酸菜是酸渍大白菜的简称，指在低浓度食盐条件下，经过乳酸菌发酵而形成的蔬菜发酵制品，是我国东北地区传统发酵食品之一[1-3]。酸菜的制作过程其实就是乳酸菌利用白菜作为培养基发酵产生乳酸的过程。乳酸是一种重要的多用途有机酸，可广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域，按其构型及旋光性可分为L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸三类[4-6]。医学研究证明，人体只具有代谢L-乳酸的酶（L-乳酸脱氢酶），只能代谢L-乳酸，而D-乳酸进入人体后由于不能代谢会使血尿酸度提高，过量地摄入就会引起代谢紊乱，造成酸中毒等不良反应，危害人体健康[7-8]。世界卫生组织明确规定，成人每天摄入D-乳酸的量不得超过100 mg/kg体重，3个月以下的婴儿食品中不应加入D-乳酸，而对于L-乳酸则不加限制[9-10]。传统酸菜发酵产物多为D-乳酸，因此，就需要对传统酸菜进行改良，要筛选出高产L-乳酸、生长性能好、产酸力强的优良菌株[11-14]，才能更好地满足广大消费者对食品安全性的要求。
本文从自然发酵酸菜汁中筛选高产L-乳酸的乳酸菌，并用响应面法对其发酵条件进行优化，为生产出安全优质的酸菜提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样品
自然发酵酸菜：市售。
1.1.2 试剂
蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、琼脂、柠檬酸二铵、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰、磷酸氢二钾（均为分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；D/L-乳酸检测试剂盒（D/L-lactic acid assay lit）：爱尔兰 Megazyme公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基 ：牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠2.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、吐温 80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、琼脂粉 15.0 g、水 1.0 L，pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。
1.1.4 主要仪器设备
离心机（Z-16PK）：Sigma公司；高压灭菌锅（SX-500）：TDMY KOGYO 公司；电子分析天平（JA2003）：上海越平科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；恒温培养箱（GSP-9080MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 方法
1.2.1 产L-乳酸乳酸菌的分离和纯化
将自然发酵酸菜的酸菜汁液稀释至10-7，涂于MRS平板培养基，32℃恒温培养2 d～4 d。挑选单菌落进行分离纯化。纯化后的菌株分别接到液体MRS培养基中，32℃静置培养24 h，进行L-乳酸检测[15]，按D/L-乳酸检测试剂盒步骤进行。产L-乳酸的菌株作为以下试验目标菌。
1.2.2 发酵条件优化
1.2.2.1 发酵时间对乳酸菌数和L-乳酸产量的影响
将菌株按3%接种到发酵培养基中，于32℃条件下培养 14、16、18、20、22、24 h 及 26 h 后测发酵液的菌数和L-乳酸产量。
1.2.2.2 发酵温度对乳酸菌数和L-乳酸产量的影响
将菌株按3%接种到发酵培养基中，设28、30、32、34、36、38℃6个温度条件，培养20 h后测发酵液的菌数和L-乳酸产量。
1.2.2.3 接种量对乳酸菌数和L-乳酸产量的影响
将菌株按1%、2%、3%、4%、5%接种到发酵培养基中，在32℃条件下培养20 h后测发酵液的菌数和L-乳酸产量。
1.2.2.4 初始pH值对乳酸菌数和L-乳酸产量的影响
将菌株按3%接种到发酵培养基中，设定培养基初始 pH 值为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5，在 32 ℃条件下培养20 h后测发酵液的菌数和L-乳酸产量。
1.2.2.5 Box-Behnken响应面试验
根据单因素试验结果，选取对产L-乳酸影响显著的因素水平，以L-乳酸产量为响应值，通过Design-Expert 8.0.6软件设计四因素三水平Box-Behnken响应面试验[16-19]，具体方案如表1所示。
表1 响应面因素水平
Table 1 Factors and levels of the response surface methodology
水平 因素A接种量/% B发酵时间/h C发酵温度/℃ D初始pH值-1 2 18 30 5.5 0 3 20 32 6.0 1 4 22 34 6.5
2 结果与分析
2.1 产L-乳酸乳酸菌的分离和纯化
从自然发酵的酸菜汁中分离得到4株乳酸菌，分别命名为 LZH-1、LZH-2、LZH-3和 LZH-4，通过产 L-乳酸检测发现，只有LZH-3产L-乳酸。L-乳酸产量为22.52 g/L。LZH-3的菌落形态和菌体形态见图1。
图1 LZH-3的菌落形态和菌体形态
Fig.1 The colony morphology and microscopic morphology of LZH-3
2.2 发酵条件优化试验结果
2.2.1 发酵时间对菌数和L-乳酸产量的影响
发酵时间对菌数和L-乳酸产量的影响见图2。
图2 发酵时间对菌数和L-乳酸产量的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on bacteria number and L-lactate production
如图2所示，在接种后14 h～20 h内，LZH-3快速生长，L-乳酸产量也随之增长，这时LZH-3处于对数生长期，生长代谢都处于旺盛期，发酵到20 h菌数达到最高，L-乳酸产量也达到最高值22.32 g/L，之后随着发酵时间的延长，菌数趋于平衡，L-乳酸产量基本没有变化，这是因为LZH-3进入生长稳定期，代谢达到平衡，这与该菌的生长曲线相吻合。
2.2.2 发酵温度对菌数和L-乳酸产量的影响
发酵温度对菌数和L-乳酸产量的影响见图3。
图3 发酵温度对菌数和L-乳酸产量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteria number and L-lactate production
从图3可以看出，随着发酵温度的升高，菌株LZH-3菌数和L-乳酸产量都随之增加，到32℃时生长代谢最为旺盛，菌数和L-乳酸产量达到最高，再随着温度升高生长繁殖受到抑制，同时代谢能力也衰退，菌数和L-乳酸产量都呈下降趋势。故确定LZH-3最适宜的发酵温度和产L-乳酸温度为32℃。
2.2.3 接种量对菌数和L-乳酸产量的影响
接种量对菌数和L-乳酸产量的影响见图4。
图4 接种量对菌数和L-乳酸产量的影响
Fig.4 Effect of inoculation amount on the number of bacteria and L-lactate production
从图4可以得到，随着接种量的增加，菌数和L-乳酸产量均增加，但当接种量超过3%的时候，菌数和L-乳酸产量都略有下降，应该是由于接种量过多导致养分不足，菌的繁殖受到限制，从而影响了L-乳酸的产量。综合上述结果确定LZH-3的最适接种量为3%。
2.2.4 初始pH对菌数和L-乳酸产量的影响
初始pH值对菌数和L-乳酸产量的影响见图5。
图5 初始pH值对菌数和L-乳酸产量的影响
Fig.5 Effect of initial pH on bacteria number and L-lactate production
如图5所示，随着初始pH值的增加，菌数和L-乳酸产量都成增加趋势，到pH值为6时菌数和L-乳酸产量达到最高。在初始pH值在6～6.5的条件下，菌株LZH-3的菌数和L-乳酸产量均可保持在一个较高的水平。初始pH值继续升高，菌数和L-乳酸产量迅速下降，因此菌株LZH-3生长繁殖及产L-乳酸的最适宜pH值是6。故菌株LZH-3的发酵初始pH值选择6。
2.2.5 响应面法优化发酵条件
2.2.5.1 模型建立及显著性分析
以L-乳酸产量为响应值，运用Box-Benhnken设计29组试验。Box-Benhnken试验设计及结果见表2。
表2 Box-Benhnken试验设计及结果
Table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken
试验号 A接种量 B发酵时间L-乳酸产量/（g/L）1 0 -1 1 0 23.52 2 0 0 0 0 27.13 3 0 -1 0 -1 16.59 4 0 1 1 0 25.38 5 1 0 -1 0 14.64 6 -1 0 0 -1 16.41 7 0 -1 0 1 24.16 8 1 0 0 1 23.61 9 1 0 0 -1 19.65 10 0 1 0 1 25.52 11 0 0 -1 -1 11.09 12 0 0 0 0 26.51 13 1 -1 0 0 22.29 14 0 0 0 0 26.28 15 0 0 0 0 26.24 16 -1 1 0 0 24.24 17 0 -1 -1 0 13.14 18 0 0 0 0 26.41 19 -1 -1 0 0 20.04 20 1 1 0 0 24.29 21 -1 0 -1 0 15.39 22 0 0 -1 1 16.87 23 0 0 1 -1 21.86 C发酵温度D初始pH值
续表2 Box-Benhnken试验设计及结果
Coutinue table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken
试验号 A接种量 B发酵时间L-乳酸产量/（g/L）2 4 1 0 1 0 2 5.4 3 2 5 0 0 1 1 2 5.3 9 2 6 0 1 0 -1 1 8.5 8 2 7 -1 0 1 0 2 1.0 8 2 8 -1 0 0 1 2 3.8 4 2 9 0 1 -1 0 1 7.5 6 C发酵温度D初始p H值
用Design-Expert 8.0.6软件对表2的结果进行多元回归拟合，得到的回归方程为Y=26.51+0.74A+1.32B+4.5C+2.93D-0.55AB+1.28AC-0.87AD-0.64BC-0.16BD-0.56CD-2.33A2-1.78B2-4.78C2-3.25D2。方差分析结果见表3。
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：*表示显著（P＜0.05）；**表示极显著（P＜0.01）；-表示不显著。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 581.07 14 41.50 73.05 ＜0.000 1 **A 6.62 1 6.62 11.64 0.004 2 **B 20.88 1 20.88 36.75 ＜0.000 1 **C 242.73 1 242.73 427.22 ＜0.000 1 **D 103.31 1 103.31 181.83 ＜0.000 1 **AB 1.21 1 1.21 2.13 0.166 5 -AC 6.50 1 6.50 11.44 0.004 5 **AD 3.01 1 3.01 5.30 0.037 2 *BC 1.64 1 1.64 2.88 0.111 6 -BD 0.099 1 0.099 0.17 0.682 4 -CD 1.27 1 1.27 2.23 0.157 8 -A2 35.33 1 35.33 62.17 ＜0.000 1 **B2 20.64 1 20.64 36.32 ＜0.000 1 **C2 148.12 1 148.12 260.70 ＜0.000 1 **D2 68.56 1 68.56 120.67 ＜0.000 1 **残差 7.95 14 0.57失拟项 7.43 10 0.74 5.72 0.053 7 -纯误差 0.52 4 0.13总和 589.02 28
该模型的决定系数R2=0.986 5，校正决定系数R2Adj=0.973 0，说明试验的实际值和预测值拟合度比较好。由表3可以看出，从对L-乳酸产量的影响来看，一次项A、B、C、D对产L-乳酸的影响均达到极显著水平，影响顺序为C＞D＞B＞A，即发酵温度＞初始pH值＞发酵时间＞接种量。该回归模型P＜0.000 1，表明试验所采取的二次模型极显著，失拟项的P=0.053 7＞0.05，模型失拟项不显著，表明该模型在统计学上是有意义的。模型中 A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2，对 L-乳酸的产量影响极显著（P＜0.01）。AD对L-乳酸的产量影响显著（P＜0.05）。交互项AB、BC、BD、CD 对L-乳酸的产量无显著性影响（P＞0.05）。
2.2.5.2 响应面交互作用分析
通过Design-Expert8.0.6软件，做出两因素之间交互作用的3D响应面曲线图见图6。
图6b曲面倾斜度比较大，且越接近曲面顶端时，颜色愈深，表示变化越急剧，作用越明显，说明相关两因素间交互作用显著。其中图6c曲面变化度尤为明显，说明交互作用显著。而图6adef中曲面的变化相对平缓，说明相关两因素间交互作用不明显。交互效应强弱程度也可从等高线的形状中观察，圆形为交互作用不显著，椭圆则为交互作用显著[20]。
图6 两因素交互作用3D响应面曲线
Fig.6 3D Response surface curve of interaction between factors
a.发酵时间与接种量；b.发酵温度与接种量；c.初始pH值与接种量；d.发酵温度与发酵时间；e.初始pH值与发酵时间；f.初始pH值与发酵温度。
2.2.5.3 产L-乳酸试验的优化与验证
通过Design-Expert8.0.6软件优化后的最佳产L-乳酸的发酵条件：接种量为3.18%，发酵时间为20.49 h，发酵温度为32.91℃，初始pH值为6.19，此时预测L-乳酸产量为28.33 g/L。为方便实际的操作，将发酵条件调整为接种量3%，发酵时间20 h，发酵温度33℃，初始pH 6.2，按此条件进行试验，重复3次取平均值，测得L-乳酸产量为28.17 g/L，与预测值的相对误差为0.56%，说明方程拟合较好，响应面优化得到的发酵参数准确，具有实用价值。
3 结论
从自然发酵酸菜汁中分离得到4株乳酸菌，将其中一株产L-乳酸的菌株编号为LZH-3。通过响应面法对其液体发酵条件进行优化，得出最佳发酵条件：发酵温度为33℃、接种量为3%，初始pH值为6.2，发酵时间为20 h。在此优化条件下L-乳酸产量为28.17 g/L，是优化前的1.25倍。本研究为此乳酸菌大规模工业化生产优质酸菜提供了重要的理论依据。
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