灵芝（Ganoderma lucidum Karst.）是我国重要的药食同源真菌资源，属担子菌纲多孔菌科，已有数千年药用历史，具有补气安神、强身健体等很高的药用价值[1-3]。灵芝中主要的活性成分是灵芝多糖，具有抗氧化、增强免疫力、调节血糖血脂、抗衰老和抗肿瘤等功效[4-5]。黑灵芝（Ganoderma atrum）被誉为灵芝中的极品，对人体健康具有良好的药用疗效，长期食用可调理多种机能[6]。
运动性疲劳是运动训练中常见的生理现象，是机体出现的氧化应激反应，如不能及时消除疲劳可引起精神倦怠、运动能力下降、免疫力下降等病理现象[7]。通过补充合理的营养补剂或药物缓解疲劳的产生，是消除运动性疲劳的有效措施[8]。鉴于黑灵芝多糖对人体具有多种调理机能，本研究从黑灵芝中分离纯化黑灵芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，GAP），研究其抗氧化能力，改善过度运动诱导的氧化应激，缓解运动性疲劳的产生。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
健康雄性昆明小鼠50只，5周龄，体重20 g～22 g，SPF 级[许可证号：SCXK（京）2019—0002]：北京华阜康生物科技股份有限公司；黑灵芝：江西赣州赣南灵芝基地；红景天西洋参胶囊：广州赛健生物科技有限公司。
血乳酸（blood urea nitrogen，BLA）试剂盒、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒、蒽酮试剂、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、Na+K+-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶及 Ca2+Mg2+-ATP 酶试剂盒：南京建成生物工程研究所。血清葡萄糖（glucose，GLU）试剂盒：中生北控生物科技。
1.2 仪器与设备
JD-XSC型小鼠恒温游泳池：上海继德教学实验器械厂；TGL-20B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LH750血液分析仪：美国贝克曼库尔特有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；BT-3000 Plus全自动生化分析仪：意大利Biotecnica公司；XO-SM100超声微波组合反应装置：南京先欧仪器制造有限公司；FA1204T分析天平：厦门雄发仪器仪表有限公司；FSH-2型匀浆机：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；ALPHA1-2真空冷冻干燥机：德国Christ公司。
1.3 方法
1.3.1 黑灵芝多糖（GAP）的制备
黑灵芝子实体粉碎至200目，用体积分数95%乙醇浸泡24 h脱脂，加入100℃纯净水浸提2 h，过滤，将浸提液旋蒸浓缩至原体积1/5，加入乙醇置于4℃的冰箱中2 h沉淀多糖，3 000 r/min离心30 min，采用Sevag法脱蛋白，然后依次用自来水透析48 h、蒸馏水透析24 h、超纯水透析24 h，用体积分数95%乙醇沉淀，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤2次，浓缩，冷冻干燥，得到精制黑灵芝多糖；通过高效液相色谱法检测，纯度＞99.8%，通过高效液相色谱法、红外光谱法、气相色谱法、分子大小排阻色谱法及氨基酸分析仪测得多糖主要为甘露糖、半乳糖和葡萄糖，其质量比为 1∶1.28∶4.91，平均分子量为1 013 kDa[9]。
1.3.2 动物分组与灌胃
饲养室温度（22±2）℃，相对湿度（50±5）%，自然光照，分笼饲养，自由饮水及摄食。小鼠普通饲料饲养一周，随机分为5个实验组，分别为黑灵芝多糖低剂量组（GAPL组）、中剂量组（GAPM 组）、高剂量组（GAPH组）、空白组（BC组）、阳性对照组（AG组），每组10只小鼠，共50只。
将黑灵芝多糖制备成浓度分别为2.5、5、10 mg/mL的水溶液，每日灌胃10 mL/（kg·d），即低、中、高剂量组每天分别灌胃25、50、100 mg/（kg·d）黑灵芝多糖；空白组每日灌胃一次蒸馏水10 mL/（kg·d）；阳性对照组按说明书推荐用量每日灌胃红景天西洋参溶液200 mg/（kg·d），连续灌胃 30 d。
1.3.3 小鼠体重测定
试验第0、10、20、30天早上8点称量小鼠体重并记录。
1.3.4 负重游泳实验
小鼠末次灌胃30 min后，将鼠尾根部系上其体质量5%的铅条，将小鼠置于游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）中游泳，水深30 cm，水温（25±1.0）℃。记录小鼠自游泳开始至鼻孔10 s不能浮出水面的时间，即小鼠游泳力竭时间[10]。
1.3.5 血清疲劳相关指标检测
小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦净水，眼球取血，在4℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液血清于EP管中，-20℃保存备用；检测血清乳酸（BLA）、血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），严格按照试剂盒说明书进行操作[11]。
1.3.6 肝糖原和肌糖原检测
小鼠末次灌胃30 min后游泳至力竭，取出擦净水，取血后脱颈处死小鼠取其肝脏和后腿肌肉，用生理盐水漂洗3遍，用滤纸擦干并称重，取0.5 g标本，按1∶9（质量比）加入生理盐水，并置于冷冻研磨机中进行粉碎匀浆化，匀浆后3 000 r/min离心15 min，取上清液于EP管中，-20℃保存备用，以分光光度法利用蒽酮试剂测定肝糖原和肌糖原含量[12]。
1.3.7 肝组织抗氧化指标检测
按照1.3.6的方法制备肝组织液，检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、Na+K+-ATP 酶及 Ca2+Mg2+-ATP酶，严格按照试剂盒说明书进行操作[13]。
1.4 统计分析
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，数据表示为平均值±标准差，单因素方差分析（One-way ANOVA）进行差异显著性检验，P＜0.05具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 试验期间小鼠的一般状况
在试验过程中，各组小鼠精神状态、食欲、睡眠均良好，未出现死亡现象。黑灵芝多糖对小鼠体重的影响如表1所示，各组间无显著差异。
2.2 黑灵芝多糖对小鼠负重游泳力竭时间的影响
黑灵芝多糖对小鼠负重游泳力竭时间的影响见图1。
由图1可知，与空白组比较，黑灵芝多糖低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠负重游泳力竭时间显著升高（P＜0.05），各组分别升高 37.4%、51.2%、60.3%、53.9%；与阳性对照组比较，黑灵芝多糖低剂量组小鼠负重游泳力竭时间降低10.8%，具有显著性差异（P＜0.05），黑灵芝多糖中、高剂量组对负重游泳力竭时间的延长能力与阳性对照组相似。
表1 黑灵芝多糖对小鼠体重的影响（
±s，n=10）
Table 1 Effects of GAP on body weight of mice（±s，n=10）
组别 试验初始体重/g第10天体重/g第20天体重/g第30天体重/g BC 21.32±1.65 25.72±1.50 29.02±1.83 32.16±2.17 AG 21.53±1.41 25.93±1.62 29.69±1.95 32.67±2.54 GAPL 21.61±1.23 25.51±1.37 29.46±1.64 32.08±2.16 GAPM 21.48±1.76 25.09±1.71 28.85±1.79 31.92±2.05 GAPH 21.59±1.57 25.38±1.76 29.17±2.07 32.43±2.71
图1 黑灵芝多糖对小鼠负重游泳力竭时间的影响（±s，n=10）
Fig.1 Effect of GAP on the time of weight-loading swimming exhaustion in mice（±s，n=10）
*表示与BC组相比差异显著（P＜0.05）；△表示与AG组相比差异显著（P＜0.05）。
2.3 黑灵芝多糖对小鼠血清抗疲劳效果的影响
黑灵芝多糖对小鼠血清抗疲劳效果的影响见图2。
图2 黑灵芝多糖对小鼠血清抗疲劳效果的影响（±s，n=10）
Fig.2 Effect of GAP on anti-fatigue of serum in mice（±s，n=10）
*表示与BC组相比差异显著（P＜0.05）；△表示与AG组相比差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，与空白组比较，黑灵芝多糖组低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠血清中葡萄糖含量显著升高（P＜0.05），各组分别升高 17.6%、47.9%、58.9%、59.7%；乳酸含量各组显著降低（P＜0.05），分别降低12.5%、19.0%、22.1%、19.4%；尿素氮含量各组显著降低（P＜0.05），分别降低 8.7%、16.5%、20.1%、19.6%；肌酸激酶活力各组显著降低（P＜0.05），分别降低19.5%、37.1%、39.9%、41.4%；乳酸脱氢酶活力各组显著降低（P＜0.05），分别降低 6.2%、9.4%、11.2%、10.3%；与阳性对照组比较，黑灵芝多糖低剂量组血清中葡萄糖含量降低 26.4%，具有显著性差异（P＜0.05）；乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脱氢酶活力均显著升高（P＜0.05），分别升高 8.6%、13.8%、37.5%、4.5%，黑灵芝多糖中、高剂量组对葡萄糖储备的升高能力以及对乳酸含量、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脱氢酶活力的降低能力与阳性对照组相似。
2.4 黑灵芝多糖对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响
黑灵芝多糖对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响见图3。
由图3可知，与空白组比较，黑灵芝多糖低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠的肝糖原和肌糖原含量显著升高（P＜0.05），肝糖原含量各组分别升高61.6%、83.7%、92.6%、87.5%，肌糖原含量各组分别升高25.3%、42.2%、51.8%、45.7%；与阳性对照组比较，黑灵芝多糖低剂量组肝糖原和肌糖原含量显著降低（P＜0.05），分别降低13.8%、14.0%，黑灵芝多糖中、高剂量组对肝糖原和肌糖原储备的升高能力与阳性对照组相似。
图3 黑灵芝多糖对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响（±s，n=10）
Fig.3 Effect of GAP on the contents of liver glycogen and muscle glycogen in mice（±s，n=10）
*表示与BC组相比差异显著（P＜0.05）；△表示与AG组相比差异显著（P＜0.05）。
2.5 黑灵芝多糖对小鼠血清和肝组织抗氧化效果的影响
黑灵芝多糖对小鼠血清和肝组织抗氧化效果的影响见图4。
图4 黑灵芝多糖对小鼠血清和肝组织抗氧化效果的影响（±s，n=10）
Fig.4 Effect of GAP on antioxidation of serum and liver in mice（±s，n=10）
*表示与BC组相比差异显著（P＜0.05）；△表示与AG组相比差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，与空白组比较，黑灵芝多糖低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠血清和肝组织中丙二醛含量显著降低（P＜0.05），随着黑灵芝多糖剂量增加，丙二醛含量降低越明显；与空白组比较，黑灵芝多糖低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠血清和肝组织中超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力均显著升高（P＜0.05），随着黑灵芝多糖剂量增加，抗氧化酶活力升高越明显；与阳性对照组比较，黑灵芝多糖低剂量组血清和肝组织中丙二醛含量显著升高（P＜0.05），超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力均显著降低（P＜0.05），黑灵芝多糖中、高剂量组对丙二醛含量的降低能力以及对超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活力和谷胱甘肽过氧化物酶活力的升高能力与阳性对照组相似。
2.6 黑灵芝多糖对小鼠肝组织Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影响
黑灵芝多糖对小鼠肝组织Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影响见图5。
由图5可知，与空白组比较，黑灵芝多糖低、中、高剂量组、阳性对照组小鼠肝组织中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP 酶活性显著升高（P＜0.05），Na+K+-ATP酶活性各组分别升高12.8%、27.9%、30.4%、25.1%，Ca2+Mg2+-ATP酶活性各组分别升高15.9%、30.2%、31.7%、28.6%；与阳性对照组比较，黑灵芝多糖低剂量组肝组织中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性显著降低（P＜0.05），分别降低 9.8%、10.1%，黑灵芝多糖中、高剂量组对Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的升高能力与阳性对照组相似。
图5 黑灵芝多糖对小鼠肝组织Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影响（±s，n=10）
Fig.5 Effect of GAP on activities of Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase in liver of mice（±s，n=10）
*表示与BCM组相比差异显著（P＜0.05）；△表示与AG组相比差异显著（P＜0.05）。
3 讨论与结论
运动性疲劳是运动训练中常见的现象，肝糖原、肌糖原、血乳酸、尿素氮、乳酸脱氢酶活力、肌酸激酶活力、抗氧化酶活力均反应机体的疲劳程度[14]。本研究发现，黑灵芝多糖低、中、高剂量组小鼠负重游泳力竭时间显著高于空白组，表明黑灵芝多糖提高小鼠运动耐力，延长运动力竭的时间，延缓运动性疲劳的产生[15]。分析其原因发现，黑灵芝多糖低、中、高剂量组小鼠力竭游泳后肝糖原、肌糖原、血清中葡萄糖含量均显著高于空白组，血中乳酸、尿素氮含量、肌酸激酶活力和乳酸脱氢酶活力均显著低于空白组，表明黑灵芝多糖可以有效增加肝糖原、肌糖原的储备、减少运动中能源物质的消耗，节约蛋白质分解，降低乳酸、尿素氮等代谢物质的产生；缓解力竭运动中血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活力，避免由于其活力过高引起骨骼肌、心肌等组织损伤、坏死，保护肌组织，从而提高机体对力竭运动负荷的耐受能力，缓解运动性疲劳的程度[16]。
高强度长时间运动时体内耗氧量剧增，肝脏、骨骼肌和心肌等组织脂质过氧化反应加强，引起体内自由基产生增加[17]。自由基可与体内糖类、脂类、蛋白质和核酸等物质反应，破坏细胞结构和功能，体内抗氧化防御系统可以有效清除自由基，保持自由基动态平衡[18]。但力竭运动时，体内自由基产生的过快过多，抗氧化系统中的活性物质过多消耗，无法及时清理自由基，导致自由基与细胞膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成具有细胞毒性的过氧化物，脂质过氧化物可自发分解成更多的自由基，引起自由基连锁反应[19]。丙二醛是脂质过氧化的主要代谢产物，其含量升高提示体内抗氧化防御系统失衡[20]。本研究发现，黑灵芝多糖低、中、高剂量组小鼠血清和肝组织中丙二醛含量显著低于空白组，超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力均显著高于空白组，表明黑灵芝多糖有效降低力竭运动中氧化应激反应，减少脂质过氧化物的产生，提高抗氧化酶的活力，降低氧化损伤的程度，维持机体正常的抗氧化防御系统[21]。
Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶分别驱动Na+/K+和Ca2+/Mg2+于细胞膜两侧双向运输，维持细胞膜电位，催化ATP分解为ADP供能，其活性反映机体能量代谢水平，机体自由基、运动、缺氧等状况可影响ATP酶活性[22]。力竭运动中，体内过剩的自由基攻击Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶，诱导其构象发生改变，使酶形成以碳原子为中心的自由基，降低酶的活性[23]。又由于自由基链式反应及丙二醛作用使细胞膜完整性和流动性改变，细胞内 Na+、Ca2+排出受阻，胞内 Na+、Ca2+浓度增加，导致细胞膜跨膜转运功能失衡，影响细胞内外物质交换，降低氧的转运能力，减少组织供氧，缺氧又加重自由基的损害作用，进一步降低ATP酶的活性[24]。本研究发现，黑灵芝多糖低、中、高剂量组小鼠肝组织中Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性显著高于空白组，表明黑灵芝多糖有效提高Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，改善能量系统在力竭运动中的供能能力，提高机体的运动能力[25]。
综上所述，黑灵芝多糖通过增加机体肝糖原和肌糖原的储备、减少乳酸、尿素氮、丙二醛等代谢物质的积累、提高机体超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶系的活力以及Na+K+-ATP酶及Ca2+Mg2+-ATP酶活性，增强机体运动能力，缓解运动性疲劳的程度，而且其功效与已具备改善运动性疲劳药效的药物相类似[26]。后续将对黑灵芝多糖抗氧化及抗疲劳机制进行深入研究，为黑灵芝多糖开发为提高运动能力及抗疲劳的运动营养剂提供科学依据。
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