目前很多研究表明：过多摄入动物蛋白会增加冠心病等的患病概率，导致低脂、低热量的植物源蛋白的需求增大[1-2]。目前我国豌豆加工的重点是制备豌豆淀粉，豌豆蛋白为其副产品[3]。由于豌豆蛋白在加工过程中易变性，持水性差，起泡性和乳化性也不太理想，导致豌豆蛋白研究与开发不足，随之绝大部分豌豆蛋白作为饲料，造成了蛋白质资源的极大浪费[4-5]。因此，需要改善豌豆蛋白的应用特性，扩大其在食品工业的应用。
目前，蛋白性质主要是通过物理法、化学法和酶法等方法来改善[6]。其中，物理法简单、环保，且安全性高。研磨作为一种有效的物理改性手段，可以制备一些新材料。研磨通过机械力（摩擦、撞击等）克服颗粒的内聚力，使物料破碎；同时，研磨过程中产生的反复高能量冲击造成机械力化学效应，会引起物料性质的变化[7-8]。在食品加工领域，学者多数采用湿法来改善蛋白性质。吴迪等[9]采用高压均质改善栉孔扇贝蛋白乳化特性。孙靖辰等[10]则利用超声提高米糠蛋白的溶解度、凝胶性等功能特性。关于干法改善蛋白性质的报道很少，干法处理后无需干燥、能耗低，比湿法处理更易在工业中推广。
本文采用研磨技术干法处理豌豆分离蛋白，研究研磨后豌豆分离蛋白颗粒形态结构、亲水基团、疏水基团、持水性、持油性、泡沫特性、乳化性能、凝胶性能等结构与应用特性的变化，并通过分析亲水（油）性与应用特性的相关性，探讨研磨对豌豆分离蛋白颗粒的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
豌豆分离蛋白：双塔食品有限公司；尼罗红：阿拉丁工业公司；一级大豆油：市售；溴化钾（KBr）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：西格玛化学公司；所用化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
ST-Q200 行星式球磨机：北京旭鑫仪器设备有限公司；JSM-6510LV10800 钨灯丝扫描电子显微镜：日本JEOL 公司；JC2000C1 型接触角测量仪：上海中晨数字技术设备有限公司；TG1650-WS 台式高速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-8000A 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；TA.XTC 质构仪：上海保圣实业发展有限公司；T18 digital Ultra-T高速分散器：德国IKA 公司。
1.3 豌豆蛋白研磨处理
用研磨机研磨豌豆分离蛋白。其中球与样品质量比为5∶1。机器在室温25 ℃下，以200 r/min 的转速运行。其中每隔2.5 min 停止仪器运行1 h，并将研磨罐水浴冷却，以减少研磨过程中热量的产生。研磨结束后样品放入自封袋中，4 ℃保存。
1.4 扫描电镜
使用离子喷射器在样品表面镀一层15 nm 左右的金箔后（豌豆蛋白样品经过离子溅射仪喷金后），在工作距离5.1 mm，加速电压6 kV，放大倍数1 000 条件下通过扫描电镜进行观察并拍摄[11]。
1.5 接触角的测定
取适量豌豆蛋白样品用压片机压成光滑的薄片，选用去离子水、大豆油作为润湿性试验液体，通过接触角测定仪采用悬滴法依次测定液滴与样品表面的接触角。
1.6 应用特性的测定
1.6.1 持水性的测定
持水性根据耿军凤等的方法[12]，略有改动。准确称取0.1 g 豌豆蛋白样品置于离心管内后加入20 mL 蒸馏水，用玻璃棒将其搅均，随后在80 ℃水浴中保温60 min，取出冷却。将冷却至室温（25℃）的样品于3 000 r/min 下离心30 min，倒去上清液。测定此刻离心管加沉淀物的质量。持水性计算公式如下。
式中：W0 为豌豆蛋白质量，g；W1 为豌豆分离蛋白加离心管质量，g；W2 为离心后离心管加沉淀物质量，g。
1.6.2 持油性的测定
准确称取2.0 g 豌豆蛋白样品置于离心管内加入10 mL 大豆油，用玻璃棒将其搅均，静置30 min 后于3 000 r/min 离心30 min，倒去上清液。测定离心管与沉淀物的质量。持油性计算公式如下[13]。
式中：W0 为豌豆蛋白质量，g；W1 为豌豆分离蛋白加离心管质量，g；W2 为离心后离心管加沉淀物质量，g。
1.6.3 起泡性和泡沫稳定性的测定
配制3%的豌豆蛋白质溶液，用氢氧化钠或者盐酸调节样品pH 值至7.0，在30 ℃水浴下保温10 min，然后用高速分散器在5 000 r/min 下均质3 min 后迅速倒入量筒中。记录均质前溶液的体积，均质结束时泡沫的体积，均质结束10 min 的泡沫体积。起泡性（foaming characteristic，FC）和泡沫稳定性（foaming stability，FS）[14]计算公式如下。
式中：V 为均质前溶液的体积，mL；V0 为均质结束时泡沫的体积，mL；V1 为均质结束10 min 的泡沫体积，mL。
1.6.4 乳化性和乳化稳定性的测定
采用比浊法测定乳化特性。配制1 mg/mL 的待测样品以9∶1 的质量比加入大豆油，经高速分散器于10 000r/min 下均质2min，分别在搅拌后0min 和10min时从测试管底部取样100 μL，用质量浓度为0.1 g/L 的SDS 稀释50 倍后，测定样品在500 nm 处的吸光度值，以SDS 溶液做空白[15]。乳化性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）的计算公式如下。
式中：DF 为稀释倍数；C 为样品浓度，g/mL；φ 为光程，φ=1 cm；θ 为乳液中油相所占比例；A0 为0 min时测定的吸光度；A10 为10 min 时测定的吸光度；t 为时间，t=10 min。
1.6.5 凝胶性的测定
将配制17%豌豆蛋白溶液放入磁力搅拌器中以1 500 r/min 搅拌60 min，随后在90 ℃下水浴保温30 min。取出冷却在4 ℃冷藏过夜，制得豌豆蛋白凝胶[16]。在质构仪上测定其质构特性[17]。
1.7 数据分析
所有试验均重复3 次，采用Origin 软件进行图表绘制。采用SPSS 软件对数据进行ANOVA 差异显著性分析，以P＜0.05 为差异显著。
2 结果与分析
2.1 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质显微结构的影响
豌豆蛋白的扫描电镜图见图1。
图1 豌豆蛋白的扫描电镜图
Fig.1 Scanning electron micrograph of pea protein
由图1 中可见，研磨处理后的豌豆分离蛋白形貌特征发生了明显变化。豌豆分离蛋白原样完整，表面平滑，粒径较大，且分布比较集中，与XIONG 等[18]研究一致。当研磨2.5 min～7.5 min 时，部分豌豆分离蛋白破碎，颗粒粒径开始变小，表面开始变得不平滑，部分颗粒表面黏附有碎片形成了聚集体（图1 D）。随着研磨时间的增加，蛋白质的结构严重破坏，颗粒粒径明显变小，颗粒碎片呈现出不规则、无序的形态，颗粒表面显著粗糙、质地也明显疏松。对蛋白的破坏越严重，碎片呈现出各种不规则、无序的形态，颗粒表面变粗糙，质地变得疏松。
2.2 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质接触角的影响
豌豆蛋白片表面的水接触角光学照片见图2，豌豆蛋白片表面的油接触角光学照片见图3。
蛋白质的亲水性是指蛋白对水的亲和能力，表面被水所润湿的能力[19]。蛋白质的亲/疏水性、润湿性，对蛋白质的应用特性有重要的指导意义。本文通过去离子水、大豆油在豌豆蛋白表面形成的接触角来表征亲/疏水性、润湿性。
图2 豌豆蛋白片表面的水接触角光学照片
Fig.2 Optical photo of water contact angle on the surface of pea protein sheet
图3 豌豆蛋白片表面的油接触角光学照片
Fig.3 Optical photo of oil contact angle on the surface of pea protein sheet
结合图2、图3 可看出，研磨后蛋白质的亲水性增强，亲油性降低。随着研磨时间的延长，蛋白质的亲水性呈现出现先升高后降低的趋势。在研磨时间为7.5 min 时，蛋白质的亲水性达到最大。这主要是由于短时间地研磨下，蛋白发生了团聚、折叠现象（图1 D），减少了蛋白颗粒表面和间隙中的空气含量，同时蛋白质内部的部分极性基团暴露出来，导致亲水性得到了提高[20]。而当研磨时间过长时，颗粒结构严重破坏（图1G），蛋白质结构中大量疏水基团暴露，同时蛋白粒径的降低使得空气容易在蛋白质的表面形成气膜，这导致了水对蛋白质的润湿性减弱，所以这时蛋白亲水性减弱[21]。
2.3 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质持水性的影响
研磨时间对豌豆蛋白持水性的影响见图4。
图4 研磨时间对豌豆蛋白持水性的影响
Fig.4 The effect of grinding time on the water retention of pea protein
持水性是将水截留在组织内的能力[22]。由图4 可知，研磨处理时间在2.5 min～7.5 min 时，蛋白质的持水性随着研磨处理时间的延长而增大。研磨处理7.5 min时，豌豆分离蛋白的持水性达到最大为4.095 g/g，比原样升高了37.4%。这可能是因为，短时间的研磨处理使蛋白分子伸展，极性基团暴露于表面，亲水性增加，水分子能够稳定的存在于蛋白结构中[23]。但是研磨超过7.5 min 时持水性降低，这是由于长时间研磨导致蛋白质结构严重破坏，降低了蛋白质与水结合的有效性，导致蛋白质的持水性下降。
2.4 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质持油性的影响
研磨时间对豌豆蛋白持油性的影响见图5。
图5 研磨时间对豌豆蛋白持油性的影响
Fig.5 The effect of grinding time on the oil retention of pea protein
持油性是指对油吸附并将油截留在组织内部的能力[24]。由图5 可知，随着研磨时间的延长，豌豆分离蛋白的持油性呈现先升高后降低的趋势，在研磨时间为7.5 min 时，蛋白质的持油性达到最大。这可能是因为短时间研磨，蛋白质极性基团暴露导致部分疏水基团内埋，虽然亲油性下降，但油滴可以稳定的存在于疏水基团的空隙中[25]。随后蛋白质结构遭到严重破坏，与油结合的紧密性下降，持油性降低[26]。
2.5 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质起泡特性的影响
良好的起泡特性可满足食品加工的特殊需要，如蛋糕、啤酒等的加工。起泡性指在搅打的过程中，形成气泡的能力[27]。起泡稳定性则指泡沫不被破损的能力[28]。研磨时间对豌豆蛋白溶液起泡性（FC）及起泡稳定性（FS）的变化影响如图6 所示。
图6 研磨时间对豌豆蛋白起泡特性的影响
Fig.6 The effect of grinding time on the foaming characteristics of pea protein
由图6 可知，随着研磨时间的增大，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性均呈现先增加后减小的趋势，其中研磨时间为7.5 min 时，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性均达到最大。原因是此时间内蛋白分子发生适度伸展，蛋白分子间能形成比较稳定的网络结构和界面膜，同时蛋白质与水相互作用增强，使得蛋白的起泡性不断增加[29]。当研磨时间大于7.5 min 时，豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性开始下降，这是由于豌豆蛋白变性严重，蛋白质分子间相互作用减弱；同时大量疏水基团的暴露使蛋白质亲水、持水性下降，产生的泡沫界面膜缺乏韧性容易破裂，导致豌豆分离蛋白的起泡性和泡沫稳定性开始下降[30]。
2.6 研磨处理时间对豌豆分离蛋白乳化性能的影响
研磨时间对豌豆蛋白乳化性能的影响见图7。
图7 研磨时间对豌豆蛋白乳化性能的影响
Fig.7 The effect of grinding time on the emulsification of pea protein
乳化性能是蛋白质重要的功能特性之一。乳化性（EAI）表示蛋白乳液的形成能力，乳化稳定性（ESI）是蛋白乳液保持稳定的能力[31-32]。由图7 可见，研磨处理能显著提高豌豆分离蛋白的乳化性能，其中研磨时间为7.5 min 时具有最好的乳化性能，EAI 和ESI 达到17.14 m2/g 和122.33 min，分别比原样提高了79.10%和49.42%。结果表明：适当的研磨处理会使蛋白质的空间结构适当分散，蛋白质分子适度伸展，部分内埋的极性基团和非极性基团暴露，蛋白质在油水界面更易吸附，蛋白质吸附到油-水分界处的速率得到提高，因此提高了豌豆分离蛋白的乳化性及乳化稳定性[33]。但长时间研磨后，蛋白质维持稳定空间结构的键遭到破坏，蛋白质发生严重变性，降低了蛋白质膜与油水界面的吸附力，使豌豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性下降[34]。在食品加工过程中，常常会出现乳化性不理想的问题，因此经过研磨处理的豌豆分离蛋白在食品行业中有较大的优势。
2.7 研磨处理时间对豌豆分离蛋白质凝胶性能的影响
研磨时间对豌豆蛋白凝胶性能的影响见表1。
表1 研磨时间对豌豆蛋白凝胶性能的影响
Table 1 Effect of grinding time on pea protein gel properties
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
研磨时间/min 弹性 回复性0 0.153±0.012f 0.497±0.017d 2.5 0.231±0.160e 0.504±0.007c 5 0.335±0.061b 0.530±0.003b 7.5 0.414±0.508a 0.713±0.025a 10 0.310±0.089c 0.449±0.006d 15 0.284±0.389d 0.344±0.004e 20 0.217±0.051e 0.271±0.001f
受到外力作用变形除去作用力时，能恢复原来形状的性质为弹性，在一定时间内的回复能力为回复性[35]。
由表1 可知，豌豆分离蛋白凝胶的弹性、回复性表现出相同的趋势。随着研磨时间延长，凝胶的弹性、回复性先增大后减小。研磨时间为7.5 min 时，凝胶的弹性、回复性达到最大。出现这种趋势的原因是研磨时间的增大，使得蛋白质分子伸展，内埋基团暴露，蛋白质-蛋白质相互作用增加，促进形成凝胶网状结构，弹性增大，回复性增大[36]。当研磨时间进一步延长时，蛋白质结构被破坏，随之维持稳定凝胶网状结构的键被破坏，因此弹性、回复性降低。
2.8 相关性分析
亲水性、亲油性与蛋白应用特性相关性分析见表2。
表2 亲水性、亲油性与蛋白应用特性相关性分析
Table 2 Correlation analysis of hydrophilicity，lipophilicity and protein application characteristics
注：** 在P＜0.01 时表示极显著；*在P＜0.05 时表示显著。
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相关性分析表明，亲水性对豌豆分离蛋白的应用特性影响趋势一致，呈正相关，其中持水性、持油性、乳化特性、凝胶弹性表现出极显著正相关。亲水性对豌豆分离蛋白应用特性的影响表现为亲水性越高，应用特性越好。亲油性对豌豆分离蛋白的应用特性影响趋势一致，呈负相关，其中乳化性表现出极显著负相关，持油性表现出了显著负相关。表明亲油性对豌豆分离蛋白应用特性的影响表现为亲油性越好，应用特性越差。
3 结论
研磨显著提高了豌豆分离蛋白的亲水性、持水性、持油性、起泡性和泡沫稳定性等应用特性；且乳化性能、凝胶性能也得到不同程度的提高。其中研磨7.5 min 时豌豆分离蛋白应用特性最佳。这些发现将有助于豌豆蛋白稳定乳液产品的研发。
在研磨作用下，豌豆蛋白的颗粒出现了聚集、团聚等类似机械力化学效应的现象。今后可将研磨与低剂量变性剂结合共同改性蛋白，提高其应用特性，开发更多的高性能豌豆分离蛋白产品。
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