志贺氏菌（Shigella）通称痢疾杆菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位，它主要侵染人体的结肠，引发肠道炎症、溃疡以及频繁的黏液性血性腹泄，少数严重可导致惊厥、低钠血症、低血糖、溶血性尿毒综合征、肠穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6亿人感染此类疾病，约有110万人死亡，其中5岁以下儿童为主要受害者[3]。由于水源或食品受到志贺氏菌污染会引起痢疾、腹泻等疾病[4]。因此，建立一种快速、准确的志贺氏菌检测方法显得尤为重要。目前，志贺氏菌常用检测方法主要有两大类：一是传统生化培养法，二是快速检测法。传统生化培养法结果准确，且无复杂设备等特点，但由于步骤繁琐、周期长、试剂繁多等缺陷，远远不能满足现代快速检测的需要[5-6]。基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术、分子生物学原理的各种快速检测法具有准确等优点，但由于其需要昂贵的试剂和设备、有时需带回专业实验室检测等缺陷，无法满足现场分析的需要[7-9]。经典的免疫学分析方法具备灵敏度高、特异性强、周期短、操作简单和成本低等优点，广泛用于食品有毒有害物的检测中，其中酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最为常用[10]。针对以上情况，本研究以广泛污染水产品的志贺氏菌抗原免疫动物获取多克隆抗体，在此基础上建立双抗夹心ELISA方法，实现对水产样品的志贺氏菌定性及定量快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumins，OVA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：美国 Sigma 公司；石蜡油、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）：Biosharp 公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：北京博奥森生物技术有限公司；志贺氏菌培养基、聚乙二醇 1500 （polyethylene glycol1500，PEG1500）：Gibco公司；新西兰大耳白兔（雌性，两月龄）：军事科学研究院；志贺氏菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌菌株：河北省农产品食品质量安全检测重点实验室保存制备；LB肉汤培养基：青岛天祺生物科技有限公司；蛋白纯化柱（Protein A-Sepharose 4B）：美国Amersham公司；扇贝：市购；其它试剂均为分析纯级。
1.2 仪器与设备
Thermo Fisher Multiskan酶标仪：美国thermo公司；RH-KT加热磁力搅拌器：美国IKA公司；Profinia蛋白纯化仪、Powerpac蛋白电泳仪：美国BIO-RAD公司；SPH-300D恒温摇床：上海世平实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 免疫原制备
将实验室保存的志贺氏菌（ATCC12022）活化后，挑取菌种接种到LB肉汤培养基（200 mL）中，摇床200r/min，37℃振荡培养24h，培养后的菌液5000r/min离心10min，收集的菌体用0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤两次，加入 30 mL 0.5%福尔马林，室温20℃下作用24 h灭活菌体，5 000 r/min 离心 10 min，收集菌体[11-12]。
1.3.2 抗志贺氏菌多克隆抗体制备
以灭活的志贺氏菌为免疫原，选择新西兰大白兔（雌性，两月龄）进行背部皮下多点免疫。首免时，50 μL菌液与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，按剂量100μL/只进行注射；两周后，同样剂量加强免疫，佐剂换成为弗氏不完全佐剂，之后进行第3次免疫。每次免疫后10 d，静脉采血检测血清的效价。待血清中抗体效价达到80 000左右后动脉取血，采用以Protein A-Sepharose 4B作亲合层析介质纯化抗血清并用Western Blot检测抗体，最后测定其蛋白浓度后分装保存于-20℃冰箱中作为捕获抗体[13]。
1.3.3 酶标抗体制备
称取4 mg HRP溶于0.5 mL蒸馏水中，加入1 mL 0.06mol/LNaIO4新配溶液，4℃下磁力搅拌混匀30min。加入0.6 mL 0.16 mol/L乙二醇溶液，4℃下磁力搅拌再次混匀30 min。加入4 mg抗志贺氏菌多克隆抗体，混合均匀后装入透析袋中，4℃下放入1 000 mL碳酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH9.6）中透析 12 h，中间换取缓冲液3次。将透析袋中液体取出，加入0.2 mL 5 mg/mL NaBH4溶液，4℃下缓慢混匀2 h。然后采用饱和硫酸铵沉淀法纯化，沉淀物用1 mL PBS溶解，4℃下透析12 h，中间换取缓冲液3次。后加入等体积甘油，-20℃冰箱中保存作为检测抗体[14-15]。
1.3.4 双抗夹心ELISA检测方法的建立
采用棋盘滴定法优化捕捉抗体与检测抗体稀释度，将纯化后的志贺氏菌多克隆抗体按照优化稀释度稀释4℃包被过夜（100 μL/孔），磷酸盐吐温缓冲液（phosphate tween buffered solution，PBST） 洗涤 3 次，0.5%脱脂乳粉封闭液封闭（100 μL/孔），37℃封闭 1 h。弃去封闭液，PBST洗涤3次，加入梯度稀释的志贺氏菌菌液，100 μL/孔，并设置空白对照和阴性对照，37℃孵育30 min，PBST洗涤4次。将酶标抗体按优化结果稀释，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗涤 4 次，加入TMB底物显色液进行显色，100μL/孔，37℃孵育15min；加入终止液（2 mol/L H2SO4），50 μL/孔，终止显色反应；在酶标仪上测定OD450nm值[16]。
1.3.5 双抗夹心ELISA检测志贺氏菌的特异性
将大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌稀释成1×106cfu/mL，采用建立的双抗夹心ELISA方法进行检测。设立志贺氏菌为阳性对照，同时作阴性对照，重复试验3次，得出平均值，以检验双抗夹心ELISA体系的特异性。
1.3.6 人工接种扇贝的检测
扇贝是经检测不含志贺氏菌的阴性样品。扇贝样品的制备：无菌条件下，将扇贝肉打成肉泥，称取扇贝肉泥10 g，接入志贺氏菌不同浓度的菌悬液，按10、1、0.1 cfu/g样品接种量接种，并以无菌生理盐水作阴性对照。在上述各样品中加入100 mL肉汤培养基，混匀，37℃，转速180 r/min的恒温摇床上分别增菌培养5、10、20 h后取样检测OD值，同时用空白血清作阴性对照，大于阴性对照2.1倍（实验组OD值∶对照组OD值≥2.1）则为阳性[17]。
1.4 数据处理
采用SPSS软件进行数据处理分析，试验数据均以M±SD表示。
2 结果与分析
2.1 志贺氏菌多克隆抗血清效价的测定
选择4只新西兰大白兔（雌性，两月龄）分别编号为1、2、3、4。将制备好的免疫原同时免疫4只大白兔，每次免疫后10 d，静脉采血后，采用间接ELISA对志贺氏菌免疫大白兔的抗血清进行效价测定，其中3号大白兔的抗血清效价最好，3号大白兔的抗血清效价测定结果见图1。
图1 3号大白兔的抗血清效价
Fig.1 Antiserum titer of the third rabbit
由图1可以看出，3号大白兔随着免疫次数的增加，抗血清效价都有不同程度的增长，尤其是在第4次免疫后，其抗血清效价提高到81 000左右，最终选择3号大白兔的血清作为捕获抗体。
2.2 抗体纯化与检测
抗体纯化与Western Blot免疫检测结果见图2。
图2 抗体纯化与Western Blot免疫检测
Fig.2 Antibody purification and immunologic detection of Western Blot
A.抗体纯化电泳图；B.抗体Western Blot免疫图。
M.蛋白 Maker；1.抗体纯化带；2.Western Blot检测。
由图2A可知，图中出现两条清晰的条带，一条大小为55 kDa，为重链带。另一条大小为26 kDa，为轻链带。且聚丙酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中没有明显的杂带，说明其纯化效果好。取志贺氏菌菌体悬液进行12%SDS-PAGE，转聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后用纯化后的抗血清进行Western Blot免疫检测，结果如图2B所示。从图中可以看出，每个菌株都出现了多条条带，说明制备的志贺氏菌多克隆抗体对菌体有较好的识别能力，同时说明志贺氏菌菌株中有多个蛋白可以刺激机体产生免疫反应。
2.3 双抗夹心体系
棋盘滴定优化结果见表1。
表1 棋盘滴定法优化OD结果
Table 1 OD results of checkerboard titration
检测抗体浓度/（μg/mL）捕捉抗体浓度25 g/mL 12.5 g/mL 6.25 g/mL 3.125 g/mL 1.563 g/mL 0.78 g/mL 0.39 g/mL 0.195 g/mL 20 2.94 2.657 2.261 2.112 1.728 1.394 1.302 0.897 10 2.502 2.245 1.915 1.752 1.613 1.287 1.121 0.846 5 2.134 1.989 1.513 1.21 0.978 0.717 0.541 0.377 2.5 1.872 1.719 1.288 1.007 0.791 0.582 0.295 0.161 1.25 1.732 1.621 1.121 0.745 0.648 0.341 0.178 0.098 0.625 1.688 1.516 1.097 0.539 0.457 0.256 0.094 0.075阴性对照 0.022 0.023 0.024 0.021 0.025 0.024 0.025 0.021空白对照 0.016 0.015 0.01 0.011 0.013 0.011 0.012 0.014
从表1可以看出，当捕捉抗体和检测抗体的浓度分别为3.125 g/mL和2.5 μg/mL时，测定的OD值为1.007，这个数值在所有OD值中最接近1。表明该体系志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体的最佳包被质量浓度为3.125 g/mL，辣根过氧化物酶标记志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体的最佳稀释质量浓度为2.5 μg/mL。
2.4 双抗夹心体系标准曲线建立
根据双抗夹心体系优化的结果，最终确定的工作条件：捕获抗体的包被量为0.3125 g/孔，4℃下包被过夜，0.5%脱脂乳粉封闭液封闭，37℃封闭1 h，加入志贺氏菌菌液，从1×107cfu/mL开始用PBS缓冲液10倍梯度进行稀释，100 μL/孔室温20℃下反应1 h，加入酶标抗体，37℃孵育1 h，37℃显色15 min。最后用终止液终止反应，用酶标仪在450 nm下读取吸光度值，绘制标准曲线见图3。根据计算可得线性方程为y=6×10-7x+0.142，根据方程可计算检测限（limit of detection，LOD）为4.12×104cfu/mL，检测曲线的线性范围为 4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。
图3 志贺氏菌双抗夹心ELISA标准曲线
Fig.3 Standard curve line of double antibody sandwich ELISA
2.5 双抗夹心体系的特异性
在双抗夹心ELISA体系中检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌，同时检测阴性对照与阳性对照志贺氏菌，结果如图4所示。
由图4可知，志贺氏菌阳性对照正常显色并检出，而其它菌株均不显色。说明建立的双抗夹心ELISA体系与大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌无交叉反应性，具有良好的特异性。
图4 检测不同菌属菌株的交叉反应
Fig.4 detection of the cross-reaction of different strains of bacteria
2.6 扇贝样品人工接种志贺氏菌检测
扇贝样品人工接种志贺氏菌检测试验结果见表2。
表2 双抗夹心ELISA检测扇贝中人工接种的志贺氏菌
Table 2 Detection of Shigella in artificial inoculation of scallop by sandwich ELISA
注：+表示强阳性。
添加量/（cfu/100 g）不同培养时间下试验组OD∶对照组OD比值5 h 10 h 20 h 0.1 0.712 1.309 3.419 1 1.94 2.013 11.42 10 2.942 10.85 ＋
由表2可以得出，当样品增菌培养5 h时，取样经双抗夹心体系检测获得试验组和对照组OD值，根据ELISA检测判断标准，当接种量为0.1、1 cfu/100 g时，试验组/对照组＜2.1，结果为阴性，当接种量为10 cfu/100 g时，呈弱阳性。增菌培养10 h取样检测时，接种量为0.1 cfu/100 g和1 cfu/100 g的扇贝样品试验组/对照组＜2.1，结果为阴性，接种量为10 cfu/100 g的扇贝样品试验组/对照组≥2.1，可检测到志贺氏菌的存在。当增菌培养20 h时取样检测，接种量为0.1 cfu/100 g、1 cfu/100 g和10 cfu/100 g的扇贝样品试验组/对照组≥2.1，结果均为阳性。因此建立的双抗夹心ELISA检测体系的检测样品，经过10 h后增菌志贺氏菌检出限（LOD）为105cfu/mg。
3 结论
以志贺氏菌多克隆抗体为捕获抗体进行包被，以HRP标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体，建立了志贺氏菌的双抗夹心ELISA检测体系，建立的标准曲线线性较好，R2=0.999 4，检测限（LOD）为 4.12×104cfu/mL，检测曲线的线性范围为4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。在扇贝样品的添加试验中，建立的双抗夹心ELISA方法进行检测，接种量105cfu/mg的样品在培养10 h后可检出阳性结果，表明本方法具有良好的灵敏度与特异性。
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