白木香（Aquilaria sinensis），瑞香科沉香属绿叶乔木，是我国特有的珍贵濒危药用植物，主产于我国广东、广西、海南、福建等地[1]。树中含树脂部分称为沉香，为珍贵的中药材，《中国药典》2015年版将白木香树定义为沉香的唯一来源[2]。白木香在南方各省大面积人工栽培，但由于结香周期长且产量较低，短期内难以产生效益[3]。近年来，以往被当废料处理的白木香叶受到学者们的重视。研究发现，白木香的叶片中含黄酮、酚类、苷类以及挥发性油成分[4]，尤其是黄酮类成分芒果苷，具有抗肿瘤、抗氧化、解热、消炎、改善记忆等生物活性[5]，作为叶茶开发具有较高的开发价值和潜力。2018年11月，广东省卫生健康委员会颁布了广东省食品安全地方标准DBS 44/011—2018《白木香叶》，白木香叶可作为代用茶冲泡饮用，但该标准未对白木香叶片的成熟度进行区分。目前有关白木香叶片营养成分的报道甚少，而白木香叶茶原材料选择以及不同干燥参数对叶茶营养品质的影响也尚不清楚。前期研究发现白木香嫩叶在制茶时有难以去除的苦涩味，因此，本研究通过比较半成熟叶片和老叶、以及不同干燥温度和时间下叶茶营养成分差异，为白木香叶茶的加工提供指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
白木香：种植于惠州市惠东县稔山镇。随机摘取不同成熟度的白木香叶，包括半成熟叶（叶片完全展开，绿色）和老叶（成熟叶，深绿色），鼓风干燥箱60℃烘干，粉碎过60目筛，备用。白木香叶见图1。
白木香叶茶以半成熟叶为材料，结合了绿茶和乌龙茶的制茶工艺制得叶茶成品，其工艺流程：晒青→晾青→5次做青→杀青→作形→松包打散→不同干燥条件下干燥→摊晾→精选→包装，其中干燥条件为120℃初烘1 h、100℃焙火2 h，得到叶茶A；135℃初烘1.5h、110℃焙火2.5h，得到叶茶B；145℃初烘1.5h、115℃焙火2.5 h，得到叶茶C。
图1 白木香叶
Fig.1 The leaves of Aquilaria sinensis
左为半成熟叶；右为老叶；标尺为2 cm
1.2 仪器与试剂
BAO-150A鼓风干燥箱：施都凯仪器设备有限公司；CPX5800H-C超声波清洗仪：美国Branson公司；1260HPLC高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；Sykam S-433D型全自动氨基酸分析仪：赛卡姆（北京）科学仪器有限公司；UV-2405型紫外可见分光光度计：日本岛津公司。芒果苷、没食子酸、芦丁的标准品：上海安谱试验科技股份有限公司；混合氨基酸标准品：Sigma公司；乙腈（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；磷酸（色谱纯）：广州化学试剂厂。
1.3 试验方法
1.3.1 芒果苷含量的测定
标准溶液配制：称取芒果苷标准品0.005 4 g，溶于3mL50%乙醇溶液，得到1.8mg/mL的储备液，随后利用50%乙醇逐级稀释为 600、300、150、75、7.5、0.75 μg/mL溶液，0.22 μm微孔过滤膜过滤，得到不同浓度的标准品溶液。
样品提取：参考杨晓娟等[6]的方法，称取粉末0.2 g置于带盖的三角瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，称重，超声波500 W，40 kHz，40℃提取1 h，冷却后称重，用50%乙醇补足质量，摇匀，提取液用0.22 μm微孔过滤膜过滤，即得。
高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定：色谱柱为安捷伦C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（体积比15 ∶85），等度洗脱 10 min，流速为 1.0 mL/min，检测波长为258 nm，柱温为30℃，进样量为5 μL。利用该方法测定不同浓度的标准品和样品，3次重复。以峰面积为横轴，浓度（μg/mL）为纵轴，建立的标准曲线为：y=0.049x+0.239（R2=0.999）。
1.3.2 总酚含量的测定
标准曲线绘制：采用福林酚比色法测定总酚含量[7]。精确称取没食子酸标准品5 mg，蒸馏水溶解并定容至25 mL棕色量瓶中，即得0.2 mg/mL标准品溶液。量取标准溶液 0.1、0.15、0.2、0.25、0.30 mL 分别置于 15 mL试管中，加入福林试剂0.5 mL，摇匀，加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，摇匀，定容至10 mL，摇匀，50℃水浴加热10min，以相应试剂为空白，紫外可见分光光度计765nm处测定吸光值。以OD值为横坐标，浓度（μg/mL）为纵坐标，制作标准曲线，即 y=6.744x－0.367（R2=0.997）。
样品提取测定：精密称取0.3 g样品置于100 mL具塞锥形瓶，加50%乙醇50 mL，称定质量，于80℃水浴回流1 h后取出冷却，再称重，用50%乙醇补足减失质量，过滤，滤液作为供试品。量取0.3 mL待测液，按照标准品的测定方法测定其吸光值，并依据标准曲线计算其含量。
1.3.3 总黄酮含量的测定
标准曲线绘制：硝酸铝比色法测定总黄酮含量[8]。称取芦丁标准品20 mg，用70%乙醇定容至100 mL，摇匀即得0.2 mg/mL芦丁标准溶液。量取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 分别置于 15 mL 试管中，加 5% NaNO20.4 mL，摇匀，放置6 min后加10% Al（NO3）3 0.4 mL，摇匀，放置6 min后加4% NaOH 4.0 mL，再用70%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，紫外可见分光光度计510 nm处测定吸光值。以OD值为横坐标，浓度（μg/mL）为纵坐标，制作标准曲线，即 y=72.61x－2.845（R2=0.999）。
样品提取测定：称取0.5 g样品置100 mL具塞锥形瓶，加70%乙醇25 mL，称定重量，于80℃水浴回流2 h后取出冷却，再称重，用70%乙醇补足减失质量，过滤，滤液作为供试品。量取0.5 mL待测液，按照标准品的测定方法测定其吸光值，根据标准曲线计算其含量。
1.3.4 重金属含量测定
参考NY/T 2140—2015《绿色食品代用茶》标准，样品送至农业部蔬菜水果质量监督检验测试中心（广州）检测重金属含量，其中总砷含量按GB 5009.11—2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》方法测定；铅含量按GB 5009.12—2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》方法测定；镉含量按GB 5009.15—2014《食品安全国家标准食品中镉的测定》方法测定。
1.3.5 氨基酸含量的测定与营养价值评价
参照GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定方法》进行提取和测定，利用Sykam S-433D型全自动氨基酸分析仪进行分析，进样量0.05 mL。以16种混合氨基酸标准品为参照，外标法分析样品的氨基酸种类和含量。利用氨基酸比值系数法对叶茶的氨基酸进行营养价值评价[9]，将其与世界卫生组织（World Health Organization，WHO）/联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）提出的人体必需氨基酸模式比较[10]，并按文献[11]计算必需氨基酸的氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数（ratio coefficient of amino acid，RC）和氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient，SRC）。
1.3.6 水浸出物含量
参照国标GB/T 8305—2013《茶水浸出物测定》方法对3种叶茶进行测定。
1.3.7 叶茶感官审评
感官审评由广东省农业科学院茶叶研究所的高级评茶员评审。由于叶茶制作过程结合了绿茶和乌龙茶的工艺，因而参照GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》中绿茶和乌龙茶的审评方法，取茶样3.0 g，茶水比 1∶50（g/mL），置于相应评茶杯中，沸水冲泡 5min，过滤茶汤，分别对3种叶茶的外形、香气、汤色、滋味和叶底进行评审。
1.4 数据统计与分析
运用Excel 2010对试验数据进行整理，使用SAS统计分析软件进行方差分析（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 白木香叶片营养成分和重金属比较
芒果苷是白木香的特征性成分，其标准品和样品的HPLC图谱见图2。两种叶片的营养成分和重金属含量比较见表1。
图2 芒果苷标准品和样品的HPLC色谱图
Fig.2 Representative chromatograms of mangiferin standard and sample
A为芒果苷标准品；B为样品。
表1 两种叶片的营养成分和重金属含量比较
Table 1 Comparison of the nutritional components and heavy metals in two types of leaves
注：同列不同小写字母表示数据差异显著性（P＜0.05）；/表示不含该指标。
测定指标半成熟叶老叶绿色食品代用茶标准芒果苷/% 总黄酮/%3.01±0.08a 4.69±0.23a 0.84±0.01b 4.20±0.22a//总酚/%4.03±0.02a 1.46±0.07b/总砷/（mg/kg）铅/（mg/kg）镉/（mg/kg）0.080±0.005a 1.820±0.03b 0.478±0.014b 0.091±0.011a 3.350±0.04a 1.710±0.026a≤0.5 ≤5.0 ≤0.5
白木香半成熟叶的芒果苷含量显著高于老叶，为老叶3.58倍。半成熟叶的总酚含量也显著高于老叶，而二者的总黄酮含量差异不显著。重金属含量方面，两种叶片的总砷含量差异不显著，而铅和镉则随着叶片的成熟，含量显著升高。其中，老叶的铅含量是半成熟叶的1.84倍，镉含量是半成熟叶的3.58倍，且老叶的镉含量也超出了NY/T 2140—2015《绿色食品代用茶》0.5 mg/kg的限定指标。
2.2 白木香叶茶主要营养成分含量比较
基于上述比较，半成熟叶营养成分较高且重金属含量低，因而选取半成熟叶作为制茶的原料。经过不同温度和持续时间的干燥，得到A、B、C 3种类型的白木香叶茶。3种白木香叶茶的主要营养成分含量比较见表2。
表2 3种白木香叶茶的主要营养成分含量比较
Table 2 The content of nutritional components in three types of leaf tea %
类别 总黄酮 总酚 水浸出物 芒果苷叶茶 A 3.26±0.06b 1.31±0.00a 32.7±0.09a 3.67±0.05a叶茶 B 3.04±0.04c 1.01±0.01b 32.8±0.07a 3.77±0.06a叶茶 C 3.42±0.03a 0.86±0.00c 31.1±0.11b 3.53±0.02b
检测发现，总黄酮含量以叶茶C最高，达3.42%。叶茶A的总酚含量最高，而在水浸出物和芒果苷含量上与叶茶B差异不显著。叶茶C的总酚含量、水浸出物含量和芒果苷含量均显著低于其它两种叶茶。
2.3 白木香叶茶氨基酸含量和营养价值比较
氨基酸的种类及其比例直接影响茶的风味。3种白木香叶茶氨基酸成分与含量比较见表3。
表3 3种白木香叶茶氨基酸成分与含量比较
Table 3 Amino acid content in three types of leaf tea
注：*为必需氨基酸；#为药效氨基酸或药效氨基酸总和；F为鲜味氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）总和；E为必需氨基酸；N为非必须氨基酸；T为氨基酸总和；不同小写字母表示数据差异显著性（P＜0.05）。
质量分数/%氨基酸种类 叶茶A 叶茶B天门冬氨酸 # 1.16±0.03a 1.15±0.03a苏氨酸 * 0.50±0.02a 0.50±0.01a丝氨酸 0.50±0.02a 0.51±0.03a谷氨酸 # 1.30± 0.05a 1.39±0.06a甘氨酸 # 0.71± 0.01a 0.71±0.02a丙氨酸 0.51±0.02a 0.54±0.03a缬氨酸 * 0.88±0.01a 0.91±0.03a蛋氨酸 *# 0.15±0.03a 0.16±0.03a异亮氨酸 *# 0.58±0.04a 0.58±0.01a亮氨酸 *# 0.90±0.01b 0.95±0.01a酪氨酸 0.41±0.02a 0.44±0.02a苯丙氨酸 *# 0.60±0.01a 0.60±0.03a叶茶C 0.93±0.02b 0.42±0.03b 0.43±0.02b 1.15±0.03b 0.64±0.01b 0.49±0.03a 0.75±0.03b 0.12±0.02a 0.46±0.02b 0.85±0.02c 0.37±0.02b 0.47±0.05b氨基酸种类 质量分数/%叶茶A 叶茶B 叶茶C组氨酸 0.34±0.02a 0.37±0.03c 0.29±0.01b赖氨酸 *# 0.64± 0.03a 0.51±0.05b 0.38±0.04c精氨酸 # 0.51±0.01a 0.42±0.01b 0.35±0.02c脯氨酸 0.77±0.02a 0.79±0.02a 0.65±0.01b氨基酸总和（T） 10.46 10.53 8.75必需氨基酸总和（E） 4.25 4.21 3.45非必需氨基酸总和（N） 6.21 6.32 5.30药效氨基酸总和（#） 6.55 6.47 5.35鲜味氨基酸总和（F） 2.46 2.54 2.08 E/N 68.44 66.61 65.09 E/T 40.63 39.98 39.43
由表3可知，3种白木香叶茶的氨基酸种类较齐全，均含有供试的16种氨基酸，且包括7种必需氨基酸。除丙氨酸、蛋氨酸外，叶茶C的其它氨基酸含量均显著低于叶茶A和叶茶B，而叶茶C的氨基酸总和、药效氨基酸总和、鲜味氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）总和也均低于其它2种叶茶。叶茶A的E/T比值最高，为40.63%，而叶茶B和叶茶C的E/T比值分别为39.98%和39.43%，三者均与世界卫生组织（World Health Organization，WHO）/联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAD）规定的氨基酸参考模式（40%）基本相近[10]。
3种白木香叶茶中7类必需氨基酸与氨基酸总量的比值差异较大，3种白木香叶茶中组成比例见表4。3种白木香叶茶中必需氨基酸的氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数（ratio coefficient of amino acid，RC）和氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient，SRC）比较见表 5。
表4 3种白木香叶茶中必需氨基酸的组成比例
Table 4 Essential amino acids composition ratios in three types of leaf tea
氨基酸 氨基酸组成比例/% WHO/FAO模式/%叶茶A 叶茶B 叶茶C苏氨酸 4.78 4.75 4.80 4.00缬氨酸 8.41 8.64 8.57 5.00蛋氨酸+半胱氨酸 1.43 1.52 1.37 3.50异亮氨酸 5.54 5.51 5.26 4.00苯丙氨酸+酪氨酸 9.66 9.88 9.60 6.00赖氨酸 6.12 4.84 4.34 5.50亮氨酸 8.60 9.02 9.71 7.00
表5 3种白木香叶茶中必需氨基酸的RAA，RC和SRC比较
Table5 ComparisonofRAA，RCandSRCinthreetypesofleaftea
氨基酸 叶茶A 叶茶B 叶茶C RAA RC SRC RAA RC SRC RAA RC SRC苏氨酸 1.20 0.97 65.81 1.19 0.97 63.29 1.20 1.00 61.29缬氨酸 1.68 1.37 1.73 1.42 1.71 1.43蛋氨酸+半胱氨酸 0.41 0.33 0.43 0.36 0.39 0.33异亮氨酸 1.39 1.13 1.38 1.13 1.31 1.10苯丙氨酸+酪氨酸 1.61 1.31 1.65 1.35 1.60 1.33赖氨酸 1.11 0.90 0.88 0.72 0.79 0.66亮氨酸 1.23 1.00 1.29 1.06 1.39 1.16
由表4可知，三者的苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸的比例均高于模式谱，叶茶A的赖氨酸也高于模式谱，而其它氨基酸均低于模式谱。采用氨基酸比值系数法对其必需氨基酸进一步分析表明，叶茶A、叶茶B、叶茶C的SRC值分别为65.81、63.29和61.29，说明叶茶A的氨基酸营养价值最高，同时也揭示过高的干燥温度会导致白木香叶茶氨基酸营养价值降低。由表5可知，3种叶茶的蛋氨酸＋半胱氨酸的RC值最小，分别为0.33、0.36和0.33，可见，蛋氨酸+胱氨酸为白木香叶茶的第一限制性氨基酸。
2.4 白木香叶茶感官评审
感官评审结果表明，不同干燥条件对白木香叶茶的感官品质存在不同程度的影响，主要体现在香气、汤色和滋味上。3种白木香叶茶的外形与茶汤见图3。不同白木香叶茶的感官审评结果见表6。
由图3、表6可知，叶茶A的茶汤黄绿明亮，颜色浅于叶茶B和叶茶C；香气上，叶茶B和叶茶C分别为高火和老火，而叶茶A的香气则花香高长，优于叶茶B和叶茶C，且叶茶A的滋味醇厚鲜爽回甘，口感更佳。因此，综合感官评审以叶茶A最佳。
图3 3种白木香叶茶的外形与茶汤
Fig.3 Appearances and tea soup of three types of leaf tea
3 讨论和结论
黄酮类、酚类物质是白木香叶的重要活性成分，尤其是芒果苷，具有抗肿瘤、抗氧化、解热、消炎、改善记忆等多种药理作用[5]。帅欧等[3]研究发现白木香叶、花、果皮中均含有芒果苷，且初生嫩叶的芒果苷含量显著高于老叶，而本研究中半成熟叶的芒果苷含量也显著高于老叶，与其结果一致，说明白木香叶片中的芒果苷含量是随着叶片的成熟显著下降的。半成熟叶制成叶茶后，总黄酮和总酚含量均有所下降，与前人报道的其它叶茶相比，3种白木香叶茶的总黄酮含量高于银杏叶茶[12]、青钱柳叶茶和绞股蓝茶[13]，而它们的总酚含量则低于刺葡萄叶茶[14]和酸石榴叶茶[15]。
表6 不同白木香叶茶的感官审评结果
Table 6 Sensory evaluation results of different leaf tea
叶茶 外形 香气 汤色 滋味 叶底叶茶A 颗粒紧结匀整、色泽调匀 花香高长 黄绿，明亮 醇厚鲜爽回甘 黄绿，柔亮叶茶B 颗粒较紧结匀整、色泽调匀 高火 橙黄，明亮 浓厚爽回甘 黄褐，较柔亮叶茶C 颗粒较紧结匀整、色泽调匀 老火 橙黄，明亮 浓厚爽回甘 黄褐，较柔亮
氨基酸是茶汤中主要呈味化合物，氨基酸的种类及其比例影响着茶的风味，而叶茶的制作工艺也会影响叶茶的氨基酸含量[16]。本研究中，经不同温度的干燥处理后，叶茶C的氨基酸总和低于其它2种叶茶，其SRC值也最低，说明过高的干燥温度会导致白木香叶茶氨基酸营养价值降低。此外，水浸出物含量高低也是茶汤滋味浓淡程度的直接体现，3种白木香叶茶水浸出物为31.1%～32.8%，低于前人报道的海棠叶茶[17]和梨枣叶茶[18]。
广东省食品安全地方标准DBS 44/011—2018《白木香叶》没有对白木香叶片的成熟度进行要求，而白木香的嫩叶制作叶茶时有难以去除的苦涩味，一些种植企业则多采用老叶制作，而本研究发现，老叶的营养价值最低，同时叶片的成熟也导致老叶的铅和镉两种重金属含量显著上升，尤其是镉元素容易积累，超过了绿色食品代用茶标准，因而半成熟叶是最合适的白木香叶茶原料。本研究利用不同的干燥参数研制了3种白木香叶茶，经过氨基酸、芒果苷、水浸出物和总酚等营养成分的综合评估后，叶茶A的营养价值更高，而感官评审也发现叶茶A的茶汤黄绿明亮，香气花香高长，滋味醇厚鲜爽回甘，口感更佳。因而，以120℃初烘1 h、100℃焙火2 h的干燥参数，可以获得品质较好的白木香叶茶。
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