黄曲霉毒素（aflatoxins，AF）是所有天然物质中毒性最强，且是目前世界范围内公认的致癌性最强的真菌类毒素[1]。根据联合国粮农组织的分析估计，每年在全世界的谷物中，至少有四分之一受到了AF污染。目前鉴定出的AF有10多种，受污染的食品中主要检测的项目以黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最为常见，动物体摄入AFB1后，经过体内代谢转化可产生黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、黄曲霉毒素M2（aflatoxin M2，AFM2）这两种代谢产物，会存在于乳液、蛋类、血液、肝脏、肌肉等可食用组织中[2]。其中以乳制品残留情况最为突出。随着世界各国对黄曲霉毒素检测限量标准要求的不断提高，迫切需要研发适合我国快速筛查、精确测定的检测手段。目前市面上快速检测黄曲霉毒素的方法存在灵敏度较低、变异较大、添加回收不稳定、假阳性等问题，检测的方法步骤还有待优化。本试验通过饲料、豆粕、玉米面、调料制品、食用油、调制乳、猪肉、牛肉、火腿肠等为检测样品，研究改进后的酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测黄曲霉毒素的方法是否具有可行性。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
康宁96孔酶标板（8孔/条×12条）、盖板膜、辣根过氧化物酶试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；AFB1高浓度标准品：北京中科质检生物技术有限公司；酶标二抗、抗原（antigen，Ag）、抗体（antibody，Ab）：维德维康生物技术有限公司；底物A、B液、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸二氢钠、乙酸乙酯、四甲基联苯胺、二甲基亚枫（分析纯）：国药集团有限公司。各类待检样本、脱脂奶粉：市售。
1.2 仪器与设备
TTL-DC氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；Multiskan-FC酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司；Thermo-Fisher落地式高速冷冻离心机：Thermo Electron公司；LPD2500多管漩涡混合仪：莱普特科学仪器有限公司；SH-2（A）SH微孔板脱水仪：北京双和盛源科技发展中心；KF-806L有机相去除器：上海共济科华实验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄曲霉毒素抗原、抗体的制备
抗原的制备过程：小分子物质AFB1本身无活性基团，没有免疫原性，需要通过引入羧基，采用活性酯法，与蛋白质的氨基偶联成完全抗原AFB1。
抗体制备过程：用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将冷冻干燥后的抗原（AFB1）以液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）分别溶解，充分乳化注射免疫小鼠，10 d后从眼眶取血，样本进行静置、凝固、离心等操作后取上层血清。选择阴性血清吸光度OD值接近0，经过检测效价可以达到较高的水平。抗体的效价越高则表明质量越好[4]。
1.3.2 抗原的包被与封闭
采取方阵法，使用96孔康宁酶标版，根据测定的OD值选择出抗原的饱和浓度。根据OD值在1.0左右时所对应的抗体稀释倍数，作为最佳的稀释倍数[5]。
在包被液中加入最佳抗原浓度包被酶标板，稀释5×103倍，磁力搅拌 1 h，静置 30 min，湿度 30%，温度25℃，在每个酶标板孔中加入120 μL含有抗原的包被液，盖上盖板膜，4℃的环境下放置20 h，甩去包被液，洗涤两次，30 s/次，放入脱水仪中甩干。采用与包被时相同的加液方式，每孔加入240 μL含有牛血清蛋白的封闭液，轻轻振荡10 s，盖上盖板膜，放置在37℃的电热恒温培养箱中，温育1.5 h，甩出封闭液，洗涤1次，振荡10 s，静置1 min，在脱水仪中甩干，37℃干燥4 h，真空密封酶标板。
1.3.3 标准溶液的制备
用AFB1标准品缓冲液稀释浓度为10 μg/mL的高浓度标准品基准溶液[6]，配制浓度分别为0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 μg/L 的标准品梯度溶液，在酶标板中滴加反应，以空白对照，测定时标准品梯度溶液为每孔50 μL，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制标准曲线。得出抑制率（y）与浓度（x）的线性方程为y=-18.059lnx+16.355，相关系数 R2=0.991 26，拐点数为2，最低检测浓度为0.03 μg/L，线性系数范围0.03 μg/L～2.43 μg/L，IC50为 0.084 μg/L。
1.3.4 抗体与酶标二抗的准备
将抗体用专用稀释液稀释2×105倍，振荡5 min，25℃静置1 h后放置4℃保存。在酶标二抗的棕色玻璃瓶中依次加入1.2 mL超纯水和0.8 mL丙三醇溶剂。将酶标二抗专用酶稀释液稀释850倍，配制成酶标二抗工作液，4℃放置保存。检测时酶标二抗和抗体的添加量均为 50 μL。
1.3.5 样品前处理
本试验通过对饲料、豆粕、玉米面、调料制品、食用油、调制乳、猪肉、牛肉、火腿肠等样品进行检测，根据不同稀释倍数，称取一定量均质后的样品于离心管中，添加高标作阴性、阳性对照，加入样本提取液，进行涡动和离心（2 500 r/min转速下涡动60 s、4 700 r/min离心5 min）后具体操作步骤如下[7-8]。
饲料、豆粕、玉米面：样品稀释30倍。准确称取1 g均质后的样本于50 mL离心管中，每个管加入5 mL样本提取液，进行涡动和离心，取出分层的试样，吸取上层清液100 μL，加入到新的2 mL离心管中，然后用移液枪将每个小管加入400 μL超纯水，2 000 r/min涡动40 s，取 50 μL 进行点板检测。
食用油类：样品稀释30倍。取0.1mL食用油样品置入4 mL离心管里，每个管中加入1 mL正己烷和1 mL的样品稀释液，涡动和离心后去除分层试剂，用有机相去除器吸掉分层后的上层正己烷以及中间的杂质，取50 μL进行项目检测。
调料制品：样品稀释30倍。称取1 g的样品置入离心管中，加入5 mL乙腈后涡动离心，分层后取出100 μL上层清液，加入到新的2 mL离心管中，加正己烷1 mL，再加入400 μL的超纯水，之后进行同样的涡动操作和离心。分层液用去除器吸掉分层后的上层和中间层杂质，取50 μL进行项目检测。
调制乳：样品稀释2倍。每管取2 mL样品，加入相应的高浓度标准品作添加回收，按照顺序加入0.4 mL的ZnSO4溶液与6 mL乙酸乙酯与二氯甲烷的混合液，涡动和离心后取上层液1.5 mL到新的4 mL离心管中（使用氮吹仪在60℃水浴中吹干离心管），之后加2 mL正己烷和1 mL样品稀释液，充分高速涡动40 s，同样离心5 min。除去中间层以上的物质，移液枪吸取50 μL 点板检测。
1.3.6 洗板与显色终止
待标准品或样本反应30 min后将酶标板中的反应液甩掉，每孔添加量为260 μL洗涤液，静置20 s洗涤3次。洗涤完成后甩干酶标板，每孔添加量为100 μL底物A、B液和氧化剂的混合液，显色10 min～15 min呈现出蓝色后加入50 μL终止液迅速变黄色，立刻在双波长为450 nm和630 nm的酶标仪上进行检测分析。
2 结果与分析
2.1 抗原不同包被时间对检测结果的影响
在 4 ℃温度下分别包被抗原 10、15、20、25、30 h，添加配制好的标准品、抗体工作液、酶标二抗各50 μL，反应时间为30 min，底物显色15 min。检测结果见表1和图1所示。
表1 抗原不同包被时间检测结果
Table 1 Detection datas under different packet time
Ag包被时间（4℃）/h曲线参数IC50/（μg/L）线性系数拐点数OD值抑制率/%10 15 20 25 30 0.073 0.081 0.108 0.103 0.084 0.989 8 0.981 6 0.996 1 0.993 7 0.987 9 2 3 2 3 2 1.821 1.929 2.189 2.182 2.013 73.4 77.8 82.7 81.4 71.9
图1 包被不同时间对抑制率及线性系数的影响
Fig.1 Effect of coating time on inhibition rate and linear coefficient
由表1和图1可以得出，抗原4℃下包被的最佳包被时间为20 h，此时，抑制率达到82.7%，线性系数为 0.996 1，IC50浓度达到 0.108 μg/L，OD 值达到2.189。
2.2 不同反应温度对检测结果的影响
待酶标板恢复至室温（25℃）后添加样本、抗体工作液、酶标二抗各 50 μL，分别在 16、20、24、28、32 ℃下进行反应30 min，显色15 min之后添加终止液，在酶标仪上采用双波长检测分析，结果如表2和图2所示。
表2 不同反应温度的检测结果
Table 2 Detection datas under different reaction temperatures
反应温度/℃曲线参数IC50/（μg/L）线性系数变异值/%OD值抑制率/%16 20 24 28 32 0.083 0.078 0.072 0.076 0.084 0.988 9 0.976 1 0.992 7 0.991 2 0.989 6 3.5 2.3 1.5 2.1 4.3 0.664 0.893 1.120 1.023 0.928 73.4 74.8 76.4 75.3 71.9
图2 不同反应温度对抑制率及线性系数的影响
Fig.2 Effect of different reaction temperature on inhibition rate and linear coefficient
由表2、图2看出，随着温度升高，曲线OD值先升高后下降，但IC50较为稳定，抑制率会有10%以内的浮动，变异值均在5.0%以内。最佳反应温度为24℃，此时抑制率为76.4%，OD值1.120，线性系数为0.992 7，IC50为 0.072 μg/L。
2.3 酶标二抗作用时间对检测结果的影响
在酶标板中添加样本、抗体工作液、酶标二抗各50 μL，设置不同酶标抗体作用时间 15、20、25、30、35、40 min，之后加入底物显色，室温（25℃）下分别检测分析，结果见表3和图3。
表3 酶标二抗不同作用时间的检测结果
Table 3 The results of enzyme mark II anti-action in different time
作用时间/m i n 系数 O D值 拐点数 变异值/%1 5 0.0 7 9 6 8.7 0.9 8 4 9 1.8 0 9 2 3.2 2 0 0.1 1 9 7 7.1 0.9 8 5 3 1.7 8 3 3 2.7 2 5 0.0 9 5 7 8.5 0.9 9 1 4 1.9 8 1 2 4.8 3 0 0.1 0 4 8 5.0 0.9 9 5 5 2.2 7 6 2 1.3 3 5 0.1 0 1 8 4.3 0.9 9 3 6 2.1 8 9 3 2.2 4 0 0.1 2 5 8 8.6 0.9 9 1 9 2.0 0 7 2 1.2 I C 50/（μ g/L）抑制率/%线性
图3 酶标二抗不同作用时间对抑制率及线性系数的影响
Fig.3 Effect of different time on inhibition rate and linear coefficient of enzyme-labeled double-antibody
如表3和图3所示，随着酶标二抗作用时间变化，IC50有一定的浮动，在酶标二抗反应30 min时，经过显色，在双波长下检测分析得出的曲线OD值最好，抑制率基本稳定，线性系数达最大值0.995 5。
2.4 不同显色时间对检测结果的影响
在已包被抗原的酶标板中添加标准品或样本、抗体工作液、酶标二抗各50 μL，反应30 min，加入底物和氧化剂 1 ∶1（体积比）混合液 100 μL，分别显色 6、9、12、15、18、21 min，室温（25 ℃）条件下采用双波长测定不同显色时间的OD值，各指标结果见表4和图4。
从表4、图4中可以看出，随着显色时间的延长，OD值在一定范围内呈线性趋势升高，但是拐点和线性会有变化。IC50在0.08 μg/L左右时抑制率有所升高，综合各因素考量得出最佳的显色时间为15 min。
2.5 优化条件后样本检测验证
通过各变量之间的取舍，酶联免疫方法检测黄曲霉毒素的优化流程为：将包被黄曲霉毒素抗原的酶标板进行点板，25℃下加入样品及标准品、抗体液、酶标二抗各50 μL，反应30 min后加入260 μL洗涤液洗板3次，每次30 s，脱水仪甩干后立刻加入底物A、B混合溶液100 μL，显色15 min后加入50 μL终止液。在双波长450 nm和630 nm酶标仪检测分析。采用该流程对豆粕、玉米面、调料制品、食用油、调制乳、猪肉、牛肉、火腿肠等11种样本检测验证，数据如表5所示。对检测样本的抑制率、回收率及OD值进行比较，结果如图5所示。
表4 不同显色时间的检测结果
Table 4 Test results of different color developing time
显色时间/min 系数 OD值 拐点数 变异值/%6 0.082 83.5 0.991 3 0.907 2 4.6 9 0.087 79.9 0.990 6 1.423 3 3.0 12 0.069 75.8 0.988 4 1.975 2 2.5 15 0.073 77.1 0.996 9 2.385 2 2.1 18 0.078 86.2 0.997 2 2.777 3 1.9 21 0.080 88.4 0.993 8 3.249 2 5.4 IC50/（μg/L）抑制率/%线性
图4 不同显色时间对抑制率及线性系数的影响
Fig.4 Comparison of the parameters in different time of the second anti-action of enzyme mark
表5 各类样本检测结果
Table 5 Test results of different types of samples
待测样品变异系数/%饲料检测参数添加浓度/（μg/L）检测浓度/（μg/L） OD值 抑制率/%添加回收率/%116.0豆粉90.4玉米面83.0豆粕79.0面粉0.00 3.00 0.00 3.00 0.00 3.00 0.00 3.00 0.00 3.00 0.450 3.930 0.096 2.808 0.210 2.700 0.240 2.610 1.890 4.560 2.095 0.846 1.045 0.603 1.889 1.039 2.209 1.254 1.405 0.836 87.8 35.5 47.7 27.5 79.2 43.6 92.6 52.6 63.5 37.8 89.0 2.3 1.3 5.1 1.1 1.2 0.3 0.7 6.2 1.3 1.1
续表5 各类样本检测结果
Continue table 5 Test results of different types of samples
变异系数/%食用油待测样品检测参数添加浓度/（μg/L）检测浓度/（μg/L） OD值 抑制率/%添加回收率/%67.0调料粉70.0调制乳74.0猪肉84.4牛肉115.2火腿肠0.00 1.00 0.00 3.00 0.00 0.10 0.00 0.50 0.00 0.50 0.00 0.50 0.050 0.720 1.860 3.960 0.042 0.116 0.000 0.422 0.024 0.600 0.030 0.376 2.299 1.244 1.361 0.852 1.969 1.474 2.268 0.665 2.132 0.475 2.092 0.743 95.4 51.6 60.6 38.0 89.9 67.3 99.6 29.2 93.7 20.9 91.9 32.6 69.2 1.0 5.8 6.0 1.9 3.3 4.4 3.1 6.4 3.7 3.4 3.2 1.0
图5 检测比较各类样本抑制率、回收率及OD值的结果
Fig.5 Comparison with various samples of inhibition rate，recovery rate and OD value
由表5、图5可知，检测各类样本的抑制率在20.9%～67.3%之间，添加回收率在67%～116%之间。其中，调制乳的OD值和抑制率最高，但回收率偏低；饲料和牛肉的OD值不高，但是回收率超过100%；其它样本的回收率在67.0%～90.4%。综合来看，添加回收效果表现良好。
3 结论
通过对黄曲霉毒素抗原和抗体的制备提纯，利用方阵棋盘法确定抗原的最适包被稀释倍数为5×103，抗体的稀释倍数为2×105。而抗原包被时间、反应温度、酶标二抗作用时间、底物显色时间等是造成OD值变化的主要因素。采用ELISA的间接竞争方法确定最佳抗原包被时间为20 h、反应温度为24℃左右、酶标二抗作用时间为30 min、底物显色时间为15 min。
通过对饲料等11种样品的检测，在方法经过改进优化后计算得出：添加回收率在67%～116%之间，操作的变异系数在0.3%～6.4%之间，线性系数基本在0.99以上，IC50基本在0.1μg/L以下，板内变异在5%以内，板间变异在10%以内，各项检测参数符合要求，表明改进后的ELISA检测黄曲霉毒素的试验方法具有可行性。
本试验方法可在50 min～100 min完成检测，缩短反应时间，提高检测效率，结合其性能稳定、特异性强、操作便捷、灵敏度高的优点。可以作为检测大批量样本中黄曲霉毒素的一种可行性的方法。
[1]方振霞.黄曲霉毒素B1的分离、纯化及人工抗原的高校合成研究[D].福州：福建农林大学，2014.
[2]劳文艳，林素珍.黄曲霉毒素对食品的污染及危害[J].北京联合大学学报(自然科学版)，2011，25(1)：64-69.
[3]焦奎，张书圣.酶联免疫分析技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2004.
[4]王乐义.新城疫间接ELISA抗体检测试剂盒的研究[D].北京：中国农业大学，2004.
[5]Imtiaz Hussain，Jamil Anwar，Muhammad Rafiq Asi，et al.Aflatoxin M1 contamination in milk from five dairy species in Pakistan[J].Elsevier Ltd，2008，21(2)：78-79.
[6]陈霞，杨晓霞.高灵敏度酶联免疫法快速检测动物源性产品中氯霉素残留的研究[J].中国畜牧兽医，2013，40(6)：233-235.
[7]TRUCKSESS M W，STACK M E，NESHEIM，et al.Enzyme-linked immunosorbent assay of aflatoxins B1，B2，and G1 in corn，cottonseed，peanuts，peanut butter，and poultry feed：collaborative study[J].Pubmed，1989，72(6)：102-103.
[8]陈萍，邓冬云，欧静茹，等.酶联免疫吸附法(ELISA)测定花生油中的黄曲霉毒素 B1[J].中国卫生检验杂志，2012，22(3)：658-660.