桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又名桦树茸，属于多孔菌科褐卧孔菌属，生长于白桦、银桦、榆树等的树皮下或砍伐后的树木枯干上，是一种药食两用的木腐菌[1]。桦褐孔菌主要分布在北半球[2]。早在16世纪，俄罗斯民间用其治疗消化系统癌症等疑难杂症。现代研究表明，桦褐孔菌具有抗肿瘤、降血糖、调节免疫、抗炎抗氧化等作用[3-7]。桦褐孔菌中含有多糖类、三萜类、甾体类、酚类、有机酸、多元醇等多种化学成分，其中多糖类成分被认为是其主要活性物质之一[8-10]。由于桦褐孔菌良好的保健功效，人们将其泡茶当做日常保健饮品，也将其加入面包、糖果中[11]或被用作食品防腐剂[12]。随着研究的深入，桦褐孔菌可被用于食品、药学以及化工等产业，具有巨大的开发价值和广阔的应用前景。
超声波的空化作用使溶剂易于渗入细胞，加速物质溶解，从而达到提取有效成分的目的[13]。相比于传统的回流提取，超声辅助提取法不仅可以缩短提取时间，并且能够防止高温导致的成分降解，是一种极为有效的提取方式[14-16]。响应曲面法（response surface methodology，RSM）是一种应用较广的试验优化方法，具有设计全面、试验精密度高等优点，可以有效快速地确定多因子系统的最佳条件[17]。本试验基于Box-Behnken响应面法优化超声波辅助提取桦褐孔菌多糖的提取工艺，确定其最佳提取条件；并通过DPPH自由基清除试验评价其抗氧化活性，旨在为桦褐孔菌多糖的研究及开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桦褐孔菌：吉林长白山，打粉，过60目筛，避光密封；维生素 C（纯度＞99%）、DPPH（纯度＞99%）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、牛血清蛋白、氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂；考马斯亮蓝G-250：北京索莱宝科技有限公司；以上试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；FD-1-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Z326K离心机：德国赫默公司；SYNERGY|H1多功能微孔检测仪：美国博腾仪器有限公司；Milli-Q水纯化系统：美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
取桦褐孔菌粉末，加入4倍体积90%的乙醇溶液，80℃超声2次，每次20 min，抽滤，滤渣在50℃的水浴加热挥干残留的乙醇，得到预处理桦褐孔菌粉末。
1.3.2 桦褐孔菌多糖提取工艺流程
预处理的桦褐孔菌粉末→加入蒸馏水超声辅助提取→离心，取上清液→减压浓缩→乙醇沉淀→离心，取沉淀→冷冻干燥→桦褐孔菌粗多糖
1.3.3 桦褐孔菌多糖提取率的计算
桦褐孔菌多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[18]。以葡萄糖作为标准品，490 nm处测定吸光度，以吸光度（y）为纵坐标，多糖质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=4.78x-0.013 4（R2=0.995 81），线性范围为0.01 mg/mL～0.10mg/mL。根据公式（1）计算多糖提取率。
式中：x为标准曲线上计算出的质量浓度，mg/mL；V1为配制的溶液体积，mL；V2为取样量，mL；m 为桦褐孔菌粉末质量，g。
1.3.4 超声波辅助提取法的单因素及响应面试验设计
利用超声波辅助方法，蒸馏水为溶剂，以超声时间、超声温度、液料比、提取次数为考察因素进行影响桦褐孔菌多糖提取率的单因素试验。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面法进行提取工艺的优化设计。
1.3.5 桦褐孔菌粗多糖中蛋白含量的测定
桦褐孔菌粗多糖中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[19]。以牛血清蛋白作为标准品，595 nm处测定吸光度，以吸光度（y）为纵坐标，蛋白质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=2.46x+0.008 5（R2=0.991 86），线性范围为 0～0.2 mg/mL。
1.3.6 桦褐孔菌多糖纯化工艺流程
桦褐孔菌粗多糖粉末→溶于蒸馏水→加入10%三氯乙酸（tri choroacetic acid，TCA）溶液搅拌→离心，取上清液→减压浓缩→乙醇沉淀→离心,取沉淀→冷冻干燥→桦褐孔菌精制多糖
1.3.7 桦褐孔菌多糖对DPPH自由基清除作用
参考操丽丽等[20]的方法，具体操作如下：将100 μL不同浓度的精制多糖溶液与 2 900 μL 120 μmol/L DPPH自由基储备液在37℃避光反应30 min，利用酶标仪测定517 nm下的吸光度A样品。以维生素C作为阳性对照，同时测定空白组（样品不加DPPH）吸光度A空白和阳性对照组样品吸光度A对照。
根据公式（2）计算DPPH自由基清除率。
1.4 数据处理
采用Excel 2010软件对结果进行分析处理，试验结果均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声时间对多糖提取率的影响
取处理好的桦褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸馏水，在60℃温度下，超声辅助提取3次，分别超声10、20、30、40、50 min，结果如图 1 所示。
图1 超声时间对多糖提取率的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides from I.obliquus
由图1可知，在一定范围内桦褐孔菌多糖提取率随着超声时间的增加而增大，当超声时间到达30 min时，多糖提取率达到了最高值，但随着超声时间的增加，多糖提取率不再增加。
2.1.2 超声温度对多糖提取率的影响
取处理好的桦褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸馏水，分别在 20、30、40、50、60 ℃温度下，超声辅助提取3次，每次30 min，结果如图2所示。
由图2可知随着温度的升高，桦褐孔菌多糖提取率增加，当温度达到50℃时，多糖提取率达到了最高点，之后温度升高，桦褐孔菌多糖提取率呈下降趋势。说明在超声条件下，过高的温度不利于多糖的析出。
2.1.3 液料比对多糖提取率的影响
取处理好的桦褐孔菌粉末0.5 g，分别按液料比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）加入蒸馏水，在 60℃温度下，超声辅助提取3次，结果如图3所示。
由图3可知，液料比为20∶1（mL/g）时多糖提取率达到最大，此后随着液体量的增大，多糖提取率不再增加。故选择液料比20∶1（mL/g）。
图2 超声温度对多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides from I.obliquus
图3 液料比对多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides from I.obliquus
2.1.4 提取次数对多糖提取率的影响
取处理好的桦褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸馏水，在 60 ℃温度下，超声辅助提取 1、2、3、4、5 次，结果如图4所示。
图4 提取次数对多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of extract times on the yield of polysaccharides from I.obliquus
由图4可知，提取次数越多，多糖提取率越大，但是提取超过3次之后，多糖提取率增加幅度不明显。为了节约资源，提高效率，将提取设为3次。
2.2 采用响应面法优桦褐孔菌多糖提取工艺
2.2.1 多糖提取试验方案和因素水平
在单因素试验基础之上，固定提取3次，采用三因素三水平，以多糖提取率作为响应值，根据Box-Behnken的中心组合试验设计的方案分别进行了17组试验，其中1～12组为析因试验，13～17组为中心试验。结果见表1。
表1 响应面分析试验设计及结果
Table 1 Design and results for response surface method
试验号 A超声时间/min B超声温度/℃C液料比/（mL/g）多糖提取率/%1 20 40 20∶1 3.23 2 40 40 20∶1 3.13 3 20 60 20∶1 3.35 4 40 60 20∶1 3.42 5 20 50 15∶1 3.04 6 40 50 15∶1 3.26 7 20 50 25∶1 3.34 8 40 50 25∶1 3.43 9 30 40 15∶1 3.06 10 30 60 15∶1 3.37 11 30 40 25∶1 3.30 12 30 60 25∶1 3.48 13 30 50 20∶1 3.90 14 30 50 20∶1 3.91 15 30 50 20∶1 3.84 16 30 50 20∶1 4.10 17 30 50 20∶1 3.80
2.2.2 响应面分析方案及结果
采用Design Expert（10.0.7）软件对试验结果进行回归分析，得到回归方程为Y=3.91+0.035A+0.11B+0.1C+0.042AB-0.032AC-0.033BC-0.33A2-0.30B2-0.31C2。回归方程一次项中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由方程可知，影响桦褐孔菌多糖提取率的因素主次顺序如下：B＞C＞A。对方程进行回归方差分析，结果见表2。
由表2的分析结果可以看出，模型P＜0.01，说明二次多项模型具有极显著性，失拟项不显著，模型决定系数R2=0.903 6，表明模型拟合度良好，可知该模型与实际试验有着良好的拟合关系。此外，一次项A不显著，B、C 显著；二次项 A2、B2、C2极显著；交互项 AB、AC、BC项均不显著。
2.2.3 提取工艺的响应曲面分析和优化
图5～图7分别为超声时间、超声温度、液料比三因素影响桦褐孔菌多糖提取率的响应面和等高线图。
综合分析响应面试验结果并依据回归模型确定桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺参数为：超声时间30.575min，超声温度51.864℃，液料比 20.758∶1（mL/g），此时理论上多糖提取率为3.93%。为验证试验的可靠性，并考虑可操作性，将最优条件修改为：超声时间31 min，超声温度 52 ℃，液料比 21 ∶1（mL/g），超声辅助提取3次，进行3次平行试验，得到的桦褐孔菌多糖提取率为（3.81±0.19）%，实际值与理论预测值相对误差为3.1%。此结果与预测值比较接近，说明此模型真实可靠，对桦褐孔菌多糖的提取工艺优化具有一定指导意义。
表2 回归模型方差分析
Table 2 Analysis of variance for the developed polynomial model
注：**差异极显著（P＜0.01）；*差异显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1.60 9 0.18 17.67 0.000 5 **A-超声时间 0.009 8 1 0.009 8 0.98 0.356 0 B-超声温度 0.10 1 0.10 10.09 0.015 6 *C-液料比 0.084 1 0.084 8.38 0.023 2 *AB 0.007 225 1 0.007 225 0.72 0.424 2 AC 0.004 225 1 0.004 225 0.42 0.537 1 BC 0.004 225 1 0.004 225 0.42 0.537 1 A2 0.46 1 0.46 46.04 0.000 3 **B2 0.37 1 0.37 36.82 0.000 5 **C2 0.41 1 0.41 40.64 0.000 4 **误差 0.070 7 0.010失拟项 0.017 3 0.005 683 0.43 0.7446纯误差 0.053 4 0.013总误差 1.67 16
图5 超声时间和超声温度的响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots of ultrasonic time and temperature
图6 超声时间和液料比的响应面和等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots of ultrasonic time and liquid/solid ratio
图7 超声温度与液料比的响应面与等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and liquid/solid ratio
2.3 桦褐孔菌粗多糖中多糖和蛋白含量
取10 mg粗多糖，溶于10 mL蒸馏水中，平行试验3次，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量分别为1.86、1.90、1.93 mg/mL。采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量分别为1.39、1.34、1.43 mg/mL，桦褐孔菌粗多糖中多糖质量分数为19.0%（以葡萄糖计），蛋白质量分数为13.9%（以牛血清蛋白计）。结果表明，桦褐孔菌粗多糖粉末中除含有多糖和蛋白以外，还有大量其它成分。根据文献报道，推测为皂苷、多酚等水溶性成分[21-22]。
2.4 桦褐孔菌多糖DPPH自由基清除能力
桦褐孔菌多糖的DPPH自由基清除能力见图8。
人类的多种疾病均与自由基有关，包括炎症、心脑血管疾病、癌症、糖尿病等等。自由基属于强氧化剂，一旦在人体内蓄积过量，就会造成组织损伤或加速细胞老化甚至凋亡[23-24]。抗氧化作用可消除自由基，对人体正常的新陈代谢有重要意义。如图8所示，桦褐孔菌多糖对DPPH自由基有一定的清除作用，但作用不如维生素C。当桦褐孔菌多糖浓度较低时，DPPH自由基清除率随着浓度的增大而增加；在5 mg/mL时，清除率最大，达到61.39%。此后随着多糖浓度的增大，清除率反而下降，此结果表明过高浓度的多糖不利于DPPH自由基的消耗。
图8 桦褐孔菌多糖对DPPH自由基的清除作用
Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide from I.obliquus on DPPH free radical
3 结论
采用超声辅助法提取桦褐孔菌多糖，该方法操作简便，节约成本。利用响应面法对超声辅助提取多糖的工艺参数进行优化，模型拟合度良好。优化的工艺参数结果为：超声时间31 min，超声温度52℃，液料比为21∶1（mL/g），此条件下，桦褐孔菌多糖提取率为（3.81±0.19）%，工艺验证试验表明此模型真实可靠，可以用于桦褐孔菌多糖提取的工艺优化。采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法分别对桦褐孔菌粗多糖中的多糖和蛋白进行测定，结果显示桦褐孔菌粗多糖中多糖质量分数为19.0%（以葡萄糖计），蛋白质量分数为13.9%（以牛血清蛋白计）。DPPH自由基清除试验说明桦褐孔菌精制多糖具有一定的抗氧化能力，且浓度在5 mg/mL时，清除率最大为61.39%。该研究为桦褐孔菌及其多糖的进一步开发利用提供了理论依据。
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