苦瓜（Momordica charantia L.）主要分布在热带和温带地区，我国南北方均有栽培[1]，具有较高的营养价值和保健功效，是一种药食同源的蔬菜[2]。苦瓜和苦瓜籽富含多肽、多糖、皂苷、类黄酮等多种生物活性成分[3-7]，具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力及预防肥胖等功效[8-10]。近年来，Ⅱ型糖尿病和营养性肥胖成为影响人类身体健康的主要慢性疾病之一[11]。但是改善血糖的药物普遍具有副作用，探寻天然有效的改善胰岛素抵抗药物仍然是药物研发中重要的方向[12-13]。苦瓜籽多肽能有效改善胰岛素抵抗状态，进一步减缓Ⅱ型糖尿病的发病进程，其中在类胰岛素研究方面降糖多肽P和降糖多肽K备受关注[14-17]。苦瓜籽多肽K的分子量为18 000 kDa，由18种氨基酸组成，性质比较稳定。经过小鼠和临床实验发现，降糖多肽K无需注射，口服就具有较好的降糖效果[18]。但是关于苦瓜多肽K分离纯化的方法，以及对不同品种苦瓜籽的多肽K含量比较研究尚未见报道。因此，本研究以苦瓜籽为原料，采用碱提酸沉法结合单因素试验优化多肽K提取工艺条件，并用建立的方法筛选出多肽K含量高的苦瓜品种，为苦瓜降糖功能产品的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
泰国山苦瓜籽、绿水果苦瓜籽、杜阮大顶苦瓜籽、大肉2号苦瓜籽、桂农科9号苦瓜籽：广西农业科学院蔬菜研究所提供。5个苦瓜品种材料均种植于广西农业科学院蔬菜研究所里建科研基地。苦瓜田间种植常规管理，2017年3月播种，7月采收结束。
蛋白裂解液（BC3720）、广谱蛋白 Marker（5 kDa～245 kDa，PR1930）、蛋白酶抑制剂混合液（P6732）：北京索莱宝科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳液（P0014B）、蛋白上样缓冲液（P0015）、广谱蛋白Marker（10 kDa～150 kDa，P0060M）、BeyoGelTM Plus PAGE预制胶（P0523S）：碧云天生物技术有限公司；碳酸钠（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；碳酸氢钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司）；盐酸（分析纯）、甲醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（BSA224S）：赛多利斯（上海）贸易有限公司；冷冻干燥机（Alpha 1-2 Ldplus）：博然科仪有限公司；电泳仪（BIO-RAD）、凝胶成像系统（BIO-RAD）：伯乐生命医学产品（上海）有限公司；冷冻离心机（5810R）：北京康高特科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 苦瓜籽脱脂处理
将苦瓜籽在研钵中研磨成细粉，过40目筛，精密称取1 g，置均质器中，加入预冷（-20℃）的甲醇2 mL（含蛋白酶抑制剂20 μL），在冰上研磨20 min，用甲醇转移至15 mL离心管中，在4℃，14 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀用10 mL预冷甲醇洗2次，再用预冷的丙酮-水（体积比3∶1，-20℃）溶液10 mL洗3次，在4℃，14 000 r/min离心5 min后，收集沉淀，挥发去大部分溶剂，再置冷冻干燥机中冻干，即得到脱脂后的苦瓜籽冻干粉末，称重，冷藏备用。
1.3.2 苦瓜籽总蛋白提取
精密称取脱脂后的苦瓜籽冻干粉末0.05 g，加入蛋白裂解液0.5 mL，冰上孵育25 min，期间涡旋振荡5次，然后在4℃，14 000 r/min离心30 min，收集上清液即为苦瓜籽总蛋白液，冷藏备用。
1.3.3 碱提酸沉法提取苦瓜多肽K
精密称取脱脂后的苦瓜籽冻干粉末0.5 g，加入10 mL 碳酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 9.5），振摇后超声10min，在50℃水浴上静置1h，然后在4℃，10000r/min离心10 min，取上清液，用1 mol/L HCl调整pH值至3.0，静置 30 min，4 ℃，10 000 r/min 离心 10 min，收集沉淀，加入2 mL碳酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH 9.0）使其溶解，即获得碱提酸沉的多肽K溶液。
1.3.3.1 碱液pH值的优化
以桂农科9号苦瓜籽为原料，固定料液比为1∶20（g/mL）、提取温度为50℃，依次调节提取碱液的pH 值为 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，浸提 60 min 后，用1 mol/L HCl调整pH值至3.0，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准溶液（1mg/mL）作为蛋白质定量的对照，计算苦瓜多肽K提取率。
1.3.3.2 提取温度的优化
以桂农科9号苦瓜籽为原料，固定提取碱液的pH值为 9.5，料液比为 1 ∶20（g/mL），分别在温度为 40、45、50、55、60℃条件下浸提60 min，计算苦瓜多肽K提取率。
1.3.3.3 料液比的优化
以桂农科9号苦瓜籽为原料，固定提取温度为50℃，提取碱液的 pH 值为 9.5，分别以 1∶10、1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）为料液比，浸提 60 min，计算苦瓜多肽K提取率。
1.3.3.4 提取时间的优化
以桂农科9号苦瓜籽为原料，固定料液比为1∶20（g/mL）、提取温度为50℃，提取碱液的pH值为9.5，在 50 ℃的水浴中分别加热 30、60、90、120 min，计算苦瓜多肽K提取率。
1.3.3.5 蛋白酸沉pH值的优化
以桂农科9号苦瓜籽为原料，固定料液比为1∶20（g/mL）、提取温度为50℃，碱液pH值为9.5，在50℃的水浴中分别加热60 min，用1 mol/L HCl顺序调整pH 值至 7.0、6.0、5.0、4.0和 3.0，静置 30 min，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，收集每个pH值下的沉淀，计算苦瓜多肽K提取率。
1.3.4 苦瓜籽蛋白的电泳分析
以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分离蛋白，分离胶浓度为4%～20%，每个泳道蛋白质上样量约为50 μg，以广谱蛋白Marker作为分子量大小的对照，以牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（1 mg/mL）作为蛋白质定量的对照，在110 V电压下电泳90 min。电泳后用考马斯亮蓝G250染色液染色60 min，纯水脱色16 h，直至背景清晰，拍照。蛋白质电泳的结果采用分析软件Image Lab 6.0进行分析。
1.3.5 苦瓜籽多肽K提取率计算
式中：CBSA为标准蛋白上样浓度，μg/μL；ABSA为标准蛋白电泳分析条带响应值；AK为多肽K电泳分析条带响应值；n为样品稀释倍数；L为样品上样量，μL；W为苦瓜籽粉末质量，g。
不同品种苦瓜籽多肽K含量计算方法同上公式。
1.4 数据处理
采用Excel和SPSS19.0软件进行数据处理和分析，数据结果以
±sD表示。
2 结果与分析
2.1 碱液pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响
碱液pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响结果见图1。
图1 碱液pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响
Fig.1 Effect of alkaline solution pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds
从图1可以看出，在pH 8.0～9.5的碱性范围内，多肽K提取率随着pH值的提高呈上升趋势，当pH值为9.5时，多肽K的提取率达到峰值，蛋白质溶液达到饱和状态。随着pH值的继续增加，多肽K提取率开始减小，原因可能是pH值大于9.5时，苦瓜籽蛋白变性严重，导致多肽K的损失增加。因而在此试验条件下，多肽K提取的最适pH值为9.5。
2.2 提取温度对苦瓜籽多肽K提取率的影响
提取温度对苦瓜籽多肽K提取率的影响结果见图2。
图2 提取温度对苦瓜籽多肽K提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds
由图2可以看出，温度对苦瓜籽多肽K提取率影响较大。当提取温度为40℃时，由于反应体系温度较低，多肽K提取率也很低。当温度从40℃上升到50℃时，多肽K提取率随着温度的增加逐渐增大，并且在50℃时提取率达到最大值，但随着温度继续增加，其中部分蛋白质变性，导致多肽K提取率略有下降。因此，多肽K提取的最适温度为50℃。
2.3 料液比对苦瓜籽多肽K提取率的影响
料液比对苦瓜籽多肽K提取率的影响结果见图3。
图3 料液比对多肽K提取率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds
从图 3 可以看出，当料液比 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）时，多肽K提取率随着溶剂体积的增加而增大，且变化幅度较大。当料液比为1∶20（g/mL）时，多肽K提取率最高。之后随着溶剂体积继续增大多肽K提取率的变化幅度不大。考虑到加水量增加会导致多肽K分离时间大幅加长，所以选择料液比为1∶20（g/mL）。
2.4 提取时间对苦瓜籽多肽K提取率的影响
提取时间对苦瓜籽多肽K提取率的影响结果见图4。
图4 提取时间对苦瓜籽多肽K提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd
由图4可知，苦瓜籽多肽K提取率随提取时间延长呈先增大后减小的趋势，当提取时间为60 min时，多肽K提取率达最大值。当提取时间超过60min，多肽K提取率逐渐降低，但变化幅度不大。因此，在此单因素试验条件下多肽K的最佳提取时间为60 min。
2.5 蛋白酸沉pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响
蛋白酸沉pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响结果见图5。
图5 酸沉pH值对苦瓜籽多肽K提取率的影响
Fig.5 Effect of acid precipitation pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd
由图5可知，通过比较在不同pH值条件下的多肽K提取率，发现酸沉pH值对多肽K提取率影响不大，因此本试验选择将酸沉的pH值直接调整至3.0。
2.6 不同品种苦瓜籽的多肽K含量
苦瓜籽总蛋白电泳图见图6。不同品种苦瓜籽多肽K含量见表1。苦瓜碱提酸沉法提取的蛋白电泳图见图7。
图6 苦瓜籽总蛋白电泳图
Fig.6 The total protein electrophoresis of bitter gourd seeds
1.杜阮大顶；2.泰国山；3.大肉 2 号 ；4.绿水果；5.桂农科 9 号；6.蛋白 Marker；7.BSA。
表1 不同品种苦瓜籽多肽K含量
Table 1 The content of polypeptide-K in different varieties of bitter gourd seeds
注：不同小写字母表示组间差异显著（p＜0.05）。
品种 类型 多肽K含量/（mg/g）碱提酸沉法多肽K提取率/（mg/g）泰国山 墨绿刺瘤迷你苦瓜 0.20±0.03c 0.04±0.03c绿水果 绿色珍珠瘤苦瓜 1.85±0.11a 0.16±0.03a杜阮大顶 大顶苦瓜 1.30±0.25b 0.11±0.02b大肉2号 绿色条瘤苦瓜 1.43±0.32ab 0.13±0.02ab桂农科9号 墨绿色粒瘤苦瓜 2.06±0.06a 0.18±0.04a
图7 苦瓜籽碱提酸沉法提取的蛋白电泳图
Fig.7 Electrophoresis of protein extracted from bitter gourd seeds by alkali extraction-acid precipitation method
1.碱提酸沉的苦瓜籽蛋白；2.蛋白 Marker；3.BSA。
由图6可以看出，使用蛋白裂解液提取的总蛋白电泳条带丰富，分子量分布在6 kDa～75 kDa之间，5个品种的蛋白质条带分布大致相同。其中4个苦瓜籽品种在18 kDa的位置均有清晰的条带，而泰国山苦瓜籽18 kDa位置的条带不明显。经与BSA标准蛋白比对和计算，桂农科9号苦瓜籽的多肽K含量最高，为2.06 mg/g，多肽K含量最低的是泰国山苦瓜籽，仅为0.20 mg/g，前者为后者的10.30倍（表1）。经碱提酸沉工艺优化提取后，高分子量的蛋白质被除去，电泳图中高分子蛋白质条带数量与总蛋白提取法相比明显减少，主要的条带分布在35 kDa以下（图7），说明碱提酸沉法可以用于苦瓜籽多肽K的初步纯化。经碱提酸沉工艺处理后，其中多肽K提取率最高的是桂农科9号苦瓜籽，其次是绿水果苦瓜籽，泰国山苦瓜籽的多肽K提取率最低。
3 结论
本研究以5个品种的苦瓜籽为研究对象，通过蛋白裂解法对苦瓜籽总蛋白中的多肽K含量进行比较研究，发现不同品种的苦瓜籽多肽K含量有显著差异，筛选出2个含量相对较高的品种，分别是桂农科9号苦瓜籽和绿水果苦瓜籽，其中桂农科9号苦瓜籽的多肽K含量最高，为2.06 mg/g。以桂农科9号苦瓜籽为原料，通过料液比、碱液pH值、酸沉pH值、提取温度、提取时间5个因素对碱提酸沉工艺进行优化研究，获得最佳工艺条件为料液比1∶20（g/mL）、碱液pH 9.5、提取时间60 min、提取温度50℃，酸沉pH3.0。此工艺条件下，桂农科9号苦瓜籽中多肽K提取率为0.18 mg/g。研究结果可为苦瓜籽精深加工和降糖多肽K为主要功能成分的产品开发提供参考。
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