝基水杨酸法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS 法）测定[11]。
总糖：采用苯酚-硫酸法测定[12]。
1.2.2.5 多酚含量的测定
采用福林酚法测定[13]。
1.2.2.6 总黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定[14]。
1.2.2.7 氨基酸含量的测定
参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[15]。
1.2.2.8 有机酸含量的测定
有机酸含量测定采用高效液相色谱法[16]。
1.3 数据处理
所有数据测定3 次以上，采用Origin 8.5、SPSS 19.0软件进行图片绘制和数据处理。
2 结果与分析
2.1 香蕉醋发酵过程中pH 值、酸度和酒精度的变化
酸味是香蕉醋的主要感官指标，取决于有机酸的种类和含量。总酸的含量和pH 值的变化反映了香蕉醋中有机酸的含量，体现香蕉醋的品质。在香蕉醋的发酵过程中，醋酸菌将酒精转换成醋酸，因此发酵液的酒精度能反应香蕉醋的发酵程度。香蕉醋发酵过程中pH 值、酸度和酒精度的变化见图1。
图1 香蕉醋发酵过程中pH 值、酸度和酒精度的变化
Fig.1 Changes of pH，acidity and alcohol during the fermentation of banana vinegar
由图1 可知，香蕉醋的主发酵时间为6 d。随着发酵时间的增加，发酵液pH 值呈波动下降趋势，由3.69逐渐降至3.55。总酸在发酵期间整体呈上升趋势，由1.25 g/100 mL 升至3.80 g/100 mL。香蕉醋发酵过程中，不同时期总酸的增加幅度不同，发酵前4 d，总酸含量上升较快，在第4 天时总酸含量达到3.48 g/100 mL，比第0 天提高了169.23%；4 d～6 d，总酸上升缓慢，发酵结束时香蕉醋的总酸含量为3.80 g/100 mL，比第4 天时提高了28.57%。酒精度在香蕉醋发酵期间呈波动下降趋势，发酵前4 d，酒精度由4.55%vol 迅速下降至0.41%vol，下降了90.99%，4 d～6 d，酒精度缓慢下降至0%vol，表明香蕉醋固定化发酵已达终点，前发酵阶段结束，此后进入陈酿阶段。
在香蕉醋发酵期间，醋酸菌以酒精为底物，在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下将酒精氧化成乙酸，随着氧化的进行，发酵液中酒精含量减少，乙酸含量增加，因此发酵液pH 值降低，这一发酵趋势和Arianna Roda 等[17]的研究结果一致。发酵期间，当发酵液的酒精度低于1%vol 时，酒精度下降变缓，对应的pH 值和总酸含量变化不明显，发酵结束时，香蕉醋的总酸为3.80 g/100 mL，和其它果醋总酸含量差别不大，如桃醋[18]（总酸含量3.54 g/100 mL）、克菲尔苹果醋[19]（总酸含量4.10 g/100 mL）。
2.2 香蕉醋发酵过程中透光率、褐变值的变化
透光率和褐变值反应香蕉醋的发酵程度以及在发酵过程中的褐变情况，是体现香蕉醋色泽品质的重要指标。香蕉醋发酵过程中褐变值和透光率的变化见图2。
图2 香蕉醋发酵过程中褐变值和透光率的变化
Fig.2 Changes of browning and transmittance during the fermentation of banana vinegar
由图2 可知，0～0.5 d，发酵液的透光率迅速升高，由43.64%升至95.94%，0.5 d～1 d 透光率降低至88.26%，1 d～6 d，透光率缓慢回升并趋于稳定状态。在香蕉醋发酵的过程中，发酵液的褐变值呈下降趋势，0～0.5 d，发酵液的褐变值迅速降低，下降了49.68%，随后在0.5 d～6 d 褐变值下降了7.69%，香蕉醋发酵结束时，褐变值为0.72。透光率和褐变值在香蕉醋发酵过程中呈相反趋势，在发酵过程中褐变值的降低使得发酵液更加澄清透亮，这一点和丁利君等[20]的研究一致。
2.3 香蕉醋发酵过程中可溶性固形物和蛋白质的变化
可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等，主要为可溶性糖类，是评价果醋品质的重要指标。香蕉醋发酵过程中可溶性固形物和蛋白质的变化见图3。
由图3 可知，在香蕉醋发酵期间，可溶性固形物含量呈先上升后趋于稳定的状态，在发酵的0～0.5 d，发酵液的可溶性固形物含量上升了52.44%，0.5 d～3 d，发酵液的可溶性固形物含量波动下降，3 d～6 d，发酵液的可溶性固形物含量波动上升，当香蕉醋发酵结束时，可溶性固形物含量为4.80%。
蛋白质由氨基酸组成，在一定条件下，蛋白质会水解成氨基酸。氨基酸是微生物良好的氮源，蛋白质含量的变化可以在一定程度上反映其转化为氨基酸的程度，进一步体现微生物对其的利用情况。由图3可知，在香蕉醋发酵期间，发酵液蛋白质含量呈下降趋势，发酵第1 天，发酵液蛋白质含量由7.25 mg/100 g迅速下降至3.83 mg/100 g，1 d～4 d，发酵液的蛋白质含量有所上升，4 d～6 d，发酵液的蛋白质含量在4.70 mg/100 g 上下波动，香蕉醋发酵结束时，发酵液蛋白质含量为5.10 mg/100 g。孙宗保等[21]研究发现，醋酸发酵阶段，当发酵环境适合蛋白酶的生长时，蛋白质在蛋白酶作用下不断分解，氨基酸不断增加，故发酵液的蛋白质含量不断降低，如图3 所示，在醋酸发酵初期蛋白质含量迅速下降并慢慢趋于稳定。香蕉醋中的氨基酸分解后经氧化或还原可以产生许多重要的香味物质，如戊醛丙二醇缩醛、乙醛丙二醇缩醛、碘代苯、戊醇、乙二醇丁醚醋酸酯、β-紫罗兰酮等[22]，这些香气成分有助于提升果醋的风味及品质。
2.4 香蕉醋发酵过程中还原糖和总糖的变化
糖类是微生物重要的能源和碳源，是香蕉醋风味物质重要的前体，是发酵过程中重要的成分物质。还原糖、总糖的变化可以反映醋酸菌在发酵过程中对糖的利用情况。
由图4 可知，在香蕉醋发酵过程中，总糖呈先上升后下降的趋势，发酵第1 天，总糖上升了31.15%，在第1～3 d，总糖含量迅速下降，由1.38 g/100 g 下降至0.77 g/100 g，在第3～6 天，总糖含量趋于稳定，当香蕉醋发酵结束时，总糖含量为0.74 g/100 g。还原糖的变化趋势和总糖基本一致，先上升后下降最后趋于稳定，相对于总糖，还原糖的变化出现延后情况，在第1～3 天，还原糖一直处于上升阶段，上升了21.51%，在第3～6 天，还原糖迅速下降后趋于稳定，香蕉醋发酵结束时，还原糖含量为0.09 g/100 g。
醋酸发酵前期还原糖和总糖含量略有增加，可能有两点原因导致了其含量改变，一是发酵过程中蔗糖在酸性条件下分解，二是由于醋酸发酵阶段伴随着乙醇发酵成乙酸的氧化反应、氨基酸与糖的美拉德反应、有机酸与醇类结合成芳香酯的酯化反应等各类化学反应。苹果醋[23]在发酵过程中多糖含量也呈类似趋势。
2.5 香蕉醋发酵过程中多酚和总黄酮的变化
多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分总称，包括单宁类、总黄酮类、酚酸类以及花色苷类等，具有一定的呈色作用[9]。香蕉醋发酵过程中多酚和总黄酮的变化见图5。
由图5 可知，在香蕉醋发酵过程中，发酵液多酚含量呈先下降后上升的趋势，发酵初期，多酚含量为7.73 mg/100 mL，在第2 天下降至6.54 mg/100 mL，在2 d～6 d，多酚含量呈上升趋势，最后发酵结束时多酚含量为9.02 mg/100 mL，比发酵前提高了14.3%。在醋酸发酵的过程中，多酚容易被多酚氧化酶氧化偶合成红棕色或褐色的醌类产物，令香蕉醋色泽发生改变，也有可能是醋酸菌分解或吸附[24]，从而出现多酚含量波动的现象。龙眼醋的多酚含量在发酵过程中也出现类似波动[25]。
图5 香蕉醋发酵过程中多酚和总黄酮的变化
Fig.5 Changes of polyphenols and total flavonoids during the fermentation of banana vinegar
黄酮类化合物是一类以2-苯基色原酮为母核的化合物，研究发现，总黄酮具有降血脂、抗氧化、抑菌等功效，是评价香蕉醋保健作用的重要指标。由图5 可知，在香蕉醋发酵过程中，总黄酮含量整体呈下降趋势，在发酵的0～1 d，总黄酮降低了27.6%，在1 d～3 d，发酵液总黄酮降低了6.1%，在4 d～6 d，发酵液总黄酮含量增加，发酵结束时，发酵液总黄酮为7.00 mg/100 mL。FangFang 等[26]研究发现，果醋中的糖可能与游离态总黄酮结合形成配糖体，随着发酵的进行发生部分水解，因此总黄酮在发酵过程中呈波动下降现象，柿醋[27]的总黄酮在发酵过程也呈波动下降趋势。
在香蕉醋发酵的过程中，多酚和总黄酮的含量变化趋势不同，总黄酮是多酚的一种，在发酵过程中，醋酸菌将乙醇氧化成醋酸，发酵液乙醇含量降低，使多酚和总黄酮的溶解度降低或被氧化[9]，从而导致其含量降低。
2.6 香蕉醋发酵过程中氨基酸的变化
氨基酸是蛋白质在特定条件下的水解产物，氨基酸是微生物良好的氮源，使醋具有鲜美醇厚的味道，是果醋重要的呈味物质。香蕉醋发酵过程中氨基酸种类及含量的变化见表1。
由表1 可知，在香蕉醋发酵过程中，氨基酸总量呈先上升后下降的趋势，与图3 对比发现，在发酵前期，蛋白质不断分解，蛋白质含量下降，氨基酸总量增加。香蕉醋中含有17 种游离氨基酸，其中含量最高的是丙氨酸，其次是组氨酸、缬氨酸、亮氨酸。随着发酵时间的增加，必需氨基酸总量与游离氨基酸总量的比值增大，必需氨基酸总量和非必需氨基酸总量的比值增大，发酵结束时，香蕉醋必需氨基酸中缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸含量较高，均大于6 mg/100 mL，与秦红艳等[28]研究接近，此外香蕉醋的E/T=0.41，E/N=0.70，均与世界卫生组织与联合国粮农组织提出的参考蛋白模式E/T=0.4，E/N=0.6 更为接近，说明香蕉酒发酵成香蕉醋，必需氨基酸的配比趋于合理，更符合人体营养需求。
表1 香蕉醋发酵过程中氨基酸种类及含量的变化
Table 1 Changes of amino acid content and kinds in banana vinegar during the fermentation of banana vinegar mg/100 mL
注：*表示必需氨基酸；T 表示氨基酸总量；E 表示必需氨基酸总量；N 表示非必需氨基酸总量。
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2.7 香蕉醋发酵过程中有机酸的变化
有机酸是果醋的主要呈酸物质，有机酸的种类和含量决定了香蕉醋的主要口感。香蕉醋发酵过程中有机酸种类及含量的变化见表2。
从表2 可知，香蕉醋中有7 种有机酸，分别为醋酸、琥珀酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸。其中醋酸含量最高，为17.91 g/L，乳酸、柠檬酸、琥珀酸含量较高，均大于5 g/L，这4 种是香蕉醋发酵过程中的主要有机酸。在香蕉醋发酵过程中，醋酸菌在乙醇脱氢酶的作用下不断将酒精氧化成醋酸，醋酸含量逐渐增加，发酵结束时，醋酸含量占总有机酸的49.33%，醋酸含量较发酵初期提高了161.84%，是构成香蕉醋的主要酸味成分。乳酸是发酵初期含量最多的有机酸，在发酵前期，乳酸含量迅速下降后趋于稳定的状态，可能是醋酸菌把乳酸分解导致其降低，乳酸占有机酸的比例由发酵初期的36.17%降低至16.36%。柠檬酸的变化趋势与乳酸一样，但是变化范围比乳酸小。琥珀酸在醋酸发酵过程中缓慢上升，后期含量变化不大，琥珀酸是微生物利用糖类物质的发酵产物。酒石酸和草酸在香蕉醋中含量较低，变化不大。发酵结束，香蕉醋里有机酸含量从高到低依次为醋酸、琥珀酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸。
表2 香蕉醋发酵过程中有机酸种类及含量的变化
Table 2 Changes of organic acid kinds and content in banana vinegar during the fermentation of banana vinegar
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3 结论
以酒精度4%vol～5%vol 的澄清香蕉酒为原料，采用固定化发酵法生产香蕉醋，通过测定发酵期间主要成分的变化来分析不同时期的香蕉醋品质。结果表明：香蕉醋发酵过程中，随着发酵时间的增加，pH 值和酒精度等指标降低；总酸、可溶性固形物等成分含量增加；蛋白质、氨基酸等成分含量波动变化后趋于稳定。经过固定化发酵得到的香蕉醋主要理化指标为pH 3.55、总酸3.80 g/100 mL、褐变值0.72、透光率91.13%、可溶性固形物4.80%、蛋白质5.10 mg/100 g、总糖0.74 g/100 g、还原糖0.09 g/100 g、多酚9.02 mg/100 mL、总黄酮6.99 mg/100 mL、氨基酸总量115.00 mg/100 mL、有机酸总量36.31 g/L，符合GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》的理化要求。以玉米芯为载体，采用固定化发酵法生产香蕉醋，简化了菌种扩大培养，缩短发酵时间，实现了菌种重复利用和香蕉醋连续化生产，为香蕉醋的工业化生产提供一定的理论指导和技术经验，丰富市场果醋种类。
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