狭果茶藨子（Ribes stenocarpum Maxim.）又称长果醋栗，是茶藨子属的一种植物，主要分布在我国甘肃、四川、贵州、青海等地区[1-2]。茶藨子属植物是我国藏医常用藏药，青藏高原人民在长期的生活实践中，用茶藨子防治心脑血管疾病和感冒。茶藨子风味独特、天然无污染，又被称为“第三代水果”[3]，其果实为浆果，营养丰富，加工性能良好，可用作功能性食品的开发。
目前，国内外学者对茶藨子属的黄酮[4]、花青素[5]、生物碱[6]以及脂肪酸类[7]等物质进行了研究报道，我国茶藨子植物品种资源丰富，但对其活性成分研究还较欠缺，该属大部分植物无人问津，相关研究屈指可数。卢胜明[8]从川西茶藨子地上部分的95%乙醇提取物中分离鉴定了22种化合物，其中所得化合物为新的联苯化合物，两者对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为10.2%（IC50值 1.00 mg/mL）、17.2%（IC50值 1.00 mg/mL）；何可群等[9]对贵州特有的野生茶藨子根的活性化学成分进行了提取分离，得到东莨菪素、滨蒿内酯等7个单体化合物；周霞[10]对贵州亨利茶藨子粗提物进行了抗菌活性研究，测试结果表明根皮部分的氯仿提取物对小麦赤霉病菌的抑制活性达90.94%。
青藏高原茶藨子虽然分布广泛，但大多为野生，目前尚未对其进行有效的开发利用。因此，为了有效利用青藏高原分布较多的茶藨子资源，充分发挥其经济效益，本研究将对青藏高原狭果茶藨子果实中黄酮进行提取工艺优化，并对其体外降血脂活性进行评价，以期为青藏高原茶藨子植物的开发提供理论基础和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
狭果茶藨子：采自青海门源，50℃烘箱烘干48 h，粉碎后过60目筛，备用。
胰脂肪酶（90 U/mg）、胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠：上海阿拉丁生物科技公司；聚酰胺：江苏长丰化工有限公司；辛伐他汀：云鹏医药集团有限公司；芦丁、聚乙烯醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：国药集团化学试剂公司；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯：天津市富宇精细化工公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-2600型紫外分光光度计：日本岛津公司；DHG-9031A恒温振荡培养箱：上海一恒科学仪器公司；RE-52旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-2恒温水浴锅、FA2204电子天平、PHS-3C pH计：上海力辰邦西仪器科技公司。
1.3 方法
1.3.1 微波辅助提取狭果茶藨子黄酮单因素试验
以乙醇为提取溶剂，黄酮得率为指标，考察提取时间（4、6、8、10、12 min），微波功率（300、400、500、600、700 W），料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]对狭果茶藨子黄酮得率的影响。
1.3.2 响应面设计优化狭果茶藨子黄酮提取工艺
根据单因素结果，以提取时间、微波功率、料液比为考察因素，依据Box-Behnken设计原理，通过Design Expert V软件优化狭果茶藨子黄酮制备工艺，根据响应面构建的三维图确定微波辅助提取狭果茶藨子黄酮的最优工艺参数[11]。
1.3.3 狭果茶藨子黄酮粗提物的制备
按照最优工艺条件，称取一定量狭果茶藨子果粉，提取3次，合并滤液并浓缩至一定体积，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取[12]，收集有机相，制备得狭果茶藨子黄酮粗提物。
1.3.4 狭果茶藨子黄酮富集
选取聚酰胺树脂为柱材料，以树脂与样品液的料液比1∶20（g/mL）上样，待上样吸附24 h后开始梯度洗脱（蒸馏水、20%、40%、60%、80%乙醇溶液及无水乙醇），每个梯度洗脱至流出液无色为止，毛细管吸取少量洗脱液点样于滤纸上，喷涂1%三氯化铝乙醇液使之显色[13]，于365 nm紫外灯下观察，收集检测斑点显黄色的洗脱液，浓缩后于-55℃条件下真空冷冻干燥，得纯化后狭果茶藨子黄酮固体粉末。
1.3.5 狭果茶藨子黄酮得率的测定
参考白生文等[14]的方法，称取芦丁对照品，加入80%乙醇配制成2 mg/mL的标品液，摇匀，再依次移取溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，以亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠体系进行显色，于505 nm波长下测定吸光度，以芦丁浓度为x轴，对应浓度下吸光值为y轴，绘制标准曲线，得回归方程y=11.735x-0.004（R2=0.999 3），按公式（1）计算。
式中：C为黄酮质量浓度，mg/mL；V为测定液体积，mL；N为稀释倍数；M为样品质量，mg。
1.3.6 狭果茶藨子对胰脂肪酶抑制作用
1.3.6.1 胰脂肪酶活性测定
参考朱晓青等[15]的方法。将磷酸缓冲液5mL（pH7.4）和4%聚乙烯醇橄榄油乳化液4 mL加入锥形瓶中，振荡摇匀后，在40℃反应5 min后，加入1 mL 1 mg/mL的酶液，混匀并准确计时，在40℃水浴中持续保温30 min，结束后加入15 mL的95%乙醇，滴加1%酚酞指示剂，用0.025 mol/L的NaOH溶液进行滴定，记录消耗体积。空白对照组水浴后，先加入15 mL的95%乙醇，摇匀，最后加入1 mL酶液，用0.025 mol/L的NaOH溶液对空白组进行滴定，记录消耗空白组NaOH的体积。
1.3.6.2 狭果茶藨子对胰脂肪酶抑制率的测定
配制纯化前后不同浓度的狭果茶藨子黄酮样液及辛伐他汀溶液，按1.3.6.1胰脂肪酶活性测定方法操作，计算纯化前后不同浓度狭果茶藨子黄酮样液对胰脂肪酶的抑制率。
1.3.7 狭果茶藨子对胆酸盐的结合能力
参考纪秀凤等[16]的方法。配制纯化前后不同浓度的狭果茶藨子黄酮样液，分别取1 mL加入3支离心管中，再各加入4 mL的胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠溶液（0.3 mmol/L，pH=6.3），恒温振荡（37 ℃，1 h），离心（6 000 r/min，10 min），取2.5 mL上清液于玻璃管中，移取7.5 mL 60%硫酸溶液，轻轻混匀，在70℃下反应20 min，再冰浴5 min，于387 nm处测定吸光度值，计算纯化前后狭果茶藨子不同浓度黄酮样液对胆酸盐的结合率，见公式（3）。
式中：A0为空白组吸光度值；A1为样品组吸光度值；A2为对照组吸光度值。
1.4 数据处理
所有数据采用Excle 2007和SPSS 22.0软件分析，并以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 微波辅助提取狭果茶藨子黄酮单因素试验结果
2.1.1 提取时间对狭果茶藨子黄酮得率的影响
提取时间对狭果茶藨子黄酮得率的影响见图1。
图1 提取时间对黄酮得率的影响
Fig.1 Influence of extraction time to the flavonoid yield
由图1可知，随着提取时间的延长，黄酮得率呈现出先增加后减小的趋势，可能原因是微波长时间的作用导致黄酮结构分解，且容易造成其它成分浸出。当提取时间为8 min时，得率达到最高，故选取时间为8 min作为最佳提取时间。
2.1.2 微波功率对狭果茶藨子黄酮得率的影响
微波功率对狭果茶藨子黄酮得率的影响见图2。
图2 微波功率对黄酮得率的影响
Fig.2 Influence of microwave power to the flavonoid yield
由图2可知，当微波功率小于500 W，狭果茶藨子黄酮得率随着微波功率的增大呈上升趋势，而微波功率在500 W时，黄酮得率最大，随后呈现下降趋势。微波功率过大，导致温度变化快，可能会导致黄酮结构降解，甚至引起爆沸现象，从而影响黄酮得率。故狭果茶藨子黄酮提取的最佳微波功率选择500 W。
2.1.3 料液比对狭果茶藨子黄酮得率的影响
料液比对狭果茶藨子黄酮得率的影响见图3。
由图 3 可知，当料液比在 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）范围内，狭果茶藨子黄酮得率随溶剂体积增大而增高，料液比1∶30（g/mL）时得率最高，随后呈下降趋势，溶剂体积太大，因其它成分溶出而导致黄酮浸出效率变低，也可能会导致微波热能负荷增大，溶剂竞争吸收微波能量改变提取的温度环境，不利于黄酮的浸出，从而影响黄酮得率。故选择料液比为1∶30（g/mL）为宜。
图3 料液比对黄酮得率的影响
Fig.3 Influence of solid-to-liquid ratio to the flavonoid yield
2.2 微波辅助提取狭果茶藨子黄酮响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果和方差分析
根据单因素结果，对提取时间（A）、微波功率（B）、料液比（C）进行三因素三水平的响应面设计，因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。
表1 因素水平
Table 1 Factors and levels
水平 因素A提取时间/minB微波功率/WC料液比/（g/mL）-1 6 400 1∶20 0 8 500 1∶30 1 10 600 1∶40
表2 响应面试验结果
Table 2 Response surface test results
试验号 因素 黄酮得率/%A/minB/WC/（g/mL）1 8 500 1∶30 22.37 2 8 500 1∶30 22.50 3 500 1∶30 22.24 4 6 600 1∶30 21.85 8 5 10 400 1∶30 21.79 6 6 400 1∶30 20.85 7 10 500 1∶20 20.50 8 8 400 1∶20 21.05 500 1∶40 20.68 10 10 600 1∶30 21.09 11 8 500 1∶30 22.41 12 8 600 1∶20 20.67 13 6 500 1∶20 21.13 14 10 500 1∶40 21.36 15 8 500 1∶30 22.21 16 8 400 1∶40 22.41 17 8 600 1∶40 21.38 9 6
表3 二次回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of quadratic regression model
注：*差异显著，P＜0.05；** 差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性模型 7.43 9 0.83 83.85 ＜0.000 1 **A 6.61×10-3 1 6.61×10-3 0.67 0.439 6 B 0.019 1 0.019 1.93 0.207 3 C 0.12 1 0.12 12.19 0.010 1 *AB 0.72 1 0.72 73.36 ＜0.000 1 **AC 0.43 1 0.43 45.56 0.000 3 **BC 0.18 1 0.18 18.34 0.003 6 **A2 1.13 1 1.13 114.71＜0.000 1 **B2 0.79 1 0.79 80.15 ＜0.000 1 **C2 3.49 1 3.49 354.40＜0.000 1 **残差 0.069 7 9.85×10-3失拟项 0.011 3 3.61×10-3 0.25 0.859 1纯误差 0.058 4 0.015总和 7.50 16 R2 0.990 8 R2Adj 0.965 8
根据表2结果，对数据进行多元回归分析，得回归模型，拟合得到回归方程：得率=22.35+0.029A+0.049B+0.12C-0.42AB+0.33AC+0.21BC-0.52A2-0.43B2-0.91C2。由表3可知，失拟项（P=0.859 1＞0.05）不显著，模型呈极显著水平（P＜0.000 1），R2=0.990 8，R2Adj=0.965 8，说明回归模型有较好的拟合程度，可以用于狭果茶藨子黄酮微波辅助提取的分析和预测。表3表明料液比对狭果茶藨子黄酮得率有显著影响，提取时间与微波功率的相互作用、提取时间与液料比的相互作用、微波功率与液料比的相互作用都极显著，且A2、B2、C2分别达到极显著水平。各因素对狭果茶藨子黄酮得率的影响顺序为：C＞B＞A。
2.2.2 响应面分析
图4为提取时间（A）、微波功率（B）、料液比（C）3个因素间交互作用对狭果茶藨子黄酮得率影响的响应面图和等高线图。
从图4可以看出，两两因素的三维图较陡，等高线图都呈椭圆形，说明两个因素对狭果茶藨子黄酮得率影响均显著。
2.2.3 最优工艺验证
根据响应面设计得最佳提取参数：提取时间8.11min，微波功率512.32 W，料液比1∶31.60（g/mL），黄酮得率为22.357%。基于仪器、试验条件进行修正，即提取时间 8 min，微波功率 500 W，料液比 1∶30（g/mL），经验证得黄酮得率为22.360%，与预测值无显著差异。
图4 各因素间交互作用对狭果茶藨子黄酮得率的等高线和响应面图
Fig.4 Contour plots and response surface for the effect of Ribes stenocarpum Maxim.on dissolution quantity of flavonoids
2.3 狭果茶藨子黄酮富集结果
以芦丁为标准品，测定纯化前后狭果茶藨子黄酮含量，得粗提物黄酮含量为14%，而经纯化后黄酮含量为68.72%。说明聚酰胺树脂对黄酮有较好的富集效果，可能是因为聚酰胺是一种含有酰胺键结构的缩聚高分子化合物，可以与含酚羟基的黄酮类物质形成氢键缔合[17]。
2.4 狭果茶藨子黄酮对胰脂肪酶抑制作用结果
胰脂肪酶与脂肪水解有密切关系，能催化其生成甘油和脂肪酸，然后在小肠中利用，如果能对胰脂肪酶活性进行抑制，便能减少脂肪水解，从而控制肥胖[18-20]。狭果茶藨子黄酮对胰脂肪酶抑制作用结果如图5所示。
图5 胰脂肪酶抑制作用
Fig.5 Effect of pancreatic lipase inhibition
随着黄酮质量浓度的增加，各样品对胰脂肪酶抑制率逐渐增大，且纯化前后狭果茶藨子黄酮对胰脂肪酶活性的抑制差异较大，当浓度为32 mg/mL时，纯化后的胰脂肪酶抑制率达91.6%，相较于纯化前，提高了16.81%，略低于同浓度下辛伐他汀（抑制率93.28%），这可能是因为狭果茶藨子粗提物中黄酮类物质含量较高[21]，使得其本身具有一定的生物活性，而经聚酰胺树脂初步纯化后，黄酮含量增大，对胰脂肪酶的抑制能力增强，进一步表明狭果茶藨子黄酮可能是抑制胰脂肪酶的主要物质基础。
2.5 狭果茶藨子对胆酸盐结合能力试验结果
2.5.1 纯化前后狭果茶藨子黄酮对胆酸盐结合能力的影响
为研究纯化前后狭果茶藨子黄酮对3种胆酸盐的结合能力，以不同胆酸盐结合率为指标，评价纯化前后狭果茶藨子黄酮的体外降血脂能力。结果如图6所示。
图6 纯化前后狭果茶藨子黄酮对胆酸盐结合率的影响
Fig.6 Effect of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids before and after purification on ability of bile salt-binding
纯化前后狭果茶藨子黄酮对3种胆酸盐结合能力具有一定的差异，纯化前狭果茶藨子粗提物对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率分别为32.97%、42.99%和35.60%，初步判定狭果茶藨子粗提物中含有较强的结合胆酸盐的活性成分。经聚酰胺树脂进一步纯化后，对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率高达61.71%、86.47%和84.79%，比纯化前分别提高了28.74%、43.48%和49.19%，与纯化后黄酮含量呈正相关，表明狭果茶藨子黄酮可能是体外结合胆酸盐的主要化学成分。
2.5.2 狭果茶藨子黄酮质量浓度对胆酸盐结合能力的影响
狭果茶藨子黄酮质量浓度对胆酸盐的结合能力结果如图7所示。
图7 不同狭果茶藨子黄酮质量浓度对胆酸盐结合率的影响
Fig.7 Effects of Ribes stenocarpum Maxim.flavonoids mass concentration on ability of bile salt-binding
狭果茶藨子黄酮对3种胆酸盐的结合能力随质量浓度的增大而增加，当质量浓度为5 mg/mL时，对牛磺胆酸钠的结合率最高为96.70%，甘氨胆酸钠与胆酸钠的结合率相当，分别为92.72%和91.64%，且对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的IC50分别为3.301、1.499、1.847 mg/mL，明显高于5 mg/mL的红树莓籽黄酮[22]。此外，这3种胆酸盐结合效果进一步分析发现，狭果茶藨子黄酮对牛磺胆酸钠的结合能力要强于其它两种胆酸盐，推测可能是由于该盐中含有磺酸基团，在中性环境下易发生离子化，且酸性远强于甘氨胆酸钠和胆酸钠中的羧基[23]，因此更易与黄酮化合物中的酚羟基结合。说明狭果茶藨子黄酮具有较强的体外结合胆酸盐能力，可用作开发天然降血脂食品原料。
3 结论
本研究首次采用微波辅助提取法结合响应面设计试验优化狭果茶藨子黄酮提取工艺参数，以胰脂肪酶抑制率、不同胆酸盐结合能力为指标，评价纯化前后狭果茶藨子黄酮体外降血脂活性。研究结果表明：狭果茶藨子黄酮微波辅助提取最佳工艺为：微波功率500 W，料液比 1∶30（g/mL），提取时间 8 min，此条件下黄酮得率为22.36%。相较于纯化前，纯化后黄酮含量达68.72%，狭果茶藨子黄酮体外降血脂活性更强，对胰脂肪酶的抑制率最高达91.6%，比纯化前提高了16.81%；对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的IC50分别为3.301、1.499、1.847 mg/mL，表明黄酮类化合物是狭果茶藨子发挥作用的主要活性成分，且青藏高原野生茶藨子植物丰富，尚未进行有效开发利用，因此，研究结果可为茶藨子降血脂功能作用机制的研究及功能性食品的开发提供重要的理论支撑，有利于茶藨子资源的进一步研究与开发。
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