酸枣仁为鼠李科植物酸枣 [Ziziphous jujuba Mill.Var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow]的干燥成熟种子，为药食同源的传统中药，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津等功效[1]。现代化学及药理研究表明[2-3]，酸枣仁中主要有效成分有脂肪油、三萜皂苷、黄酮、多糖、生物碱和氨基酸等，其中酸枣仁中脂肪油在失眠、阵痛等领域疗效显著，有“东方睡油”美誉[4]。随着酸枣仁临床用药需求的增加，部分酸枣仁产区药农为了争取最大的经济效益，出现严重的“抢青”现象，导致酸枣仁药材颗粒不饱满、质量不合格，严重影响了酸枣仁临床疗效[5]。因此规范和确定酸枣仁最佳采收时间对于保证酸枣仁质量有重要意义。
气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术为研究中药材中脂肪油类成分提供便捷方法[6-7]，虽对酸枣仁中脂肪油的GC-MS技术测定已有相关研究[8-9]，但尚未见采用GC-MS对不同采收期酸枣仁中脂肪油成分进行动态分析和确定采收期的报道。因此本课题组在前期研究基础上，利用GC-MS分析不同采收期酸枣仁中脂肪油成分进行动态分析，以期为酸枣仁最佳采收时间的优选提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酸枣仁分别在7月15日（果实半红期，S1）、8月15日（果实脆熟期，S2）和9月15日（果实完熟期，S3）采自河北省邢台县东川口村，经河北中医学院药学院郑玉光教授鉴定为真品；正己烷（色谱纯）：天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890A-5977B）：美国安捷伦科技有限公司；电子分析天平（BSA224SCW）：赛多利斯科学仪器有限公司；超声波清洗仪（KQ-250DE）：昆山市超声仪器有限公司；加热磁力搅拌器（RCT Basic）：德国IKA公司。
1.3 方法
1.3.1 酸枣仁脂肪油成分提取
精密称取3个时期酸枣仁粉末（过60目筛）2.0 g，置索氏提取器中，加入正己烷100 mL，水浴回流提取4 h，减压蒸出溶剂，得黄绿色脂肪油，称重，计算得率。在上述脂肪油中加入5 mL 0.5 mol/L NaOH的甲醇溶液，回流反应1 h后，加入8 mL BF3乙醚溶液继续反应30 min，反应结束后，用正己烷萃取和饱和NaCl溶液洗涤有机相，有机相用无水Na2SO4干燥，并定容于25mL容量瓶中，备用。
1.3.2 GC-MS色谱条件
气相色谱条件[10]为色谱柱：HP-5柱（50m×250μm×0.25 μm）；程序升温：起始温度 60 ℃，保持 2 min，以3℃/min升温至165℃，再以20℃/min升温至280℃，保持5 min；载气为高纯氮气，载气流量为1.0 mL/min；进样量 1 μL，分流进样，分流比为 10∶1；汽化室温度为250℃。
质谱条件为EI离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；四极杆质量监测器，温度150℃；扫描范围m/z：40 amu～500 amu；溶剂延迟 4 min；载气为氦气（纯度99.999%）。
1.4 数据处理
经GC-MS分析得到3个采收期的酸枣仁样品的总离子流图，各峰经质谱计算机数据系统检索并与NIST 11标准质谱检索库和参考有关文献数据进行定性分析，采用峰面积归一法测定各成分的相对含量。
2 结果与分析
2.1 GC-MS色谱条件方法学考察
对3个采收期的酸枣仁样品的代表性总离子流图如图1所示。
酸枣仁脂肪油成分及其相对百分含量见表1。
图1 不同时期酸枣仁中脂肪油组分的GC-MS代表性总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of fatty oil components of ziziphi spinosae semen in three seasons
A.7月15日；B.8月15日；C.9月15日。
表1 3个时期酸枣仁脂肪油化合物的组成和相对含量
Table 1 The compositions a-relative contents of fatty oil components among ziziphi spinosae semen with three seasons processed
注：—表示未检出。
序号保留时间/min 化合物 化学式 images/BZ_171_1697_457_2270_491.png相似度/% 平均相对含量/%S1 S2 S3 S1 S2 S3 S1 S2 S3 1 — — 4.199 3-甲基庚烷（3-methylheptane） C8H18 — — 98 — — 0.37 2 — — 4.614 顺-1，2-二甲基环己烷（cis-1，2-dimethyIcyclohexane） C8H16 — — 97 — — 0.47 3 4.965 — 4.925 顺-1-乙基-3-甲基环己烷（cis-1-ethyl-3-methyl-cyclopentane） C8H16 98 — 99 0.24 — 0.09 4 — — 6.026 3-乙基己烷（3-Hexane） C8H18 — — 99 — — 0.18 5 6.192 6.192 6.187 硫酸二乙酯（diethyl sulfate） C4H10O4S 99 99 99 2.24 0.54 1.10 6 — — 7.530 肉豆蔻酸甲酯（methyl myristate） C15H30O2— — 98 — — 0.34 7 8.978 — 9.025 反式-1，3-二甲基环己烷（trans-1,3-dimethylcyclohexane） C8H16 98 — 99 0.5 0.18 8 9.349 9.356 9.352 十二酸甲酯（methyl Laurate） C20H40O 99 99 99 0.66 0.11 0.18 9 — — 10.625 异丙环戊烷（isopropylcyclopentane） C8H16 — — 99 — — 0.14 10 — — 11.345 12-甲基-十三烷酸甲酯（methyl 12-methyltridecanoate） C15H30O2 — — 99 — — 0.15 11 13.882 13.882 13.896 2，5-二叔丁基酚（2,5-di-tert-butylphenol） C14H22O 99 99 99 0.43 0.12 0.21 12 — 15.778 — 4，8-二甲基壬醇（4,8-dimethyl nonanol） C11H24O — 97 — — 0.11 —1319.003 — — 环辛烷（cyclooctane） C8H1699— — 0.17 — —14 20.580 — — 2-乙基苯甲醛（2-ethyl-benzaldehyde） C9H10O 99 — — 0.54 — —15 21.047 — 21.049 十三酸甲酯（tridecanoic acid,methyl ester） C14H28O2 98 — 98 0.08 — 0.21 16 23.745 23.745 23.739 棕榈酸甲酯（methyl hexadecanoate） C17H34O2 99 99 99 5.51 5.42 5.21 17 26.799 26.799 26.791 亚油酸甲酯（methyl linoleate） C19H34O2 99 99 99 33.01 36.28 34.27 18 26.905 26.901 26.902 油酸甲酯（methyl oleate） C19H36O2 99 99 99 43.66 44.01 45.43 19 26.979 26.988 26.979 叶绿醇（phytol） C21H4O2 99 99 99 2.37 2.22 1.04 20 27.307 27.302 27.302 硬脂酸甲酯（methyl stearate） C19H38O2 99 99 99 3.11 2.94 2.77 21 27.971 27.969 27.971 亚油酸乙酯（ethyl linoleate） C20H38O2 99 99 99 0.18 0.27 0.18 22 29.115 29.120 — 7-羟基-3-（1，1-二甲基-2-丙烯基）香豆素（7-hydroxy-3-（1，1-dimethylprop-2-enyl）coumarin） C14H14O3 99 99 — 1.01 0.37 —23 29.396 29.401 — 角鲨烯（squalene） C30H50 98 99 — 0.38 0.36 —24 30.005 30.01 30.01 顺式-11-二十碳烯酸甲酯（11-eicosenoic acid methyl ester） C21H40O2 99 99 99 3.19 3.55 3.96 25 30.370 30.379 30.379 花生酸甲酯（methyl Arachidate） C21H42O2 99 99 99 0.73 1.01 0.96 26 33.525 33.516 33.525 山嵛酸甲酯（methy 20-methyl-heneicosanoate） C23H46O2 99 99 99 0.72 0.90 0.91 27 — — 33.954 芥酸酰胺（cis-13-docosenoamide） C22H43NO— — 99 — — 0.29 28 34.895 34.891 — 环戊基十一酸甲酯（cyclopentaneundecanoicacidmethyleste） C17H34O2 98 96 — 0.29 0.17 —29 — 38.189 38.194 二十四酸甲酯（methyl tetracosanoate） C25H50O2 — 99 98 — 0.52 0.56
2.1.1 精密度试验
取酸枣仁样品（S3），按“1.3.1”项条件下制备供试品，在“1.3.2”项色谱条件下连续进样6次，以棕榈酸甲酯（峰a）为参照，测得6个共有峰（相对含量＞1%）的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值均＜0.47%，表明仪器精密度良好。
2.1.2 重复性试验
取酸枣仁样品（S3），共 6份，按“1.3.1”项条件下制备供试品，在“1.3.2”项色谱条件下分别进样，以棕榈酸甲酯（峰a）为参照，测得6个共有峰（相对含量＞1%）的相对保留时间的RSD值均＜0.86%，相对峰面积的RSD值均＜2.76%，表明该方法重复性良好。
2.1.3 稳定性试验
取同批酸枣仁样品（S3）的供试品溶液，在“1.3.2”项色谱条件下分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样，以棕榈酸甲酯（峰a）为参照，测得6个共有峰（相对含量＞1%）的相对保留时间的RSD值均＜0.56%，相对峰面积的RSD值均＜2.32%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2 不同时期酸枣仁中脂肪油的组成特点
由表1可知，酸枣仁S1、S2和S3样品中脂肪油量分别为23.17%、28.35%和29.25%，共检出并鉴定到29种脂肪油成分，酸枣仁S1、S2和S3样品中分别检测出20、17和23种脂肪油成分，包括脂肪酸类14种、碳氢化合物8种、醇类4种、醛类1种、含氮化合物1种和含硫化合物1种。
脂肪油成分的种类与相对含量随着时间的推移逐渐增加，其中酸枣仁S3样品中脂肪油成分种类与含量均为最多，共23种，总含量为292.5 mg/g，其次为酸枣仁S1样品，共20种，含量231.7 mg/g，酸枣仁S2样品中最少，共17种，含量283.5 mg/g。
由图1和表1可知，酸枣仁S1、S2和S3样品中脂肪油物质主要以脂肪酸类、碳氢化合物和醇类化合物为主，其中酯类物质种类最多，脂肪油成分含量较高，在酸枣仁 S1、S2、S3 中分别检测鉴定到 11、11、13 种，相对含量分别为92.85%、97.29%、95.99%；其次是碳氢化合物，在酸枣仁S1、S2、S3中分别检测鉴定到4、1、7种，相对含量分别为1.29%、0.36%、1.43%；再是醇类物质，在酸枣仁S1、S2、S3中分别检测鉴定到 3、4、2种，相对含量分别为2.10%、0.71%、0.40%。
3 结论与讨论
酸枣仁是我国传统的中药，其种植和用药历史已有几千年，近年开发的酸枣仁油被誉为“东方睡油”，具有较好的治疗失眠的功效。酸枣仁的生长发育阶段对其有效成分调控和积累，其中脂肪性类化合物的种类、数量和含量随着酸枣仁的发育而逐渐升高，在果成熟时达到高峰[9]。本试验采用GC-MS技术对河北省道地酸枣仁不同采收期的脂肪油成分进行测定，共鉴定出29种成分，分为不饱和脂肪酸类、饱和脂肪酸类、碳氢化合物和醇类化合物这4大类组分。3个不同时期酸枣仁分别检测出20、17、23种脂肪油成分，由此可见脂肪油成分在种类数量上相差不大，但各类脂肪油成分的相对含量存在一定差异。不同时期的10个共有脂肪油成分表现出4种变化趋势：（1）呈现出持续上升的趋势有3种：反式油酸甲酯、顺式-11-二十碳烯酸甲酯、山嵛酸甲酯；（2）呈现出持续下降的趋势有3种：棕榈酸甲酯、花生酸甲酯、硬脂酸甲酯；（3）呈现出高-低-高的复杂变化有3种：硫酸二乙酯、叶绿醇、2，5-二叔丁基酚；（4）呈现出低-高-低的变化趋势有3种：亚油酸甲酯、反油酸乙酯、花生酸甲酯。
酸枣仁中的许多饱和/不饱和脂肪酸类物质对人类健康有益，有很强商业价值，越来越受到医药、保健品企业的重视。本研究初步阐述了酸枣仁不同时期脂肪油成分的变化，其中S3样品中脂肪油量最高，且鉴定出23种成分。该结论与课题组前期[11]对酸枣仁的高效液相色谱分析斯皮诺素和酸枣仁皂苷A的结果十分相似，即9月中旬后酸枣果实变为全红后其含量最高，也进一步确定酸枣仁在9月中旬后再进行采收比较合理。
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