黑色素是一类由酚类或吲哚类化合物经过氧化聚合形成带负电荷的疏水性高分子化合物，颜色通常为暗棕色或者黑色[1]。黑色素普遍存在于自然界中，在微生物、植物和动物体中均能合成并在生物体中发挥重要的生理作用，例如光保护、抗氧化、温度调节、金属螯合以及参与神经系统中的某些功能[2]。此外，黑色素可保护真菌免受高温、低温、干旱、饥饿、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及辐射等环境压力[3]。由于其优异的理化性质，黑色素在生物医学、农业以及食品领域具有广阔的应用前景。例如在生物医学领域黑色素可用于造影剂、光热治疗和药物载体[4-8]，在农业领域黑色素可作为保护剂延长杀菌剂的有效期，在食品领域黑色食品具有抗氧化和抗衰老的功效[9-10]。
目前黑色素的获得途径包括人工合成、动植物提取和微生物发酵。前两种方法均存在局限性，如人工合成色素工艺复杂、成本较高甚至对人体存在一定危害性，而从动植物中提取黑色素成本太高，难以实现黑色素的大规模生产。利用微生物发酵生产色素不仅成本较低，并且可实现机械化、工业化生产[11-13]。研究表明多种微生物均能合成分泌黑色素，胡晟源等[14]从海州湾分离得到一株枝孢菌属真菌CXPF01，该菌所产黑色素对光照不敏感，能保持很好的稳定性。此外，该黑色素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有一定抑制作用，有应用于食品的潜力。姬妍茹等[15]从黑蒜中筛选出一株产黑色素的枯草芽孢杆菌S8nyzx-1。徐静等[16]从海底泥土样品中分离纯化得到一株链霉菌属放线菌。该菌能分泌黑色的色素，经紫外、红外光谱学鉴定为黑色素。
目前有关黑色素微生物发酵的研究较少，本文以本实验室筛选的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）为黑色素生产菌株，通过单因素试验和响应面法对出芽短梗霉产黑色素发酵培养基成分进行优化。
1 材料与方法
1.1 菌种
出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans，CGMCC NO.7055）为北洋百川生物技术有限公司实验室所保藏。
1.2 试剂
蔗糖：广西田东县制糖有限责任公司；葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、KH2PO4：北京奥博星生物技术有限公司；糊精、淀粉：天津博迪化工股份有限公司；酵母粉、牛肉膏、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3、NaCl、CaCl2·2H2O、FeSO4、ZnSO4：维科特化工产品贸易有限公司；玉米浆干粉：北京鸿润宝顺科技有限公司；琼脂粉、盐酸、氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司；MgSO4·7H2O：淄博川北化工有限公司；黑色素标准品：Sigma公司。以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器与设备
高速离心机（TDL-5-A）：上海安亭科学仪器厂；烘箱（101-3ES）：北京永光明医疗器械厂；紫外分光光度计（UV-1200、UV-6100）：上海美普达仪器有限公司；超净工作台（YJ-875）：苏州净化设备厂；pH计（FE20K）、电子分析天平（ML-204）：瑞士梅特勒-托利多集团；5L罐发酵控制系统（GRJB-5D）：镇江格瑞生物工程有限公司。
1.4 培养基的配制
1）马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：新鲜马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，121℃灭菌20 min。
2）种子培养基：葡萄糖60 g/L、土豆汁40 g/L、Mg-SO4·7H2O 0.1g/L、KH2PO40.1 g/L，pH 值自然，121 ℃灭菌20 min。
3）基础发酵培养基：葡萄糖60 g/L、牛肉膏15 g/L、KH2PO40.1 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 值自然，121 ℃灭菌20 min。
1.5 试验方法
1.5.1 发酵培养方法
将保藏于PDA斜面培养基上的出芽短梗霉置于培养箱中25℃下活化2 h，在无菌环境下挑取菌落接种于100 mL种子培养基中，25℃，180 r/min下振荡培养至OD600为0.15，然后以5%比例接种于100 mL发酵培养基中，25℃，180 r/min下振荡培养144 h。
1.5.2 生物量的测定
取10 mL离心管置于65℃烘箱中干燥至恒重，用天平称量记作m1（g），然后将5 mL发酵液置于离心管中，15 000 r/min离心10 min，收集菌体于65℃烘箱中干燥至恒重，记作m2（g）。生物量m（g/L）的计算按如下公式进行。
1.5.3 黑色素的提取
取30 mL发酵液于50 mL离心管中，5 000 r/min离心15 min，将上清液用6 mol/L盐酸调pH值至1.5，室温25℃下静置过夜。85℃水浴1.5 h，加入等体积无水乙醇，搅拌均匀后静置30 min。待黑色的黏稠物析出后，抽滤除去乙醇，将固体置于65℃烘箱中干燥至恒重后称量，之后将固体质量除以取样体积即得到黑色素产量。
1.5.4 黑色素紫外可见光吸收光谱的测定
将适量黑色素提取物及标准品溶解于1 mol/L氢氧化钠溶液中，之后置于UV-6100型紫外分光光度计中，选择光谱扫描模式在190 nm～1 100 nm波长范围内扫描测定吸收光谱。
1.5.5 黑色素ABTS+自由基清除能力
参照Fang等[17]方法对黑色素的ABTS+自由基清除能力进行测定。
1.5.6 黑色素DPPH自由基清除能力
参照Chedekel等[18]方法对黑色素的DPPH自由基清除能力进行测定。
1.5.7 单因素试验优化发酵培养基
在保持基础培养基其它组分不变的基础上，分别对碳源、氮源、无机盐和pH值进行优化以确定最佳培养基成分。具体方法如下：以40 g/L葡萄糖中碳元素含量、15 g/L牛肉膏中氮元素含量为添加标准分别对碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉）、氮源[蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆干粉、（NH4）2SO4、NH4Cl、NH4NO3]、无机盐（K+、Na+、Ca2+、Mg+、Zn2+、Fe2+）和 pH 值（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）进行优化以确定最佳培养基成分。
1.5.8 响应面试验
在单因素试验的基础上，选择蔗糖、玉米浆干粉和CaCl2·2H2O 3个因素为自变量，黑色素产量为响应值，采用Design-Expert 12.0 Box-Behnken设计模型得到三因素三水平的响应面设计，每组试验设置3个重复。各因素水平及编码值如表1。
表1 Box-Behnken设计的因素及水平
Table 1 Factors and their levels in Box-Behnken design
水平 因素A蔗糖/（g/L）B玉米浆干粉/（g/L）C CaCl2·2H2O/（g/L）-1 80 5 1 0 100 10 2 1 120 15 3
1.6 数据处理
采用Design-Expert 12.0软件进行Box-Behnken试验设计和响应面结果分析，用Origin 8.0软件进行数据处理及绘图。
2 结果与讨论
2.1 碳源种类及浓度优化
碳源物质的功能主要是为细胞及其合成产物提供碳架和能量。由于不同微生物体内的酶系不同，因此其对各类碳源物质的偏好和利用程度也不尽相同。以40 g/L葡萄糖中碳元素含量为标准，对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糊精和淀粉5种碳源物质促进黑色素产量的效果进行考察，结果如图1A所示。在确定蔗糖作为碳源后，继续对蔗糖浓度进行优化，结果见图1B。
由图1A可知，在考察的5种碳源物质中，蔗糖对出芽短梗霉黑色素产量的促进作用最显著，黑色素产量达到约9.9 g/L，因此选择蔗糖作为发酵培养基中的碳源物质。在确定蔗糖作为碳源物质后，继续对蔗糖的最适添加量进行了考察。黑色素产量随着蔗糖浓度的增加而逐渐提高，并在蔗糖浓度为100 g/L时达到最高，因此确定蔗糖最适添加量为100 g/L。
图1 碳源种类和碳源浓度对黑色素产量及生物量的影响
Fig.1 Effect of carbon source types and concentration on melanin yield and biomass
2.2 氮源种类及浓度优化
氮源对微生物的生长和产物的积累具有显著影响，一方面氮源可以通过体内代谢途径转化为微生物自身的组成成分，如体内的酶、蛋白和核酸，同时也为产物的合成提供能量和原料。以15 g/L牛肉膏中氮元素含量为添加标准，对蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆干粉、（NH4）2SO4、NH4Cl和 NH4NO3的最适添加量进行考察，结果如图2所示。
图2 氮源种类和氮源浓度对黑色素产量和生物量的影响
Fig.2 Effect of nitrogen source types and concentration on melanin yield and biomass
由图2A可见，无论是生物量还是黑色素产量，有机氮源均明显优于无机氮源，原因可能是有机氮源中除了蛋白质、肽类和氨基酸外，还含有其它的营养因子和成分[19]。在有机氮源中，酵母粉的效果最明显，余下的依次是蛋白胨、玉米浆干粉和牛肉膏。玉米浆干粉来源广泛、价格低廉，适合大规模发酵应用，因此选择玉米浆干粉作为发酵培养基的氮源物质。由图2B可知，当玉米浆干粉浓度为10 g/L时，黑色素产量达到最大值15.34 g/L，因此玉米浆最适浓度选为10 g/L。
2.3 无机盐优化
除了必需的能源和营养物质外，微生物的生长繁殖还需要金属离子和微量元素。金属离子对微生物的生长具有重要作用，除调节渗透压外，某些金属离子还参与构成生物体内的活性物质，例如酶的辅基，或者是作为某些酶的激活剂。对不同金属离子添加量的考察结果如图3所示。
图3 金属离子种类和浓度对黑色素产量和生物量的影响
Fig.3 Effect of metal ion types and concentration on melanin yield and biomass
由图3可知，不同种类金属离子对黑色素产量影响不同。K+、Mg2+和Fe2+对黑色素的产量没有促进作用，而添加了不同浓度的Na+、Ca2+和Zn2+后，黑色素产量均出现了增长，因此选择2.0 g/L NaCl和1.0 g/L ZnSO4添加到发酵培养基中，选择CaCl2·2H2O进行响应面优化。
2.4 培养基pH值优化
发酵液的pH值会影响菌种的生长和繁殖速度，从而影响到发酵产物的合成和积累。对不同pH值下出芽短梗霉黑色素的产量进行了考察，结果如图4所示。
图4 培养基pH值对黑色素产量和生物量的影响
Fig.4 Effect of pH on melanin yield and biomass
由图4可知，在pH3.5时，黑色素产量仅为6.0g/L，在pH 4.5和5.5时，黑色素产量大幅提高，分别达到15.5、16.1 g/L，然而当pH值大于5.5时，黑色素产量随着pH值的升高而逐渐下降。因此选择pH 5.5为发酵培养基最适初始pH值。
2.5 响应面优化结果
根据表1的Box-Behnken试验因素水平设计，得到17组试验，结果如表2所示。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 Box-Behnken design and results
试验号 A蔗糖/（g/L）黑色素产量/（g/L）1 100 10 2 16.26 2 100 5 1 10.39 3 120 15 2 8.23 4 100 15 1 9.07 5 100 10 2 16.48 6 120 10 1 10.59 7 100 10 2 16.54 8 80 10 3 10.49 9 100 10 2 16.62 10 80 5 2 10.26 11 100 10 2 16.62 12 80 15 2 10.35 13 120 5 2 10.98 14 120 10 3 10.35 15 100 5 3 9.87 16 80 10 1 11.86 17 100 15 3 9.76 B玉米浆/（g/L）C CaCl2·2H2O/（g/L）
利用Design-Expert12.0软件进行数据分析，以黑色素产量为响应值进行二次多项回归拟合，得到黑色素对蔗糖（A）、玉米浆（B）和氯化钙（C）的回归模型方程：
对回归模型进行方差分析以检验其显著性，结果如表3所示。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 157.61 9 17.51 80.99 ＜0.000 1极显著A 0.987 0 1 0.987 0 4.56 0.070 0 B 2.09 1 2.09 9.67 0.017 1 显著C 0.259 2 1 0.259 2 1.20 0.309 8 AB 2.02 1 2.02 9.32 0.018 5 显著AC 0.319 2 1 0.319 2 1.48 0.263 7 BC 0.366 0 1 0.366 0 1.69 0.234 4 A2 33.92 1 33.92 156.89＜0.000 1极显著B2 63.66 1 63.66 294.42＜0.000 1极显著C2 38.43 1 38.43 177.71＜0.000 1极显著残差 1.51 7 0.216 2失拟项 0.585 2 3 0.195 1 0.840 3 0.538 5不显著纯误差 0.928 5 4 0.232 1总偏差相关系数校正决定系数159.13 R2=0.990 5 R2Adj=0.978 3 16
由表3所知，模型P＜0.000 1，说明该模型极显著；失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型的拟合性显著；相关系数R2=0.990 5，说明该模型的预测值与实际值的拟合程度较高；R2Adj=0.978 3，说明该模型能解释97.83%的响应值变化。在所有的因素中，对响应值影响显著（P＜0.05）的有 B、AB；影响极显著（P＜0.000 1）的有A2、B2和C2；3个单因素对响应值的影响程度为：B＞A＞C[20-22]。经优化后的发酵培养基为蔗糖98.9 g/L、玉米浆干粉 9.7 g/L、CaCl2·2H2O 2.0 g/L。
2.6 模型验证
在对出芽短梗霉产黑色素培养基配方优化后，本文于5 L发酵罐中对黑色素发酵工艺进行验证，经过144 h发酵，黑色素产量达到17.56 g/L，相比优化之前提高了42.8%，结果如图5所示。
2.7 黑色素理化性质研究
2.7.1 黑色素紫外可见光吸收光谱
出芽短梗霉黑色素的紫外可见光吸收光谱如图6所示。
图5 5 L罐发酵工艺验证
Fig.5 Verification of the fermentation parameters in 5L fermentor
图6 黑色素紫外可见光吸收光谱图
Fig.6 UV-visible absorption of melanin
根据紫外吸收光谱图可知，该黑色素在206 nm处出现最大吸收峰，之后吸光度随波长增大而逐渐减小，在可见光区内没有吸收峰，与Sigma公司的黑色素标准品的紫外吸收光谱进行对比，二者非常吻合。侯若琳[23]等对提取自黑木耳的黑色素进行紫外吸收表征后发现该黑色素在215 nm处紫外吸收最强。宋茹等[24]通过酶解法制备的墨鱼黑色素在220 nm处存在吸收峰。
2.7.2 黑色素抗氧化性
出芽短梗霉黑色素对ABTS+自由基和DPPH自由基的清除结果如图7所示。
图7 黑色素自由基清除效果
Fig.7 Free radicals scavenging effect of melanin
由图7可以看出，0.25 mg/mL的出芽短梗霉黑色素能清除68.59%的ABTS+自由基，当出芽短梗霉黑色素浓度为0.5 mg/mL时对ABTS+自由基的清除率可达到90%以上，1 mg/mL浓度的短梗霉黑色素对ABTS+自由基清除能力相当于0.5 mg/mL的维生素C。相比之下，出芽短梗霉黑色素对DPPH自由基的清除能力稍微弱一点，0.25 mg/mL的黑色素仅能清除18.36%的DPPH自由基，2 mg/mL的黑色素DPPH清除能力相当于0.5 mg/mL的维生素C。由此可知，出芽短梗霉黑色素具有较强的抗氧化能力。
3 结论
本文以出芽短梗霉为生产菌株发酵生产黑色素的工艺，通过单因素和响应面试验对碳源、氮源和无机盐等培养基组分进行了优化，得到最优发酵培养基：蔗糖 98.9 g/L、玉米浆 9.7 g/L、CaCl2·2H2O 2.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、ZnSO41.0 g/L，pH 5.5。在此优化条件下黑色素产量为17.56 g/L，相比优化之前提高了42.8%。本文的研究对黑色素的微生物发酵生产和应用具有借鉴意义。
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