藜麦（ChenopodiumquinoaWilld.）是藜科藜属植物，原产于南美洲，是印第安人的传统主食，是一种营养全面的伪谷物。藜麦蛋白质含量丰富，接近牛奶蛋白价值，具有适宜人类吸收利用的氨基酸组成和比例[1-2]。藜麦矿物质营养含量高，油脂中富含人体所必需的ω-3和ω-6等多不饱和脂肪酸[3]。研究表明，藜麦中含有丰富的黄酮类成分[4]，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血压、降血脂和增强机体免疫力等诸多功能活性[5]。目前，藜麦黄酮提取工艺主要集中在溶剂提取[6-8]、超声波辅助提取[9-11]和微波辅助提取[12]。
聚能超声采用变幅器将超声振动的振幅加大、速度加快，并将超声能量集中在较小的面积，超声空穴效应可使细胞组织破壁、加快液-固之间传质，缩短反应时间，在生物活性物质提取中具有良好的应用前景[13-15]，但聚能超声具有较强的细胞破碎作用，提取过程产生大量的细微组织颗粒物，释放出大量蛋白质、淀粉等成分，分散于提取溶液中，用于藜麦等富含蛋白质、淀粉的样品提取，极易导致提取溶液呈现糊化胶状，难以进行后续的固液分离，亦对后续的分析测试尤其是光谱分析产生严重干扰，制约了聚能超声在生物活性物质提取中的应用。小分子醇-盐双水相分离体系与超声辅助提取耦合技术对黄酮等生物活性成分具有良好的提取分离能力[16-17]，已经在生物活性成分的提取中得到广泛应用，是一种极具前途的分离技术，被广泛应用在蛋白质[18]、食品等[19-20]领域。
在前期研究中发现，正丙醇-氯化钠双水相体系可将聚能超声辅助提取过程产生的细微组织颗粒物、蛋白的胶体、淀粉糊状物分配于盐水相，而黄酮等生物活性成分分配于富醇相，展现了良好的分离效率，据此，本文提出一种聚能超声-小分子醇-盐双水相耦合的新方法，应用于藜麦黄酮类化合物的提取，并利用响应面分析对提取条件进行优化，在获得较传统水浴超声更高提取效率的同时，可有效解决聚能超声辅助提取液后续固液分离及分析测试干扰问题，为聚能超声在食品领域的应用提供试验基础，为生物活性成分的高效快速制备提供一种新的研究思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
藜麦：山西忻州五台山；芦丁标准品：北京索莱宝科技有限公司；DPPH：美国Sigma公司；无水乙醇、氢氧化钠、抗坏血酸、氯化钠（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；正丙醇（分析纯）：西陇化工股份有限公司；亚硝酸钠（分析纯）：汕头市达濠精细化学品有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；蒸馏水：云南民族大学化学与环境学院实验室自制。
1.2 仪器与设备
SJIA-2012聚能式超声波细胞粉碎机：宁波市鄞州双嘉仪器有限公司；SG1200HE超声清洗器：上海冠特超声仪器有限公司；FA 2004电子分析天平：上海天平仪器厂；XZ-6G低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；TU-1950型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 聚能超声双水相
对市售藜麦粉过100目筛备用，称取1.00 g均匀的藜麦粉样品，放于100 mL烧杯中，加入一定量的正丙醇-氯化钠和适量蒸馏水，置于低温恒温槽外置冷阱中，设定烧杯中样品的初始温度，将变幅杆超声换能器与超声波细胞粉碎机连接，工具头置入烧杯样品中，采用脉冲处理方式进行聚能超声双水相萃取，提取完成后，将整个提取体系静置至完全分离，将富醇相与盐水相分离，富醇相用于后续的总黄酮得率及DPPH自由基清除率测定。
1.3.2 单因素试验考察
分别探究氯化钠加入量、醇水体积比、超声时间以及液固比这4种单因素对藜麦总黄酮得率的影响。
1.3.3 抗氧化活性测定
1.3.3.1 总黄酮得率测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，以芦丁为标准品，参考文献[21-22]的方法测定总黄酮得率，在510 nm波长处测定吸光度，得线性回归方程：y＝0.018 1x＋0.000 9（R2＝0.999 6）。计算藜麦总黄酮得率。
藜麦总黄酮得率按下式计算。
式中：Y为样品总黄酮得率，%；c为芦丁浓度，mg/mL；v为样品提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为藜麦粉样品质量，g。
1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的测定
参考文献[23]的测定方法并作如下修改，准确配制吸光度为0.7±0.02的DPPH乙醇溶液。用移液枪准确移取DPPH乙醇溶液1 mL，分别加入体积分数为1%、2%、3%、4%、5%的样品水溶液各1 mL，充分混匀，在室温25℃下避光反应30 min，4℃、4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液待测，于517 nm波长处测定吸光度（Ai），同时将1 mL DPPH乙醇溶液和1 mL无水乙醇混匀按上述方法测定吸光度（Ac），以及1mL无水乙醇溶液和1 mL样品水溶液混匀按上述方法测定吸光度（Aj），根据下式计算DPPH自由基清除率。
1.4 数据分析
采用Origin 8.5软件进行相关曲线拟合；通过Excel 2010软件分析整理数据；采用Design Expert8.0软件设计响应面试验方案，建立模型并进行多元回归分析。每个试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 聚能超声辅助提取及双水相分离
聚能超声装置及双水相分离体系见图1。
图1 聚能超声装置及双水相分离体系
Fig.1 Shaped energy ultrasonic device and two aqueous phase separation system
1.超声发生控制器；2.超声换能器；3.变幅杆；4.双水相萃取体系+藜麦粉样品；5.低温槽；6.冷媒。
这种聚能超声装置能量集中，持续式的超声作用方式可导致体系迅速升温，因此，本文采用脉冲式超声作用方式，并在装置中的提取杯外增加了强制降温冷阱，提取过程的初始温度设置为-20℃，能有效对提取过程温度进行控制。超声功率为400 W，超声时间25 min时，当通断比≤1 ∶4（脉冲作用 1 s，休止4 s）时，总黄酮得率较低，当通断比为1∶2（脉冲作用1 s，休止2 s）时，总黄酮得率达最高，且易于控制过程温度，当通断比大于2∶3时，终点温度明显较高，这与沈志燕等[24]的结果是一致的。因此，本文选择通断比为1∶2，即脉冲作用1 s，休止2 s的超声作用方式。
使用图1的聚能超声装置，400 W超声功率，通断比为1∶2，初始温度设置为-20℃，将藜麦粉样品经聚能超声-双水相提取分离后的萃取液状态和紫外吸收光谱见图2。
经聚能超声辅助萃取后，藜麦粉样品在萃取体系中形成低透光的胶体状，即使长时间离心也很难将其中固体与液体分离，其吸收曲线具有很大的背景吸收物和杂峰。其原因可能是藜麦含有近10%的蛋白质，在聚能超声辅助萃取过程进入溶液形成分散胶体体系，加之部分藜麦粉体在超声作用下破碎细小颗粒分散于溶液中，蛋白质胶体物质对光谱分析的入射光具有较强的散射作用，严重干扰总黄酮得率或抗氧化活性测定，这导致难以进行后续分离纯化或色谱分析。针对上述问题，本文提出聚能超声-双水相萃取耦合的方式，选择正丙醇-氯化钠双水相体系[25]。
图2 聚能超声萃取液及吸收光谱
Fig.2 Shaped ultrasonic extraction and absorption spectrum
1.聚能超声；2.聚能超声-双水相；3.聚能超声辅助萃取液吸收光谱；4.聚能超声-双水相萃取上相吸收光谱。
2.2 单因素试验结果
氯化钠加入量、醇水体积比、超声时间和液固比4种因素对总黄酮得率的影响结果见图3。
从图3a可知，在1.0 g～1.5 g范围内，随着氯化钠加入量的增加，总黄酮得率逐渐上升，当氯化钠加入量超过1.5 g，总黄酮得率逐渐降低，因此本文选择氯化钠的加入量为1.5 g。
醇水体积比即正丙醇和盐水相初始体积之比，分相所需的氯化钠不同，醇水体积比越大所需的氯化钠就越少。由于盐析作用，在正丙醇和水体系中加入一定量的氯化钠后会出现两相，即醇相和含盐水相。由图3b可知，随着醇水体积比的增加，正丙醇相体积增加，藜麦总黄酮得率逐渐增加，在醇水体积比为1∶1时达到最大值，超过1∶1时，过多的醇相可能存在稀释效应，导致藜麦总黄酮得率反而降低。
图3c的结果显示，超声时间在5 min～25 min，随着超声时间增加，总黄酮得率逐渐增加，超声时间大于25 min，总黄酮得率慢慢下降。这是因为随着超声时间增加，聚能超声作用方式可导致体系升温速率过快，终点温度较高，对释放的总黄酮存在一定破坏作用，因此本文选择25 min作为适宜的超声时间。
图3 氯化钠加入量、醇水比、超声时间和液固比对总黄酮得率的影响
Fig.3 Effects of sodium chloride addition，alcohol-water ratio，ultrasonic time and liquid-solid ratio on the total flavonoid yield
由图3d看出，液固比由20∶1（mL/g）增加到25∶1（mL/g），总黄酮得率迅速提高，在液固比 25 ∶1（mL/g）时，总黄酮得率达到最大，此时提取出来的总黄酮全部溶于正丙醇中。当液固比大于25∶1（mL/g）时，总黄酮得率随着液固比的增加而减少，这是由于随着液固比的增加，上相的体积也逐渐增加，藜麦与正丙醇接触面积也逐渐增大，但是藜麦粉的质量有限，溶解能力有限，提取不充分，故总黄酮得率反而降低。因此选择 25 ∶1（mL/g）作为适宜液固比。
2.3 响应面优化
2.3.1 响应面优化的试验设计与结果
根据单因素试验结果，本文固定超声功率为400W，通断比为1∶2，氯化钠加入量为1.5 g，以总黄酮得率（Y）为响应值，选择超声时间（A）、液固比（B）和醇水体积比（C）3个因素进行响应面优化，试验设计的因素水平见表1。
采用Box-Behnken模型，运行Design-Expert8.0软件，得到响应面试验结果见表2。
对表2的结果进行多元回归分析，获得二次多项回归方程：Y=-92.36A2-107.82B2-130.30C2+15.75AB+35.75AC+23.86BC-3.92A+1.47B+66.96C+427.58。
表1 因素水平
Table 1 Factor levels
水平A超声时间/minB液固比/（mL/g）C醇水体积比-1 20 20∶1 0.5∶1 0 25 25∶1 1.0∶1 1 30 30∶1 1.5∶1
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface test
试验号 A B C Y/%1 0-1 -1 0.138 2 1 -1 0 0.212 3 0 1-1 0.101 4-1 0 -1 0.182 5 0 0 0 0.428 6-1 -1 0 0.248 7 1 1 0 0.238 8 0.432 9 1 0-1 0.100 0 0 0 10 0 1 1 0.289 11 0 0 0 0.430 12 0 0 0 0.428 13 0 -1 1 0.230 14 -1 0 1 0.238 15 0 0 0 0.420 16 1 0 1 0.299 17 -1 1 0 0.212
回归方程的R2=0.996 7，表明方程拟合度较高，回归方程可以较好描述响应值与3个因素之间真实关系。方差分析见表3。
从表3可知模型P＜0.000 1，失拟项P=0.126 1，模型具有高度显著性，且失拟项不显著，表明回归方程拟合程度较好，可以用该回归方程优化预测提取工艺。单一的影响因素中，醇水体积比对总黄酮得率的影响具有高度显著性，液固比和超声时间的影响并不显著。交互项的 P 值依次为：AC（＜0.000 1）＜BC（0.000 2）＜AB（0.002 2），表明3个影响因素之间的交互作用均具有显著性，尤其是超声时间（A）和醇水体积比（C）之间具有高度显著关系。
2.3.2 总黄酮得率的响应面分析
图4显示了各因素交互作用对总黄酮得率影响变化的等高线图和响应面图。
表3 回归模型方程的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：***差异高度显著（P＜0.000 1）；**差异极显著（P＜0.001）；*差异显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P模型 2.19×105 9 24 290.79 538.86 ＜0.000 1***A超声时间 123.09 1 123.09 2.73 0.142 4 B液固比 17.32 1 17.32 0.38 0.555 0 C醇水体积比 35 865.12 1 35 865.12 795.62 ＜0.000 1***AB 991.62 1 991.62 22.00 0.002 2*AC 5 110.82 1 5 110.82 113.38 ＜0.000 1***BC 2 276.72 1 2 276.72 50.51 0.000 2**A2 35 914.43 1 35 914.43 796.71 ＜0.000 1***B2 48 946.88 1 48 946.88 1 085.82 ＜0.000 1***C2 71 490.81 1 71 490.81 1 585.93 ＜0.000 1***残差 315.55 7 45.08失拟项 229.46 3 76.49 3.55 0.126 1纯误差 86.09 4 21.52总和 2.19×105 16
图4 超声时间、液固比、醇水体积比对总黄酮得率的等高线图和响应面图
Fig.4 Contour plots and response surface plots of ultrasound time，liquid-solid ratio，alcohol-water ratio versus total flavonoid yield
从图4可以看出，对于A和B，A因素方向等高线的密度和响应面曲率稍高于B因素方向，说明超声时间较液固比有显著影响。同样，从图4b、图4c的等高线和响应面可以看出，醇水体积比（C）的影响显著高于超声时间（A）、液固比（B），AB、AC和 BC 3个响应面图形均呈现较明显的交互作用特征，这与表3的结果一致。
在本试验条件下，醇水体积比不仅是对总黄酮得率影响最显著的因素，而且还对影响不显著的液固比和超声时间产生了显著的交互作用，表明在一定强度的超声作用下，双水相的组成是总黄酮提取最关键的工艺参数，醇水体积比在1∶1时，总黄酮更易溶出，当醇水体积比超过1∶1时，有更多的水分子进入正丙醇相中，导致提取率降低。液固比和超声时间本身并不是显著因素，但存在较显著交互作用，可能的原因是超声时间增加总黄酮不断从藜麦固体传质至富醇的上相，而液固比可改变富醇的上相对总黄酮萃取容量，进而产生交互作用。
2.3.3 响应面优化预测及验证
基于获得的多元回归模型，应用Design-Expert8.0软件Optimization下的Point Prediction模块进行优化预测，得到最优预测条件：超声时间25.8 min、液固比28.3 ∶1（mL/g）、醇水体积比 0.89 ∶1，在该最优预测条件下总黄酮得率为0.375%。为方便操作，将各参数调整为：超声时间 26 min，液固比 28 ∶1（mL/g），醇水体积比0.9∶1。验证最优预测条件下总黄酮含量，并与传统清洗式超声辅助提取（操作和条件与本法一致）对比。结果显示，总黄酮得率实测值与预测值接近，为0.361%（n=3）。在相同条件下，与清洗式超声辅助提取（总黄酮得率为0.301%）对比，总黄酮得率明显增加。
2.4 藜麦粉的抗氧化活性
不同体积分数藜麦总黄酮提取物对DPPH自由基清除率结果如图5所示。
图5 藜麦总黄酮提取物对DPPH自由基的清除作用
Fig.5 TheclearanceeffectoftotalflavonoidsfromquinoaonDPPH radical
由图5可知，随着藜麦总黄酮提取物体积分数的增加，DPPH自由基清除率也随之增加，当样品体积分数为5%时，DPPH自由基清除能力为59.46%，其半数抑制浓度（IC50）为4.012 7 mg/mL，略高于对照物VC（2.506 7 mg/mL）。表明本试验获得的藜麦总黄酮提取物对DPPH自由基清除能力与公认的强清除剂VC相似。
3 结论
本文采用杆式超声变幅器装置，浸入正丙醇-氯化钠双水相提取体系内，建立了一种新型聚能超声-双水相集成提取方法，应用于藜麦总黄酮的提取，与已有采用清洗式超声装置的超声-双水相集成方法相比，本方法提取时间缩短，总黄酮得率明显增加，提取物表现了良好的自由基清除能力。通过正丙醇-氯化钠双水相萃取体系有效将藜麦蛋白质盐析分离，消除了提取物中藜麦蛋白质胶体形成对总黄酮得率和DPPH自由基清除率测定产生的光谱干扰，本文的研究为天然产物活性成分的高效提取分离提出了一种新的研究思路，具有较好的应用前景。
[1]ABUGOC H J E,TAYLOR S L.Quinoa （Chenopodium quinoa Willd.）:composition,chemistry,nutritional,and functional properties[J].Advances in Food & Nutrition Research,2009,58（9）:1-31.
[2]NOWAK V,DU J,CHARRONDIÈRE U R.Assessment of the nutritional composition of quinoa（Chenopodium quinoa Willd.）[J].Food Chemistry,2016,193:47-54.
[3]PELLEGRINI M,LUCAS-GONZALES R,RICCI A,et al.Chemical,fatty acid,polyphenolic profile,techno-functional and antioxidant properties of flours obtained from quinoa （Chenopodium quinoa Willd.）seeds[J].Industrial Crops & Products,2018,111:38-46.
[4]石振兴,朱莹莹,杨修仕,等.藜麦粉末中主要营养成分近红外预测模型的建立及验证[J].粮食与油脂,2017,30（12）:55-57.
[5]王磊,韦雅玲,刘长姣.超声波辅助醇提黑米中黄酮的工艺优化[J].粮食与油脂,2018,31（4）:24-28.
[6]李慧娜,田少君.油料作物中黄酮类化合物的提取方法研究进展[J].中国油脂,2017,42（8）:111-115.
[7]孙雪婷,蒋玉蓉,袁俊杰,等.响应面法优化提取藜麦种子黄酮及抗氧化活性[J].中国食品学报,2017,17（3）:127-135.
[8]吴雅露,陈琪,陈梦涛,等.响应面法优化藜麦种子黄酮的超声波辅助提取工艺[J].食品研究与开发,2019,40（21）:100-106.
[9]耿敬章.苦荞壳黄酮响应面优化提取及体外抗氧化性研究[J].粮食与油脂,2017,30（12）:25-28.
[10]朱成豪,唐健民,韦霄,等.鳞尾木中总黄酮含量测定及抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2019,40（20）:168-175.
[11]马麟,彭镰心,曹靖,等.超声波辅助提取RP-HPLC法测定藜麦中的3种碳苷黄酮[J].食品工业,2016,37（7）:192-195.
[12]张燕,陈艳,姜玮,等.微波技术辅助提取蓝莓枝干黄酮工艺优化研究[J].食品与发酵科技,2019,55（1）:5-10.
[13]王珂,马海乐,叶晓非.菊粉双频逆流聚能式超声辅助提取技术及其抗氧化活性研究[J].中国农业科技导报,2015,17（5）:81-87.
[14]张艳艳,马海乐,Rosemond Godbless Dadzie,等.逆流聚能式超声预处理对谷朊蛋白酶解及其结构和热特性的影响[J].中国食品学报,2017,17（3）:73-81.
[15]胡玉勇.超声变幅器的设计理论及其性能参数的实验研究[D].太原:太原理工大学,2010.
[16]董彩文,王浩瑾,张明俊,等.双水相技术提取黄秋葵黄酮的工艺条件研究[J].粮食与油脂,2019,32（10）:85-88.
[17]张喜峰,罗光宏,张芬琴,等.响应面试验优化[Bmim]Cl-Na2SO4双水相萃取分离琉璃苣种子总黄酮工艺[J].食品科学,2015,36（14）:50-54.
[18]程卓,刘春平,卢延斌.珍珠层可溶性蛋白质的双水相萃取分离方法研究[J].食品工业,2018,39（8）:64-68.
[19]李治城,李靖靖,潘晓静,等.双水相体系萃取纯化紫甘蓝色素[J].中国食品添加剂,2019,30（9）:77-81.
[20]范晓伟,冉露,郭箐,等.离子液体结合超声辅助和双水相萃取提取分离柑橘果皮中黄酮类化合物[J].食品科学,2020,41（10）:265-271.
[21]ZHISHEN J,MENGCHENG T,JIANMING W.The determinationof flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects onsuperoxide radicals[J].Food Chemistry,1999,64（4）:555-559.
[22]化志秀,芦艳,鲁周民,等.红枣醋发酵阶段主要成分及抗氧化性的变化[J].中国食品学报,2013（8）:248-253.
[23]郑平,吴幼茹,杨继伟,等.甘蔗醋发酵产物在体外及模拟人体肠胃环境中的抗氧化活性[J].食品科学,2016（37）:242-247.
[24]沈志燕,高云涛,张海芬,等.荞麦蜂花粉破壁扫描电子显微镜分析及黄酮模拟消化释放[J].食品科学,2020,41（12）:1-6.
[25]李侠,臧学丽,徐祎博,等.AB-8大孔树脂纯化绿豆皮黄酮工艺优化及纯化前后抗氧化能力比较[J].食品科学,2018,39（10）:283-290.