枸杞子是茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果实，夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干或晾至皮皱后晒干，最后除去果梗。自古以来，枸杞一直广泛分布全国各地，主产于宁夏、甘肃、青海、新疆等西北省份的沙区附近，东北省区也有分布。目前在中国境内生长的枸杞就有多达10个品种，其中中国枸杞属种质资源的原始品种有7种，另外还出现了3个变种[1-3]。自明清后，宁夏中宁枸杞质优成为业内共识，在此基础上，以宁夏枸杞子为道地药材，并结合果实本身的性状（果实的大小、形状、色泽、气味等）进行评价，为制定枸杞子商品规格等级标准提供了依据。由于我国枸杞资源分布广泛、种类繁多，因此需要有准确、便捷地鉴别枸杞道地性的技术，以确保枸杞种植者和消费者的利益。
目前已有一些文献报道采用基于凝胶电泳和质谱技术对某些植物的蛋白组学进行研究，从而解析其属性差异。华愉教等[4]使用iTRAQ定量蛋白质组学技术对江苏句容白龙地及福建柘荣、安徽宣州、贵州施秉种植基地的太子参之间的差异蛋白质进行了对比，为解析不同产地太子参次生代谢物差异的成因及其药材品质形成的蛋白质机制提供了参考；Wang Y等[5]对水稻的愈伤组织、叶片、根、芽分生组织、幼穗和成熟穗进行了磷酸化蛋白的定量蛋白质组学研究，研究范围几乎覆盖了所有的磷酸化蛋白；王溢[6]使用非标记定量（label-free）蛋白质组学技术对青杨3个不同的叶位进行比较蛋白质组学的分析，共检测到111个差异表达蛋白质，说明了青杨叶片成熟到衰老是受蛋白质表达变化有序调控的过程。但使用蛋白质组学研究枸杞干果的案例较少。本文以lable-free技术作为蛋白质组学的检测手段，对宁夏中宁和青海格尔木两个产地的枸杞干果样品进行蛋白质组学的分析。lable-free技术全称为“非标记定量蛋白质组学技术”，该技术的特点是：无需对样本蛋白质添加标记；对各种蛋白质的丰度变化敏感；对低丰度肽段的识别能力强。通过对比两产地样品之间的差异蛋白质，为鉴别宁杞一号的产地提供了一些科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 材料
枸杞干果：品种为宁杞一号，采自宁夏中宁、青海格尔木。
1.1.2 主要试剂及产品来源
甘油（分析纯）、溴酚蓝（分析纯）、牛血清白蛋白（分析纯，≥98.0%）：上海生工生物工程公司；十二烷基硫酸钠（电泳级，≥98.0%）、尿素（电泳级，≥99.0%）、二硫苏糖醇（电泳级，≥99.4%）、碘乙酰胺（电泳级，≥98.0%）：Bio-Rad公司；三羟甲基氨基甲烷（分析纯，≥99.0%）、NH4HCO3（最优生化级，≥99.5%）、三氟乙酸（色谱级，≥99.0%）、甲酸（色谱纯，≥98%）：Sigma公司；KH2PO（4分析纯，≥99.5%）、KC（l分析纯，≥99.5%）、HC（l分析纯，36.0%～38.0%）：国药集团化学试剂有限公司；BCAn kit定量试剂盒：碧云天生物技术有限公司；胰蛋白酶（色谱纯）：北京普洛麦格生物技术有限公司；乙腈（色谱纯，≥99.9%）：德国默克有限公司；液氮：天津昊瑞气体销售有限公司。
1.1.3 仪器和设备
Easy nLC色谱系统、Q Exactive质谱仪、Multiskcan FC酶标仪：赛默飞世尔科技公司；AKTA Purifier 100蛋白纯化仪、EPS601电泳仪：通用电气医疗集团；5430R低温高速离心机、Concentrator Plus真空离心浓缩仪：艾本德（上海）国际贸易有限公司；MP Fastprep-24匀浆仪：安诺伦（北京）生物科技有限公司；JY92-II超声破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；GNP-9080恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；QT-1 Votex振荡器：上海琪特分析仪器有限公司；AL104电子天平：梅特勒托利多集团。
1.2 方法
1.2.1 样品蛋白质的提取
参考Gabriella等[7]的方法，使用三氯乙酸-丙酮混合液沉淀后加十二烷基硫酸钠裂解液，该方法能有效提取枸杞干果中的蛋白质。
1.2.2 样品蛋白质的定量
采用二辛可宁酸（bicin choninic acid，BCA）法[8]对滤液进行蛋白质定量。用BSA配制浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准品；按体积比50∶1（A液∶B液）配制适量BCA工作液，充分混匀，BCA工作液室温24℃稳定24 h。（1）将标准品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL；（2）加20 μL样品到96孔板的样品孔中；（3）各孔加入200 μLBCA工作液，37℃放置20 min～30 min。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深；（4）用酶标仪测定A562或A540～A595之间的其它波长的吸光度；（5）根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度，分装样品后于-80℃条件下保存。
1.2.3 样品蛋白质的酶解
用超滤管酶解法（filter-aided sample preparation，FASP）酶解蛋白质样品[9-10]，先用胰蛋白酶将样品蛋白质分解为肽段，再用C18固相萃取小柱对肽段进行脱盐，加入0.1%甲酸、5%乙腈水溶液洗脱复溶，最后检测肽段的OD280进行定量。
1.2.4 液相色谱（liquid chromatography，LC）分析
根据BCA定量和肽段定量得到的酶解液浓度，取0.1%甲酸复溶至0.5 μg/μL的样品肽段裂解液进入Easy nLC液相色谱系统上样，该系统可以通过二级串联液相色谱技术实现以纳升级别的流速对样品进行分离。具体液相条件参考向伟等[11]的方法。
1.2.5 质谱（mass spectrometry，MS）分析
使用Q-Exactive质谱仪和液相色谱系统串联进行样品质谱分析，质谱条件的设定参考向伟等[11]的方法。
1.2.6 Maxquant非标记分析
将样品蛋白质的LC-MS原始数据导入Maxquant软件（版本号1.5.3.17），对检测到的蛋白质进行数据库匹配[12]，对两产地样品蛋白质的数据进行鉴定和相对表达量的比较。本研究使用的Lable-free定量算法的原理为：以一级质谱（MS1）为基础，将质谱数据转化成以色谱保留时间和质荷比（m/z）为变量的二维图谱，在该二维图谱的基础上再增加MS1中的肽段强度变量，从而将最原始的质谱数据转换成形象的三维图谱，最后利用Maxquant解析这些肽段的定量信息，从而获得对应蛋白质的相对定量比值[13-14]，而MS1中肽段的鉴别是通过Maxquant软件集成的搜索引擎Andromeda对二级质谱（MS2）的检测结果进行数据库检索实现的。Maxquant软件的蛋白质数据库检索参数如表1所示。
表1 Maxquant软件的蛋白质数据库检索参数
Table 1 Parameters of protein database search with maxquant software
项目仪器设备酶解方式修饰匹配识别参数名称设备型号一级质谱离子容差预检索一级质谱离子容差水解酶允许漏切位点数固定修饰可变修饰数据库设定值Orbitrap 6 ppm 20 ppm胰蛋白酶2 Carbamidomethyl(C)Oxidation(M)uniprot_solanoideae_288620_20190318.fasta Reverse是蛋白质定量数据库检索模式是否加载污染蛋白质序列的数据库肽段的可信筛选标准蛋白质的可信筛选标准对齐窗口时间用于蛋白质定量的肽段蛋白质定量算法用于蛋白质定量分析的最少肽段谱图数≤0.01≤0.01 2min unique+razor非标记定量算法1
1.2.7 差异蛋白质的筛选
以宁夏中宁产区的宁杞一号为对照样品，将青海格尔木产区的宁杞一号非标记定量数据非标记定量法（label-free quantification，LFQ）与其对比，将一组样品中两次及以上不为空值，另一组所有数值均为空值的蛋白直接作为差异蛋白，其它两地样品均含有差异蛋白质筛选的条件为：P值小于0.05，上下调差异倍数2倍以上，如果上下调差异倍数小于2倍则认为该蛋白质表达量无差异。
1.2.8 差异蛋白质的层次聚类分析
先根据定量信息计算两产地枸杞样本之间的蛋白质差异表达倍数（格尔木/中宁）；然后通过显著性检验计算两产地样本蛋白质表达量之间的P值；取蛋白质差异表达倍数的log2Fold Change值为横坐标，取两产地样本间P值的-log10P值为纵坐标，通过这两个维度进行作图；最后将分析结果以火山图的方式展现。
1.2.9 通过信息生物学分析差异蛋白质
采用 GO 数据库（http：//www.geneontology.org/）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路数据库（http：//www.genome.ad.jp/kegg/）对差异蛋白进行 GO功能注释和参与的代谢通路分析，获得差异蛋白质的生物功能、参与的生物过程以及细胞定位等信息。
2 结果与分析
2.1 差异蛋白质的筛选
差异蛋白质的检测结果见表2。
表2 差异蛋白质的检测结果
Table 2 Differential protein detection results
样本 蛋白质个数中宁 1 9 4 2格尔木 2 0 6 5总计 2 4 7 7
如表2所示，在两组样品中共检测到2 477种蛋白质，中宁产区的样品中共检测到1 942种蛋白质，格尔木产区的样品中共检测到2 065种蛋白质。其中，中宁产区的样品特有的蛋白质有174种，格尔木产区的样品特有的蛋白质有297种，两产地样品共有的蛋白质有1 768种。中宁产区样品的表达量超过格尔木产区样品的蛋白质有69种，中宁产区样品的表达量低于格尔木产区的蛋白质有86种。
2.2 蛋白质表达量的火山图
通过火山图对两产地样品的蛋白质表达量进行分析，结果如图1所示。
图1 火山图
Fig.1 Volcano plot
图1中“倒三角”的图标表示的是表达量有显著上调的蛋白质（格尔木/中宁），“菱形”的图标表示的是表达量有显著下调的蛋白质（格尔木/中宁），每个表示蛋白质的点横、纵坐标的离散程度越大说明蛋白质的差异表达越明显。从图1中的分类结果可以看出，中宁产区和格尔木产区两地枸杞样品的组间差异明显，具备进行更深层次的生物信息学分析的条件。
2.3 差异蛋白功能注释与分类
对差异蛋白质进行GO分析，采用Blast2GO软件对筛选出的差异表达蛋白质的功能进行注释和分类，分为生物过程、分子功能和细胞组分3部分，分析结果如图2所示。图中条形图后面的数字为该条目的富集因子。
图2 差异蛋白质的GO分析
Fig.2 GO analysis of differentially expressed proteins
由GO分析的结果可知，宁夏中宁样品和青海格尔木样品的差异蛋白质主要集中在以下3个方面：（1）生物过程：细胞或亚细胞成分的运动、基于微管的运动、铁离子转运、蛋白质稳定性、过渡金属离子转运、蛋白质稳定性的调节、氨基糖代谢过程、细胞壁大分子分解过程；（2）分子功能：铁离子结合、作用于配对供体的氧化还原酶活性、单加氧酶活性、金属离子氧化还原酶活性、氧为受体的金属离子氧化还原酶活性、铁氧化酶活性；（3）细胞成分：细胞质的核周区域、光合膜、细胞表面、类囊体组分、类囊体膜、类囊体。
2.4 差异蛋白质KEGG分析
对这些差异蛋白质进行KEGG代谢途径富集分析，排除动物、细菌等与植物无关的代谢途径，结果如图3所示。图中条形图后面的数字为该条目的富集因子。
由图3可知，这些代谢途径包括：矿物质吸收途径和植物的丝裂原活化蛋白激酶信号途径、植物-病原体相互作用、磷脂酰肌醇信号系统、植物激素信号转导、肌醇磷酸代谢、卟啉和叶绿素代谢。
综和以上试验结果，根据差异蛋白的表达量、分子功能、代谢通路的生物信息学分析结果，筛选出28个目标差异蛋白，见表3。
与中宁产区的样品相比，格尔木产区样品的3种不同类型的铁蛋白Ferritin的表达量都是上调的或者只在格尔木产区样品中检测到。铁蛋白Ferritin在自然界的动物、植物、微生物等生命体中都普遍存在，它能够起到贮存Fe元素和生物矿化蛋白的作用。经李红英等[15]测定格尔木产区枸杞的Fe元素含量是110.6 μg/g，中宁产区枸杞的Fe元素含量是78.82 μg/g；任永丽等[16]测定格尔木产区枸杞的Fe元素含量是110.60 μg/g，中宁产区枸杞的Fe元素含量是78.71 μg/g，两篇文献的数据基本一致，且和蛋白质组学KEGG代谢途径的分析结果基本符合，即中宁产区枸杞比格尔木产区枸杞含Fe量低。
图3 KEGG的分析结果
Fig.3 KEGG analysis results
与中宁产区的样品相比较，ATX1铜伴侣蛋白在格尔木产区样品中的表达量是下调的。ATX1是一种有优异螯合活性的在胞内作用的一价铜离子Cu+金属伴侣蛋白[17-19]，并且其后续代谢途径有利于铜离子更快排出植物体外。李红英等[15]的试验结果表明中宁产区枸杞的Cu元素含量是17.55 μg/g，格尔木产区枸杞的Cu元素含量是24.08 μg/g；任永丽等[16]的试验结果是中宁产区枸杞的Cu元素含量是17.45 μg/g，格尔木产区枸杞的Cu元素含量是24.01 μg/g，两篇文献的数据十分接近，且与蛋白质组学的分析推断一致。
表3 差异蛋白质列表
Table 3 Differential protein list
LFQ比值（格尔木：中宁）金属离子转运蛋白分类 登录号 蛋白质名称 覆盖度/%唯一肽段数分子量/kDa A0A0V0HI46 Ferritin 32.2 6 28.109 7.24 A0A2G2Z8H9 Ferritin 12 1 20.917 仅格尔木检出A7UGG8 Ferritin 11.8 1 29.433 2.26 A0A1U8EX56 Copper transport protein ATX1-like 37.6 3 11.568 仅中宁检出热休克蛋白 K4BEL1 Hsp90A htpG 25.2 0 80.27 0.42 A0A2G2WIQ6 Heat shock protein 90-1 28.5 0 80.304 0.43 Q6UJX4 Molecular chaperone Hsp90-1 31.8 0 80.158 0.44 A0A1U8HH57 Heat shock protein 90-6，mitochondrial 10 2 90.458 仅格尔木检出K4BXN9 Hsp90B，TRA1 18.6 1 89.727 仅格尔木检出Q53Z32 Molecular chaperone Hsp90-2 35.1 1 80.135 仅格尔木检出几丁质酶 Q05538 Basic 30 kDa endochitinase 9.9 1 34.345 3.61 O81144 Class I chitinase 4.3 1 35.419 仅格尔木检出Q84LQ7 29 kDa Chitinase-like thermal hysteresis protein（Fragment） 7.1 1 28.845 仅格尔木检出核糖核苷二磷酸激酶 A0A2G3C9Y4 Nucleoside diphosphate kinase 22.4 3 24.962 0.46过氧化氢酶 Q6T2D5 Catalase（Fragment） 15.8 1 54.942 2.51 Q6RFS8 Catalase 32.3 0 56.438 0.41磷酸肌醇转化酶A0A1U8DY09 Triosephosphate isomerase，chloroplastic 14.2 1 33.797 3.61 A0A2G2WMD3 Inositol-1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase 3.1 1 36.401 2.69 M1CP96 INO1，ISYNA1 Myo-inositol-1-phosphate synthase 10.2 4 56.339 0.25 M0ZU90 Inositol-1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase 3 1 38.19 仅中宁检出植物激素调节 M1AK55 BSK BR-signaling kinase 4.5 2 54.732 3.10 A0A2G3CCE8 Histidine-containing phosphotransfer protein 1 7.2 1 17.478 仅中宁检出M1AD54 Two-component response regulator 1.9 1 75.438 仅中宁检出卟啉叶绿素 V5K6L1 Pheophorbide A oxygenase 6.9 1 60.79 0.38 M1BMY7 Red chlorophyll catabolite reductase 9.9 2 30.939 仅格尔木检出M1CGY9 Frataxin 11.3 2 21.712 仅格尔木检出A0A1U8H3Z2 Uroporphyrinogen decarboxylase 7.8 2 38.542 仅格尔木检出M1AAS7 Magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester（oxidative）cyclase 6.9 2 47.204 仅格尔木检出
在6个热休克蛋白中，Hsp90A、Heat shock protein 90-1、Molecular chaperone Hsp90-1在中宁样品中的表达量较高，而 Heat shock protein 90-6、Hsp90B、Molecular chaperone Hsp90-2则只在格尔木样品中检测到。Hsp90系列的热休克蛋白是一种分子伴侣，能够起到稳定和保护激酶、类固醇等底物蛋白质的作用[20-21]。从枸杞的生长条件来看，中宁产区和格尔木产区的温度、土壤条件、对植物有危害的病原体等外界条件的差别，会造成两产地枸杞的热休克蛋白表达量存在差异。
3个几丁质酶中，30 kDa内切壳多糖酶在格尔木样品中的表达量与中宁样品相比是上调的；类几丁质酶（Class I chitinase）、29 kDa几丁质类热滞蛋白（片段）是只在格尔木样品中检测到的。几丁质酶在植物中能起到抗冻、抗病虫害的作用[22]。
核糖核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase）在中宁样品中的表达量高于格尔木样品。该酶是植物实现对病原体免疫的MAPK信号途径的关键酶，它能促使防卫蛋白基因表达[23]。
过氧化氢酶CAT2在中宁样品中的表达量高于格尔木样品，部分过氧化氢酶的片段在中宁样品中的表达量低于格尔木样品。过氧化氢酶的作用是清除植物体内过多的过氧化氢[24]。
与磷酸肌醇代谢途径和磷脂酰肌醇信号系统有关的4个差异蛋白质中，磷酸丙糖异构酶（叶绿体）（Triosephosphate isomerase，chloroplastic） 在中宁样品中的表达量比格尔木样品高；两种不同的1，3，4-三磷酸肌醇 5/6-激酶（Inositol-1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase，ITPK），登录号为A0A2G2WMD3在格尔木产区样品中的表达量较高，而登录号为M0ZU90的磷酸激酶仅在中宁样品中检出；肌醇-1-磷酸合成酶（Myo-inositol-1-phosphate synthase）在中宁样品中的表达量高于格尔木样品。
在3种植物激素调节酶中，油菜素内酯信号激酶（BSK BR-signaling kinase）在中宁样品中的表达量高于格尔木样品，油菜素内酯是一种重要的植物激素，在调节细胞增殖和形态生长、植物体的顶端优势、叶片和叶绿体程序性衰亡等生命活动中起关键作用，同时也与植物的抗逆性有关[25-26]；组氨酸磷酸转移蛋白1（Histidine-containing phosphotransfer protein 1）和双组分响应调节器（Two-component response regulator）是只在中宁产区样品中检测到的蛋白质。
在卟啉和叶绿素代谢途径中，脱镁叶绿酸加氧酶（pheophorbide A oxygenase，PAO）是下调蛋白质；红叶绿素分解代谢物还原酶（Red chlorophyll catabolite reductase）、线粒体型共济失调蛋白抗体（Frataxin）、尿卟啉原脱羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase）、镁-原卟啉IX单甲酯（氧化）环化酶[Magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester（oxidative）cyclase]是只在格尔木样品中检出的蛋白质。从卟啉和叶绿素代谢途径相关的差异蛋白来看，中宁产地和格尔木产地的枸杞在叶绿素的合成和代谢能力上存在差别。
3 结论
本文通过lable-free技术对中宁和格尔木两产区的宁杞一号枸杞果实进行了蛋白质组学的分析，检测到了两产地枸杞果实中的差异蛋白质。通过对两产区枸杞果实的差异蛋白质进行生物信息学分析得出结论：从金属离子转运蛋白的角度证实了中宁产区的样品Fe、Cu两种元素的含量均明显低于格尔木产区的样品，可以通过大量检测两地样本积累数据得出利用金属元素含量判断宁杞一号干果产地的标准；对热休克蛋白、几丁质酶、核糖核苷二磷酸激酶和过氧化氢酶的分析说明了两产地宁杞一号的蛋白质表达差异在很大程度上是由于两产地不同的气候、土壤坏境以及对植物有害的病原体所引起的；油菜素内酯信号激酶的表达量差异会引起两产地枸杞干果的形态学差异，推测可以通过机器视觉技术实现两产地宁杞一号干果的鉴别；卟啉和叶绿素代谢途径中的蛋白质差异说明两产地枸杞果实中的色素含量存在差别。由于目前对磷酸肌醇转化酶和高等植物双组分调节机制的研究还不够深入，很难在这两个方面解释两产地枸杞样品的差异。本研究可为鉴别不同产地宁杞一号枸杞果实提供蛋白质组学水平的科学依据。
[1]杨辉，周旋，王学琴，等.枸杞种质遗传多样性SCoT分析[J].北方园艺，2017，41(2)：95-98.
[2]林丽，晋玲，李晓瑾，等.黑河流域中下游黑果枸杞资源调查及保护利用[J].中国中药杂志，2017，42(22)：4419-4425.
[3]宋亮，李建颖，王佳.超声辅助提取野生与人工栽培黑果枸杞花色苷含量研究[J].天然产物研究与开发，2018，30(6)：1002-1008，1060.
[4]华愉教，王胜男，邹立思，等.不同产地太子参的iTRAQ定量蛋白质组学研究[J].质谱学报，2016，33(3)：236-246.
[5]Wang Y F，Tong X H，Qiu J H，et al.A phosphoproteomic landscape of rice(Oryza sativa)tissues[J].Physiologia Plantarum，2017，160(4)：458-475.
[6]王溢.基于label-free技术的青杨3个叶位叶片比较蛋白质组学分析[J].华中农业大学学报，2019，38(4)：8-19.
[7]Abdallah M，Trupiano D，Youssef N，et al.An efficient method for olive leaves proteins extraction and two-dimensional electrophoresis[J].The Natural Products Journal，2017，7(1)：12-17.
[8]Jiang Q，Li Q W，Han J M，et al.rLj-RGD3 induces apoptosis via the mitochondrial-dependent pathway and inhibits adhesion，migration and invasion of human HeyA8 cells via FAK pathway[J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，96：652-668.
[9]Coleman O，Henry M，Clynes M，et al.Filter-aided sample preparation(FASP)for improved proteome analysis of recombinant Chinese hamster ovary cells[M]//Methods in Molecular Biology.New York：Springer New York，2017：187-194.
[10]Wisniewski J R.Label-free quantitative analysis of mitochondrial proteomes using the multienzyme digestion-filter aided sample preparation(MED-FASP)and“total protein approach”[M]//Methods in Molecular Biology.New York：Springer New York，2017：69-77.
[11]向伟.胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药机制的亚细胞蛋白质组学研究[D].广州：南方医科大学，2016.
[12]Salunkhe V，de Cuyper I M，Papadopoulos P，et al.A comprehensive proteomics study on platelet concentrates：Platelet proteome，storage time and Mirasol pathogen reduction technology[J].Platelets，2019，30(3)：368-379.
[13]Cox J，Hein M Y，Luber C A，et al.Accurate proteome-wide labelfree quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction，termed MaxLFQ[J].Molecular & Cellular Proteomics，2014，13(9)：2513-2526.
[14]Navarro P，Kuharev J，Gillet L C，et al.A multicenter study benchmarks software tools for label-free proteome quantification[J].Nature Biotechnology，2016，34(11)：1130-1136.
[15]李红英，彭励，王林.不同产地枸杞中微量元素和黄酮含量的比较[J].微量元素与健康研究，2007，24(5)：14-16.
[16]任永丽，董海峰.青海和宁夏枸杞子中微量元素的对应聚类分析[J].安徽农业科学，2012，40(31)：15119-15120，15143.
[17]Xu F，Kuo T，Rosli Y，et al.Trithorax group proteins act together with a polycomb group protein to maintain chromatin integrity for epigenetic silencing during seed germination in Arabidopsis[J].Molecular Plant，2018，11(5)：659-677.
[18]Shin L J，Yeh K C.Overexpression of ArabidopsisATX1retards plant growth under severe copper deficiency[J].Plant Signaling & Behavior，2012，7(9)：1082-1083.
[19]Li W B，Lacey R F，Ye Y J，et al.Triplin，a small molecule，reveals copper ion transport in ethylene signaling from ATX1 to RAN1[J].PLoS Genetics，2017，13(4)：e1006703.
[20]胡艳平，蔡兴来，周曼，等.水芹HSP90基因的原核表达及条件优化[J].分子植物育种，2019，17(9)：2886-2891.
[21]Kozeko L Y.The role of HSP90 chaperones in stability and plasticity of ontogenesis of plants under normal and stressful conditions(Arabidopsis thaliana)[J].Cytology and Genetics，2019，53(2)：143-161.
[22]Jashni M K，Mehrabi R，Collemare J，et al.The battle in the apoplast：further insights into the roles of proteases and their inhibitors in plant-pathogen interactions[J].Frontiers in Plant Science，2015，6：584.
[23]Asai T，Tena G，Plotnikova J，et al.MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity[J].Nature，2002(415)：977-983.
[24]Su T，Wang P P，Li H J，et al.The Arabidopsis catalase triple mutant reveals important roles of catalases and peroxisome-derived signaling in plant development[J].Journal of Integrative Plant Biology，2018，60(7)：591-607.
[25]Watanabe B，Yamamoto S，Yokoi T，et al.Brassinolide-like activity of castasterone analogs with varied side chains against rice Lamina inclination[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry，2017，25(17)：4566-4578.
[26]Otie V，Ping A，Eneji E.Interactive effect of brassinolide and lime on growth and yield of maize(Zea mays L.)on acid soils of South-East Nigeria[J].Communications in Soil Science and Plant Analysis，2018，49(22)：2918-2931.