菊花具有疏散风热、清热解毒的功效，在诸多本草古籍中均有记载，是一种药食同源性的植物。其主要活性因子包括总黄酮和挥发油类等物质[1]。于慧[2]研究发现菊花具有抗氧化作用。除此以外，菊花水提液能明显抑制D-半乳糖导致的脂质过氧化，降低血中丙二醛含量，提高血中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力[3]。水提法是中药有效成分提取的常用方法，谢占芳[4]对该法提取菊花黄酮的成分分析发现，除黄酮类化合物外，粗提物中还包括一些水溶性淀粉、黏液质等无效成分。
引起视疲劳发生的因素很多，氧化应激是诱导视疲劳发生的主要内因之一。唐琼[5]和王志玲等[6]研究发现，视疲劳作为一种眼部综合症，主要表现为眼痒干涩、畏光流泪等症状，而自由基诱发的脂质过氧化物是视疲劳发生的病理基础。Sun Liyang等[7]、李涛等[8]和程昱[9]研究发现，黄酮类化合物能有效地激活肝脏组织中抗氧化基因的表达，促进机体内相关抗氧化物质的释放。Naresh等[10]研究发现，当光进入细胞后，立即被线粒体中的细胞色素c氧化酶吸收，导致呼吸链反应增加，引发氧化应激和炎症反应。Song Delu等[11]研究发现，10 000 Lux光强能够明显加剧眼球内部的氧化应激损伤，并且能够引起视力功能上的损害。谷炎培等[12]和SONG D等[13]研究显示长时间强光照射会引起晶状体的损伤，伴随色素紊乱，并引起晶状体浑浊现象，其原因可能是眼球内部的晶状体囊受到过量活性氧自由基的攻击，导致晶状体代谢出现失衡。
肝脏是人体最重要的代谢和解毒器官。王幼生等[14]发现，肝组织的不正常代谢与视疲劳有紧密的联系，氧化应激引起的肝功损伤会导致维生素A的代谢失衡，从而降低眼对外界刺激的抵抗能力。桑传兰等[15]、KRIGEL A等[16]和TANITO M等[17]研究发现，过强光照诱导体内产生过量的活性自由基，进而导致肝细胞脂质氧化，造成肝功受损。为探讨菊花的抗氧化效果，本文采用菊花粗提物为原料，以C57BL/6J小鼠为实验动物，经强光照射后，检测晶状体与肝组织抗氧化指标，探讨其对氧化应激相关的视疲劳的缓解作用。
1 材料和方法
1.1 材料及试剂
丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（分析纯，纯度＞99%）：上海麦克林生化科技有限公司；复方托吡卡胺滴眼液：参天制药（中国）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈阳兴齐眼药股份有限公司。
1.2 菊花粗提物来源
通过水提法制备菊花粗提物[18]（每4.255 g菊花可制得菊花粗提物1 g），采用SN/T 4592—2016《出口食品中总黄酮的测定》中植物源性食品总黄酮的测定方法，测定提取物总黄酮含量为5.0%。
1.3 实验动物
健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周龄，（18±1）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司（许可证号为SCXK（京）2016-0002），饲养于天津科技大学实验动物中心[（23±2）℃，相对湿度55%～75%]。小鼠被放置在白色塑料笼中，每笼4只，每组3笼。动物房于7∶00～19∶00给予正常光照，其余时间无光照。实验期间为动物提供充足的食物和水。本研究的所有实验程序均按照天津科技大学动物实验伦理委员会批准的方案进行。
1.4 动物分组及光损伤模型制备
设立5个实验分组，每组12只，期间采用灌胃方式给药，其中正常对照组和光损伤模型组每天每只灌胃无菌生理盐水0.2 mL；菊花粗提物低、中和高剂量组的给药剂量分别为230、300、380 mg/kg bw，连续给药8周。
给药结束后进行强光造模。造模过程中无外界光源干扰。每只小鼠被单独放置在由亚克力透明板制成的小方格中，每个格子的长、宽、高分别为10、10、8 cm，并在光照前对小鼠眼球进行涂抹眼药处理，避免眼球表面由于长时间光照引起脱水。将光照器悬挂于小鼠顶端50 cm处，采用垂直照射方式照射，并在与小鼠同一高度处放置温度计，保证温度维持在（23±2）℃范围内，排除温度升高引起小鼠眼球光热损伤的可能。根据前期预实验结果，照射光强为（9 000±500）Lux，照射时间为 14 ∶00～18 ∶00，连续照射 7 d，光照期间正常进食与饮水。
正常组、模型组和菊花粗提物低、中、高剂量组分别用NOR、MOD、JHL、JHM和 JHH表示。
1.5 体重及摄食量记录
体重及摄食量自给药开始后进行记录，其体重每周称量一次，共计8周，摄食量每天测量一次并记录。
1.6 晶状体中相关抗氧化能力的检测
小鼠在脱颈处死后立即摘取眼球，于高倍显微镜下，将晶状体从眼球中分离出来，分离过程在4℃环境中进行。将分离得到的晶状体组织匀浆，4℃离心10 min（12 000 r/min），吸取上清液，供待检测生化指标（GSHPx、T-AOC）使用。测定参照试剂盒操作说明书进行。
1.7 肝组织中相关抗氧化能力指标检测
参考刘佳维等[19]的研究方法，通过小鼠处死后解剖得到肝脏组织，并立即放入-80℃冰箱中保存，供待检测生化指标（MDA、SOD、CAT、GSH-Px）使用。制备肝组织匀浆时，取出放置于低温保存的肝组织，称取0.1 g肝组织并与0.9 mL无菌生理盐水混合，在冰浴中将肝组织匀浆。在4℃、3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液备用。各项指标根据试剂盒说明检测。
1.8 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，结果以
±s表示，P＜0.05表示具有显著差异。
2 结果分析
2.1 菊花粗提物对光损伤小鼠体重与摄食量的影响
菊花粗提物对光损伤小鼠体重与摄食量的影响如表1所示。
表1 菊花粗提物对小鼠体重及摄食量的影响
Table 1 Effect of crude extract of chrysanthemum on body weight and food intake of mice
注：上标字母不同表示组间具有显著差异（P＜0.05），字母相同表示组间无显著性差异（P＞0.05）。
组别 起始体重/g 最终体重/g 日均摄入量/g NOR 19.88±2.03a 32.55±3.22a 4.20±0.44a MOD 20.31±1.88a 31.26±2.86a 4.35±0.39a JHL 19.81±1.98a 33.03±4.12a 4.12±0.55a JHM 20.38±2.10a 32.69±3.26a 4.28±0.49a JHH 21.05±2.23a 32.31±3.69a 4.31±0.58a
从起始体重和最终体重结果上看，各组之间的起始体重和最终体重均不显著（P＞0.05）。从日均摄入量结果上看，各组小鼠日均摄入量在4 g左右，且各组之间的日均摄食量均无显著性差异（P＞0.05）。
2.2 菊花粗提物对光损伤小鼠晶状体抗氧化结果分析
菊花粗提物对光损伤小鼠晶状体抗氧化结果见表2。
表2 各组晶状体抗氧化指标
Table 2 Antioxidant index of lens in each group
注：上标字母不同表示组间具有显著差异（P＜0.05），字母相同表示组间无显著性差异（P＞0.05）。
组别GSH-Px活力/（U/mg prot）T-AOC/（U/mg prot）NOR 48.13±5.72a 6.01±0.68a MOD 29.55±3.46c 1.33±0.18c JHL 36.58±4.74b 3.12±0.38b JHM 38.15±3.41b 3.25±0.39b JHH 39.44±3.38b 3.36±0.43b
如表2所示，与正常组比较，模型组小鼠晶状体内GSH-Px活力明显下降，具有显著差异（P＜0.05），说明强光照射能够引起晶状体抗氧化能力的降低。菊花粗提物各剂量组的晶状体内GSH-Px活力明显高于模型组，并且菊花粗提物高剂量组的GSH-Px的活力要高于菊花粗提物低剂量组，呈剂量依赖性。与模型组比较，菊花粗提物低、中和高剂量组均差异显著（P＜0.05）。
T-AOC测定发现，与正常组比较，模型组小鼠晶状体内总抗氧化能力明显下降，具有显著差异（P＜0.05）。菊花粗提物低、中和高剂量组的总抗氧化能力明显高于模型组，具有显著差异（P＜0.05）。低、中和高剂量的菊花粗提物均对光损伤小鼠晶状体具有不同程度的保护作用，并且呈剂量依赖性。
2.3 菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中各抗氧化指标的影响
菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中各抗氧化指标的影响见表3。
表3 各组小鼠肝组织抗氧化指标
Table 3 Antioxidant index of liver in each group
注：上标字母不同表示组间具有显著差异（P＜0.05），字母相同表示组间无显著性差异（P＞0.05）。
组别 MDA含量/（nmol/mg prot）SOD活力/（U/mg prot）CAT活力/（U/mg prot）GSH-Px活力/（U/mg prot）NOR 0.83±0.11c 39.57±3.68a62.00±6.33a1812.10±115.21a MOD 1.60±0.15a 25.47±3.24c34.30±3.56d1420.05±133.62c JHL 1.33±0.17b 32.58±3.58b38.47±4.22c1550.03±144.25b JHM 1.25±0.21b 34.51±3.52b40.23±4.33c1590.64±148.58b JHH 1.21±0.17b 36.21±3.52b45.31±4.21b1612.67±152.30b
2.3.1 菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中MDA含量的影响
强光照射会诱导小鼠体内产生大量的活性氧自由基，其中包括醛基、羰基等。这些过量的活性氧自由基会破坏体内原有的氧化应激平衡体系，并且对生物体内DNA的合成及转录造成影响，使体内出现一系列应激反应[20-21]。表3结果表明，长时间过强的光照会引起小鼠肝组织中MDA含量显著增加，而摄入菊花粗提物后，与模型组相比，其MDA含量分别下降16.9%、21.9%和24.4%，并具有显著差异（P＜0.05）。
2.3.2 菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中SOD活力的影响
超氧化物歧化酶在生物体内广泛存在，具有良好的清除自由基的能力，其在体内的水平高低与体内氧化应激水平直接相关[22]。表3结果显示，长时间过强的光照会导致肝组织中SOD活力明显降低。与模型组比较，菊花粗提物低、中和高剂量组小鼠肝组织中的SOD活力明显上升，分别提高27.9%、35.5%和42.2%。其中，与模型组比较，均差异显著（P＜0.05）。
2.3.3 菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中CAT活力的影响
过氧化氢酶的主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，能够减缓氧化应激引起的损伤[23]。表3结果显示，与正常组相比，光照会引起肝组织中CAT活力明显降低（P＜0.05）。给予菊花粗提物连续干预8周后，小鼠肝组织中的CAT活力明显上升，分别提高12.2%、17.3%和32.10%。与模型组相比，菊花粗提物各剂量组均差异显著（P＜0.05）。
2.3.4 菊花粗提物对光损伤小鼠肝组织中GSH-Px活力的影响
谷胱甘肽过氧化物酶是机体中一种重要的过氧化物分解酶[24]。表3结果显示，光损伤之后导致肝组织中GSH-Px活力明显降低。给予菊花粗提物连续干预8周后，肝组织中的GSH-Px活力明显上升，分别提高9.2%、12.0%和13.5%。与模型组相比，菊花粗提物各剂量组均具有显著性差异（P＜0.05）。
3 结论
研究结果显示，（9 000±500）Lux光强可以明显加剧晶状体和肝组织氧化应激过程，引起小鼠晶状体和肝组织抗氧化能力的下降。光损伤动物实验评价发现，230、300、380 mg/kg bw剂量的菊花粗提物均能够增强小鼠的抗氧化能力。晶状体氧化结果显示，菊花粗提物干预组的GSH-Px活力与T-AOC值明显高于模型组，呈剂量依赖性。肝脏抗氧化结果显示，与模型组相比，低、中和高剂量的菊花粗提物明显降低了肝组织中MDA含量，升高了SOD、CAT和GSH-Px 3种抗氧化酶的活力，说明3种剂量的菊花粗提物对肝组织的抗氧化能力均有增强作用。视疲劳是一种眼部综合症，晶状体和肝组织的异常代谢是导致其发生的重要内因，本研究结果提示，菊花粗提物对氧化应激相关的损伤具有缓解功能，将为菊花视疲劳类视力保护产品的开发提供科学依据。
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