芦柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan），又名柑果、真柑、乳柑等，为芸香科柑橘属植物[1]。芦柑是福建省的一大名优特产，其汁量丰富、色泽橙黄、风味浓郁，含有丰富的维生素等天然有效成分，深受人们的喜爱[2]。然而人们对芦柑的利用还主要停留在果肉、果皮和果核上，对于芦柑采摘后剩下的枝叶利用较少，而实际上芦柑叶中含有黄酮、多酚、精油等多种天然有效成分[3-4]，其中黄酮是存在于植物的叶、茎、根、花、果中的一类次生代谢物，具有抗衰老、抗病菌、降血脂和抗氧化等多种生理活性功能，已广泛应用于材料、医药、食品和化妆品等相关领域中[5-6]。超声波辅助提取是利用超声波的空化作用以促进植物有效成分从植物颗粒中溶出的一种新型提取方法，宋怡伟等[7]采用响应面法对超声波辅助乙醇提取香椿叶中总黄酮的工艺进行优化，并考察了总黄酮的抑菌作用，结果表明最佳的提取工艺为液料比41∶1（mL/mg）、超声时间36 min、乙醇浓度65%，所提取的总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显，且该方法具有能耗低、不会破坏生物活性、操作简便、无毒副作用等优点[8]。
为进一步提高芦柑叶资源的利用率，本研究以芦柑叶为原料，利用超声波辅助法对芦柑叶中总黄酮进行提取，并利用响应面法对提取工艺进行优化，并通过芦柑叶总黄酮对·OH和DPPH·的清除作用来评价其抗氧化活性，以期为芦柑叶资源的利用与开发提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
芦柑叶：采摘于福建省南靖县金山镇上麻村。将采摘的芦柑叶用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后过80目筛，备用；乙醇（食品级）：河南鑫河阳酒精有限公司。
紫外可见分光光度计（UV-1100型）：上海美谱达仪器有限公司；高频数控超声波清洗器（KQ-100TDE）：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线绘制
将芦丁用75%的乙醇溶解，配制成0.25 mg/mL的芦丁标准液。在10 mL的具塞玻璃比色管中，分别加入一定体积的芦丁标准液，再分别加入5%的亚硝酸钠溶液和10%的硝酸铝溶液各0.3 mL，摇匀，静置6 min后，分别加入4%的氢氧化钠溶液2 mL，定容，静置反应15 min，在510 nm下测定吸光度（A），以75%的乙醇做空白对照。以OD510为纵坐标，对照品的浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线Y=0.011 28X-0.016 58，R2=0.999 2。
1.2.2 芦柑叶总黄酮的含量测定
在100 mL的圆底烧瓶中加入称好的芦柑叶粉m（g）和乙醇溶液，并在设定的温度下进行超声辅助提取。提取结束后，过滤，定容到体积V（L），按照1.2.1方法，测定提取液的吸光度，计算提取液中总黄酮的质量浓度C（mg/L），通过下式得芦柑叶总黄酮的提取率。
1.2.3 单因素试验设计
在固定液料比35∶1（mL/g）、乙醇浓度75%、超声温度70℃和超声时间25 min的条件下，每个因素设5个水平：液料比25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）、乙醇浓度65%、70%、75%、80%、85%，超声温度 60、65、70、75、80 ℃和超声时间 15、20、25、30、35 min，考察各单因素对芦柑叶总黄酮提取率的影响，确定最佳的单因素工艺条件。
1.2.4 响应面试验设计
根据所考察的单因素对芦柑叶总黄酮提取率影响，在筛选出的最佳工艺条件基础上，选取影响芦柑叶总黄酮提取率的4个因素（液料比A、乙醇浓度B、超声温度C和超声时间D）进行Box-Benhnken试验设计并进行响应面优化，因素与水平见表1。
表1 响应面分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface analysis
水平 A液料比/（mL/g）B乙醇浓度/%C超声温度/℃D超声时间/min-1 30∶1 70 65 20 0 35∶1 75 70 25 1 40∶1 80 75 30
1.2.5 芦柑叶总黄酮的抗氧化活性测定
1.2.5.1 DPPH·清除能力的测定
分别在10 mL的比色管中加入2 mL不同质量浓度的芦柑叶总黄酮溶液，并分别加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均匀反应30 min后，在517 nm处测得吸光度Ai；将2 mL 95%乙醇替代2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，测得吸光度Aj；测定2 mL蒸馏水和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合液的吸光度A0；并以维生素C（VC）作对照，按下式计算得芦柑叶总黄酮对DPPH·的清除率。
DPPH·清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100
1.2.5.2·OH清除率的测定
分别在10 mL的比色管中加入2 mL不同质量浓度的芦柑叶总黄酮溶液，分别加入浓度均为9 mmoL/L的水杨酸-乙醇溶液2 mL和FeSO4溶液1 mL，混匀后加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，并进行反应60 min，结束后，定容，测定在510 nm处的吸光度Ai；以蒸馏水代替H2O2溶液测得吸光度Aj；以蒸馏水代替芦柑叶总黄酮溶液，测得吸光度 A0，以维生素 C（VC）作对照，按下式计算得芦柑叶总黄酮对·OH的清除率。
·OH清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100
1.2.6 数据处理
每组试验重复3次，试验结果以均值±标准差表示，用 Microsoft Excel 2007、Origin 8.0 和 Design-Expert 8.05b软件进行试验数据分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比的影响
液料比对总黄酮提取率的影响见图1。
图1 液料比对总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction yield of total flavonoid
从图1中可以看出，当液料比在25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）区间变化时，芦柑叶总黄酮提取率随着液料比的增加而增大，这是因为液料比较小时，溶剂无法浸润芦柑叶颗粒，总黄酮溶出推动力不足，但液料比超过35∶1（mL/g）后，溶剂过多，会导致过滤、浓缩等后续步骤中总黄酮的损失[9]，从而使得提取率下降，因此液料比选择为35∶1（mL/g）。
2.1.2 乙醇浓度的影响
乙醇浓度对总黄酮提取率的影响见图2。
图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoid
从图2中可以看出，当乙醇浓度在65%～75%区间变化时，芦柑叶总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而增大，这是因为乙醇浓度小时，溶剂极性较大，水溶性较强，总黄酮溶出率较低，但当乙醇浓度超过75%时，乙醇浓度过高，大量醇溶性和脂溶性的溶出，加剧了与总黄酮的溶出竞争[10]，从而使得提取率下降，因此最适乙醇浓度为75%。
2.1.3 超声温度的影响
超声温度对总黄酮提取率的影响见图3。
图3 超声温度对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoid
从图3中可以看出，当超声温度在60℃～70℃区间变化时，芦柑叶总黄酮提取率随着超声温度的升高而增大，这是因为超声温度较低时，溶剂中的分子热运动较小，黄酮类物质的渗透、扩散与溶解能力较小，总黄酮提取率较低，但当超声温度超过70℃时，过高的温度会使总黄酮中部分不稳定的结构发生氧化[11]，从而使得提取率下降。因此最适超声温度为70℃。
2.1.4 超声时间的影响
超声时间对总黄酮提取率的影响见图4。
图4 超声时间对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoid
从图4中可以看出，当超声时间在15 min～25 min区间变化时，芦柑叶总黄酮提取率随着超声时间的延长而增大，这是因为超声时间较短时，芦柑叶中黄酮类物质还没来得及完全溶出，提取率较小，但当超声时间过长时，黄酮类物质会发生氧化而结构受损，从而使得提取率下降[12]，因此最适超声时间为25 min。
2.2 响应面法优化芦柑叶总黄酮提取工艺
2.2.1 响应面设计及结果
根据所考察的单因素对芦柑叶总黄酮提取率影响，设计了四因素三水平的Box-Behnken试验并利用软件进行响应面试验分析。试验方案及结果见表2，方差分析见表3。
对表2的Box-Behnken试验设计结果，通过Design-Expert 8.05b软件分析，得到以芦柑叶总黄酮提取率（Y）为响应值，液料比（A）、乙醇浓度（B）、超声温度（C）和超声时间（D）为自变量的多元回归方程：Y=52.77+2.40A+1.06B-0.77C+0.86D-3.79AB+2.54AC+0.16AD-3.58BC-2.10BD+1.47CD-2.76A2-5.28B2-6.95C2-3.48D2。
由表3的二次回归方程模型方差分析可以看出，该模型F=9.86，P＜0.000 1，表明该回归模型具有较高的显著性；失拟项F=3.78，P=0.106 0＞0.05，失拟项差异不显著，表明该回归方程的残差均由随机误差引起，试验误差小。方程的回归系数R2=0.908 0，表明有超过90%的试验值可以利用该模型的预测值来解释。根据F值及P值的分析得到各工艺因素对响应值的影响显著性差异，其中一次项A，交互项AB、BC，二次项A2、B2、C2、D2对芦柑叶总黄酮提取率影响极显著（P＜0.01）；交互项AC对芦柑叶总黄酮提取率影响显著（P＜0.05），一次项 B、C、D，交互项 AD、BD、CD 对芦柑叶总黄酮提取率均不显著（P＞0.01），说明响应值与所考察的工艺条件之间不是简单的线性关系。综上分析，可以利用该二次回归方程模型对芦柑叶总黄酮的提取工艺进行分析与预测。
表2 响应面设计与试验结果
Table 2 Response surface design and experimental results
序号ABCD提取率/（mg/g）1 0 0 1 -1 35.53±0.21 2 0 0 -1 1 44.53±0.24 3 -1 0 1 0 37.09±0.17 4 0 0 0 0 51.99±0.27 5 -1 1 0 0 44.81±0.26 6 0 1 -1 0 45.76±0.27 7 0 0 0 0 52.23±0.32 8 -1 0 0 -1 46.42±0.28 9 1 0 1 0 49.10±0.24 10 0 -1 0 1 45.15±0.21 11 1 0 0 1 48.07±0.27 12 1 -1 0 0 50.55±0.31 13 1 1 0 0 44.16±0.26 14 1 0 -1 0 44.52±0.15 15 0 0 0 0 53.83±0.32 16 -1 -1 0 0 36.04±0.23 17 0 -1 -1 0 35.77±0.21 18 0 1 0 -1 47.64±0.27 19 0 1 1 0 39.25±0.27 20 0 -1 1 0 43.60±0.29 21 -1 0 0 1 47.22±0.26 22 0 0 1 1 42.68±0.25 23 1 0 0 -1 46.64±0.17 24 0 1 0 1 43.28±0.37 25 0 0 -1 -1 43.27±0.21 26 0 -1 0 -1 41.10±0.25 27 0 0 0 0 54.44±0.33 28 0 0 0 0 51.37±0.31 29 -1 0 -1 0 42.68±0.26
表3 回归方程方差分析
Table 3 Variance analysis of regression equation
注：*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01，差异极显著。
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 P值 显著度模型 697.69 14 49.83 9.86 ＜0.000 1 **A 69.02 1 69.02 13.66 0.002 4 **B 13.42 1 13.42 2.66 0.125 4 C 7.18 1 7.18 1.42 0.253 1 D 8.89 1 8.89 1.76 0.205 9 AB 57.46 1 57.46 11.37 0.004 6 **AC 25.86 1 25.86 5.12 0.040 1 *AD 0.099 1 0.099 0.02 0.890 5 BC 51.41 1 51.41 10.18 0.006 6 **BD 17.68 1 17.68 3.50 0.082 4 CD 8.67 1 8.67 1.72 0.211 2 A2 49.39 1 49.39 9.78 0.007 4 **B2 181.04 1 181.04 35.83＜0.000 1 **C2 313.25 1 313.25 62.00＜0.000 1 **D2 78.58 1 78.58 15.55 0.001 5 **残差 70.73 14 5.05失拟度 63.96 10 6.40 3.78 0.106 0绝对误差 6.77 4 1.69总离差 768.42 28
2.2.2 响应面分析
各因素之间的交互作用对响应值的影响显著程度如图5所示。
图5 各因素交互作用对总黄酮提取率的响应面图
Fig.5 Response surface plot of the interaction factors on extraction yield of total flavonoids
从图5中可以看出液料比和乙醇浓度的响应面曲面的坡度最大、等高线最密，说明液料比和乙醇浓度的交互作用对响应值的影响最为显著，而乙醇浓度和超声温度的响应面曲面坡度陡峭程度次之，等高线疏密程度也次之，说明乙醇浓度和超声温度对响应值的影响显著性程度次之，同理可得，各因素间交互作用影响响应值（芦柑叶总黄酮的提取率）的显著性的顺序为 AB＞BC＞AC＞BD＞CD＞AD。
2.2.3 最佳工艺验证
通过软件对回归方程模型进行拟合分析，得到了芦柑叶总黄酮的最佳提取工艺条件为：液料比38.44∶1（mL/g）、乙醇浓度73.75%、超声温度70.80℃和超声时间26.24 min，芦柑叶总黄酮提取率的预测值为53.51mg/g。为了试验过程中参数控制的便利，将最佳工艺条件修正为液料比38∶1（mL/g）、乙醇浓度74%、超声温度71℃和超声时间26 min，并进行重复3次验证试验，得到总黄酮的平均提取率为（53.19±0.28）mg/g，与预测值的相对误差为0.6%，说明该二次回归方程模型具有一定的准确性与可靠性，可用于芦柑叶总黄酮的提取工艺的分析与预测。
2.3 芦柑叶总黄酮的抗氧化活性
2.3.1 芦柑叶总黄酮对·OH的清除能力
芦柑叶总黄酮对·OH清除能力如图6所示。
从图6中可知，随着芦柑叶总黄酮和维生素C浓度的增加，·OH清除率逐渐提高，说明芦柑叶总黄酮和维生素C的浓度与·OH清除率之间存在量效关系。根据图6中的数据进行分析，得到芦柑叶总黄酮和维生素C对·OH清除率的IC50分别为146.41 mg/L和93.39 mg/L，说明芦柑叶总黄酮具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化性能小于维生素C，是一种潜在的天然抗氧化剂。
图6 总黄酮和维生素C对·OH的清除能力
Fig.6 Scavenging activity of total flavonoids and vitamin C on·OH
2.3.2 芦柑叶总黄酮对DPPH·的清除能力
芦柑叶总黄酮对DPPH·的清除能力如图7所示。
图7 总黄酮和维生素C对DPPH·的清除能力
Fig.7 Scavenging activity of total flavonoids and vitamin C on DPPH·
从图7中可以看出，随着芦柑叶总黄酮和维生素C浓度的增加，DPPH·清除率逐渐提高，说明芦柑叶总黄酮和维生素C的浓度与DPPH·清除率之间存在量效关系，根据图7中的数据进行分析，得到芦柑叶总黄酮和维生素C对DPPH·清除率的IC50分别为66.56 mg/L和47.83 mg/L，说明芦柑叶总黄酮具有一定的抗氧化能力。
3 结论
通过单因素试验和Box-Bohnken响应面试验，得到最佳的芦柑叶总黄酮提取工艺条件为：液料比38∶1（mL/g）、乙醇浓度74%、超声温度71℃和超声时间26 min，并进行重复3次验证试验，得到总黄酮的平均提取率为（53.19±0.28）mg/g，与预测值的相对误差为0.6%，说明该二次回归方程模型具有一定的准确性与可靠性，可用于芦柑叶总黄酮的提取工艺的分析与预测。芦柑叶总黄酮对·OH和DPPH·的清除效果表明芦柑叶总黄酮具有一定的抗氧化活性，与·OH和DPPH·的清除率之间存在量效关系，其对·OH和DPPH·清除率的IC50分别为146.41 mg/L和66.56 mg/L，说明芦柑叶总黄酮是一种潜在的天然抗氧化剂。
[1]CAO J,WANG C,XU S,et al.The effects of transportation temperature on the decay rate and quality of postharvest ponkan（Citrus reticulata Blanco）fruit in different storage periods[J].Scientia horticulturae,2019,247:42-48.
[2]丁晓波,张华,刘世尧,等.柑橘果品营养学研究现状[J].园艺学报,2012,39（9）:1687-1702.
[3]Colodel C,Vriesmann L C,de Oliveira Petkowicz C L.Rheological characterization of a pectin extracted from ponkan（Citrus reticulata blanco cv.ponkan）peel[J].Food hydrocolloids,2019,94:326-332.
[4]Kashyap K,Kashyap D,Nitin M,et al.Characterizing the Nutrient Composition,Physiological Maturity,and Effect of Cold Storage in Khasi Mandarin（Citrus reticulata Blanco）[J].International Journal of Fruit Science,2019,9:1-20.
[5]ZENG X,XI Y,JIANG W.Protective roles of flavonoids and flavonoid-rich plant extracts against urolithiasis:a review[J].Critical reviews in food science and nutrition,2019,59（13）:2125-2135.
[6]Farhadi F,Khameneh B,Iranshahi M,et al.Antibacterial activity of flavonoids and their structure-activity relationship:An update review[J].Phytotherapy research,2019,33（1）:13-40.
[7]宋怡伟,赵志刚,韩成云.响应面法超声辅助提取香椿叶总黄酮及抑菌效果研究[J].食品研究与开发,2019,40（23）:153-158.
[8]WEN C,ZHANG J,ZHANG H,et al.Advances in ultrasound assisted extraction of bioactive compounds from cash crops-A review[J].Ultrasonics sonochemistry,2018,48:538-549.
[9]Tian J,Muhammad S,Chen A,et al.An experimental study exploring the influencing factors for ultrasonic-assisted extraction of flavonoid compounds from leaves of Amorpha fruticosa L[J].Journal of Forestry Research,2019,30（5）:1735-1741.
[10]YU M,WANG B,QI Z,et al.Response surface method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Crinum asiaticum[J].Saudi Journal of Biological Sciences,2019,26（8）:2079-2084.
[11]YAO Q,SHEN Y,BU L,et al.Ultrasound-assisted aqueous extraction of total flavonoids and hydroxytyrosol from olive leaves optimized by response surface methodology[J].Preparative Biochemistry and Biotechnology,2019,49（9）:837-845.
[12]LIU Y,LUO X,LAN Z,et al.Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant capacities of flavonoids from Camellia fascicularis leaves[J].CyTA-Journal of Food,2018,16（1）:105-112.