二氧化硫或其衍生物（亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐）被广泛地应用于葡萄的采摘、酿制过程中，以起到保鲜、杀菌、抗氧化、稳定的作用[1-6]。从古代起，人们便使用硫磺来为葡萄酒杀菌。欧盟法律规定干红葡萄酒中SO2的总量上限为160 mg/L，干白和桃红葡萄酒中SO2的含量上限为210 mg/L[7]，澳大利亚为250 mg/L～300 mg/L，新西兰为 250 mg/L～400 mg/L[8]。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定当葡萄酒中亚硫酸盐含量超过10 mg/L时，必须在标准中予以标明[9]。我国对二氧化硫作为葡萄酒的添加剂，在使用量上也有严格的规定，作为添加剂的使用最高值为250 mg/L，二氧化硫残留量不得超过50 mg/L[10]。我国有机葡萄酒GB/T 19630—2011《有机产品》中规定，红葡萄酒的最大使用量为100 mg/L，白葡萄酒、桃红葡萄酒二氧化硫最大使用量为150 mg/L[11]。
葡萄酒中添加SO2，不但会影响葡萄酒的风味，而且也对人体健康不利，尤其对过敏体质者和哮喘病人会诱发一些身体问题[12-17]联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）联合食品添加剂专家委员会（Joint Expert Commttee on Food Additives Committee，JECFA） 制定的 SO2安全摄入限量是每天每千克体重0.7 mg。对于一个60 kg的成年人，相当于每天摄入量不能超过42 mg[8]。针对葡萄酒中亚硫酸盐的危害问题，Brown利用离子交换树脂来吸附葡萄酒中的亚硫酸盐[18]，而Seifter等则采用含固定氧化剂的膜来去除葡萄酒中亚硫酸盐[19]，这两种方法都能使葡萄酒中的亚硫酸盐降到0.01 mg/mL以下，但是由于其作用机制的非选择性，结果会造成葡萄酒中一些成分的损失，从而影响葡萄酒的质量。Lin等利用从麦苗中提取的叶绿体对葡萄酒中的亚硫酸盐清除情况进行了研究，结果发现该方法能够有效地除去葡萄酒中的亚硫酸盐，但是需要将葡萄酒的pH值调至8.5时，去除效率最好，而且该方法对白葡萄酒的处理效果要好于红葡萄酒，同时发现光照对去除效果有一定的促进作用，显然该方法存在一定缺陷[20]。
亚硫酸盐氧化酶能够专一性将亚硫酸盐氧化成硫酸盐，但是由于这种酶的复杂性，目前还未有商业化生产。叶绿体作为一种天然的生物催化剂，存在于绝大多数的绿色植物叶片中。叶绿体在一定条件下通过代谢途径对低浓度的亚硫酸盐溶液具有良好的氧化并脱除的效果[21]。本研究对从新鲜菠菜中提取的叶绿体内含物进行了改进，并对改进后的菠菜提取物去除葡萄酒中的亚硫酸盐情况进行研究。
1 材料与方法
1.1 原料
红葡萄酒、白葡萄酒：烟台张裕葡萄酒有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化钠、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、过氧化氢（以上试剂均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
ME204T/02电子天平：梅特勒-托利多公司；H1650-W台式离心机：湖南湘仪离心机有限公司；101型真空干燥机：北京市永光明医疗仪器厂。
1.2 菠菜提取物的制备
选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净，擦干后去除叶梗，用高速组织破碎机破碎成匀浆，6层纱布过滤除去粗纤维，所得滤液于4℃、10 000 r/min离心10 min，收集含叶绿体的内容物（线粒体、溶酶体、微体）的沉淀，真空干燥、复配、密封、干燥处保藏、备用。
1.3 葡萄酒中二氧化硫的测定
按照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中SO2的测定方法进行测定[22]。
1.4 葡萄酒中二氧化硫去除单因素试验
分别取50 mL葡萄酒置于250 mL的三角瓶中，然后测定菠菜提取物在不同使用量、处理时间、pH值和酒精度等各种条件下二氧化硫的去除情况。其中，试验过程中葡萄酒pH值的调整用0.1mol/L的氢氧化钠进行，除非特别说明，所有试验均在25℃室温条件下进行。
1.5 葡萄酒中二氧化硫去除正交试验
在葡萄酒中二氧化硫去除单因素试验的基础上进行正交试验设计，选取菠菜提取物用量0.3、0.4、0.5 mg/mL；处理时间 4、6、120 min；pH 值 3.5、7.0、9.0；和乙醇浓度12.5%、22.5%、27.5%，为自变量，以 1、2、3水平进行编码，以总二氧化硫清除率为响应值进行四因素三水平试验设计，试验因素和水平设计见表1。
表1 正交因素水平
Table 1 The factors and levels for the orthogonal design
水平 A菠菜提取物用量/（mg/mL）时间/min C pH值 D乙醇浓度/%1 0.3 4 3.5 12.5 2 0.4 6 7.0 22.5 3 0.5 120 9.0 27.5 B处理
1.6 去硫葡萄酒的感官评价
葡萄酒的感官品质包括葡萄酒的外观、香气、滋味以及是否具有典型性，因酒龄、品种、种植条件的不同，葡萄酒带给人的感觉也千变万化，本研究对去除二氧化硫后的葡萄酒进行感官评定，感官评分标准如表2所示。
表2 葡萄酒感官评分原则
Table 2 Sensory scoring principles of wine
项目 评语 分值外观 澄清透明、有光泽、具有本品应有的色泽、悦目协调20澄清透明、具有本品应有的色泽 18～19澄清、无夹杂物，与本品光泽不符 15～17微混、失光或人工着色 ＜15香气 果香、酒香浓郁优雅、协调悦人 28～30果香、酒香良好、尚悦怡 24～27
续表2 葡萄酒感官评分原则
Continue table 2 Sensory scoring principles of wine
项目 评语 分值果香与酒香较少、但无异香 2 0～2 3果香不足、或不怡人、或有异香 1 5～1 9香气不良、使人厌恶 ＜1 5滋味 酒体丰满、有新鲜感、醇厚协调、舒服、爽口、酸甜适口、柔细轻快、余味悠长3 8～4 0酒质柔顺、柔和爽口、酸甜适当 3 4～3 7酒体协调、纯正无杂 3 0～3 3略酸、较甜腻、绝干带甜、欠浓郁 2 5～2 9酸、涩、苦、平淡、有异味 ＜2 5典型性 典型完美、风格独特、优雅无缺 1 0典型明确、风格良好 9有典型性、不够怡雅 7～8失去本品典型性 ＜7
1.7 数据处理
所得数据利用正交设计助手II和SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，P＞0.05为差异不显著；P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 菠菜提取物用量对除硫效果的影响
分别使用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的菠菜提取物，按照1.4的方法进行葡萄酒中二氧化硫去除试验，结果见图1。
图1 菠菜提取物用量对除硫效果的影响
Fig.1 Effect of spinach extract dosage on sulfur removal
由图1可以看出，随着菠菜提取物用量的增加，除二氧化硫效果明显提高，当菠菜提取物用量为0.2 mg/mL时，葡萄酒中的游离二氧化硫被完全去除，而当菠菜提取物使用量为0.4 mg/mL时，除总二氧化硫（包括游离二氧化硫与结合二氧化硫）效率可达92%，随着菠菜提取物用量的进一步提高，葡萄酒中的总二氧化硫可降到0.01 mg/mL以下。根据感官品评结果，当菠菜提取物用量超过0.4 mg/mL时，葡萄酒的口感则有明显的氧化味，因此，在使用过程中应将菠菜提取物的最适使用量控制在0.4 mg/mL以内。Lin等利用酶法来去除葡萄酒中的二氧化硫[20]，当酶使用量为10 mg/mL时，其除二氧化硫率可达95%。因此，本研究菠菜提取物的使用量较少，约为Lin等研究量1/25。
2.2 处理时间对去除硫效果的影响
按照0.4 mg/mL的菠菜提取物使用量，研究不同处理时间对葡萄酒中（总二氧化硫含量为0.136 5 mg/mL）二氧化硫的去除效果，结果见图2。
图2 处理时间对除二氧化硫效率的影响
Fig.2 Effect of treatment time on SO2removal
由图2可以看出，采用菠菜提取物处理的时间非常短，当处理时间为6 min时，去除二氧化硫效率可达92.77%，进一步延长处理时间对结果影响不大，而且，处理时间增加会进一步增加葡萄酒的氧化，严重影响葡萄酒的质量。Lin等利用酶法来去除葡萄酒中的二氧化硫，当酶使用量为10 mg/mL时，除二氧化硫率为95%时，则需要 1 h[20]。
2.3 pH值对除硫效果的影响
菠菜提取物用量为0.4 mg/mL，用氢氧化钠溶液对葡萄酒的pH值进行调整，然后测定不同pH值条件菠菜提取物的除二氧化硫情况，结果见图3。
图3 pH值对二氧化硫处理情况的影响
Fig.3 Effect of pH on SO2removal
由图3可以看出，pH值对菠菜提取物法除去葡萄酒中的二氧化硫影响不大，因此，在使用菠菜提取物法去除葡萄酒中的二氧化硫时不需要对pH值进行调整。而Lin等利用酶法来去除葡萄酒中的二氧化硫，则需要将葡萄酒的pH值调整到8.5左右，由于葡萄酒的pH值一般低于4.0，因此，采用离子交换法和Lin等方法时[20]，需要对处理后葡萄酒的pH值进行调整，显然这必将会对葡萄酒的质量，特别是感官和口感造成一定的影响。
2.4 乙醇浓度对除硫效果的影响
用无水乙醇分别将葡萄酒的乙醇含量调至12.5%、22.5%和27.5%，然后测定菠菜提取物在不同酒精度下的除硫情况，结果见图4。
由图4可以看出，乙醇浓度对二氧化硫的清除率有一定影响，但影响不是太大。采用Lin等方法时，葡萄酒的酒精含量会对处理结果有影响[20]。
图4 乙醇浓度对处理结果的影响
Fig.4 Effect of ethanol concentration on sulfite removal
2.5 正交试验
综合试验过程与结果，以总二氧化硫作为评价指标，依据表1进行四因素三水平正交试验，用SPSS和正交助手软件对结果进行分析，结果见表3。
表3 葡萄酒中二氧化硫去除效果正交试验结果
Table 3 The results of orthogonal experiment for SO2removal in wine
注：*表示对结果影响显著（0.01＜P＜0.05）；**表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
总二氧化硫清除率/%1 1（0.3） 1（4） 1（3.5） 1（12.5） 83.27±0.81**2 1（0.3） 2（6） 2（7.0） 2（22.5） 84.56±1.06**3 1（0.3） 3（120） 3（9.0） 3（27.5） 84.89±1.79**4 2（0.4） 1（4） 2（7.0） 3（27.5） 90.73±1.45*5 2（0.4） 2（6） 3（9.0） 1（12.5） 93.90±1.69 6 2（0.4） 3（120） 1（3.5） 2（22.5） 91.03±1.54*7 3（0.5） 1（4） 3（9.0） 2（22.5） 87.32±1.86**8 3（0.5） 2（6） 1（3.5） 3（27.5） 88.15±0.91**9 3（0.5） 3（120） 2（7.0） 1（3.5） 88.41±1.10**均值1 84.24 87.11 87.48 88.53均值2 91.89 88.87 87.90 87.64均值3 87.96 88.11 88.70 87.92极差 7.65 1.76 1.22 0.89水平 A菠菜提取物用量/（mg/mL）B处理时间/min C pH值 D乙醇浓度/%
由表3可知，试验5效果最佳，其总二氧化硫清除率最高，试验5与试验4和6差异显著，与其他试验小组比较差异极显著。由试验结果的极差值可知，本试验的影响因素菠菜提取物用量＞处理时间＞pH值＞乙醇浓度，其中菠菜提取物用量因素对试验结果的影响最大，其中菠菜提取物用量0.4 mg/mL时的效果最好。
本研究对正交试验结果进行了验证，取菠菜提取物用量0.4 mg/mL、处理时间6 min、pH3.5（葡萄酒正常的pH值）、乙醇浓度12.5%（葡萄酒正常的乙醇浓度），总二氧化硫去除率为94.36%，与正交试验结果无明显差异。
2.6 菠菜提取物用量对葡萄酒感官的影响
按照100分葡萄酒感官评分原则，对去除二氧化硫后的葡萄酒进行品评，结果见表4。
表4 葡萄酒感官品评结果
Table 4 Sensory evaluation results of wine
品种 外观 香气 滋味 典型性 总分红葡萄酒（未除硫） 20 18 35 8 81红葡萄酒（除硫） 20 25 39 9 93白葡萄酒（未除硫） 20 17 34 8 79白葡萄酒（除硫） 20 24 38 9 91
由表4可以看出，去二氧化硫的葡萄酒在感官品评方面要好于未处理的葡萄酒，品评人员明显感觉，经去二氧化硫后的葡萄酒几乎闻不到硫臭味，而且入口后整体协调性也明显好于未处理的葡萄酒。
3 结论
葡萄酒中添加二氧化硫是人类长期实践的结果，但是对于一些二氧化硫敏感患者来说，葡萄酒中的二氧化硫则是非常危险的。目前已报道的葡萄酒除硫技术不但过程复杂，而且严重影响葡萄酒的质量。本研究研制的菠菜提取物技术，具有许多优点，如操作简单，使用量少，除硫速度快，效率高，同时不受pH值的影响，除硫后的葡萄酒口感明显优于处理前的产品，因此，本研究的成果，将为无硫葡萄酒的研制提供理论上的支撑。
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