茶是世界上最受欢迎的饮料之一，由茶树的叶子和芽制成。据统计，2019年全国18个主要产茶省茶园面积306.52万公顷，同比增加13.49万公顷，增长率4.60%[1]。大约三分之二的世界人口每天饮用茶和相关产品，它在降低糖尿病、肥胖和心血管疾病等慢性疾病的风险和延缓疾病进展方面发挥着积极作用[2]。茶叶中含有多种活性物质，茶多酚和咖啡因是茶叶中最主要的两大类活性物质。茶多酚是具有高抗氧化性能的次生植物代谢产物，具有多种生理功效，如抗氧化[3]、抗癌[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]等；茶叶中咖啡因含量在 1%～5%，虽然咖啡因有缓解疲劳、刺激中枢神经兴奋、利尿等积极作用，但是摄入过量含有咖啡因的食品或者提取物，会存在睡眠障碍[7]、血压升高[8]以及流产[9]等风险，所以，有关脱除茶叶中咖啡因的研究越来越受到人们的重视。
中国是世界主要茶叶生产国，茶叶出口涉及到了世界大多数国家[10]。2018年全国绿茶产量达到185万吨左右。且绿茶属于非年份茶，含有比红茶和乌龙茶更高含量的儿茶素。此外，如果绿茶储藏时间超过2 d～3 d，即使采用高温复火的工艺，也很难恢复其品质，从而会影响其商业价值[11]。为了避免绿茶茶叶的浪费和充分利用资源，对绿茶的深加工刻不容缓，而对绿茶进行深加工的核心问题在于绿茶中咖啡因与其他成分的分离。本文就近几年茶叶中脱除咖啡因的方法和研究动态进行了概要综述。
1 咖啡因的简介
咖啡因是一种生物碱，存在于多种植物中，如茶叶、咖啡、可可豆、瓜拉那浆果和科拉果[12]。咖啡呈弱碱性，白色粉末状，难溶于水。在常温下，咖啡因在氯仿中溶解度为18%，在水中的溶解度约为2%；然而，在100℃沸水中咖啡因的溶解度增加到70%[13]。一般来说，茶汤中咖啡因的含量会随茶叶的种类、茶叶的量、开水的用量、冲泡温度和冲泡时间的不同而变化[14-15]。目前，市场针对茶中咖啡因含量没有统一标准，美国规定咖啡因含量低于0.5%，而中国、日本规定咖啡因含量低于1%。
咖啡因有一些积极的生理作用，它与认知功能的增强、神经肌肉协调性的改善、情绪的改善和焦虑的缓解有关；但是过量摄入咖啡因会对一些人产生负面影响，如产生高血压、焦虑、睡眠不足、心跳加速和流产[16]等不良的影响。此外，在某些情况下，摄入咖啡因会刺激胃肠道并导致失眠[17-18]。随着人们生活水平的提高，由于咖啡因对人体存在的副作用导致茶叶在食品方面的应用受到限制，所以茶叶脱咖啡因产品越来越受到人们的重视。
2 脱除咖啡因的方法
目前，茶叶中脱除咖啡因的方法有很多，如超临界流体萃取法、离子沉淀法、水提法、乳酸乙酯加压萃取法、树脂吸附法、活性炭吸附法、蒙脱土吸附法、微生物降解法和生物降解法等。
2.1 化学溶剂脱除法
2.1.1 超临界流体脱除法
超临界流体萃取技术在分离咖啡因的研究中多次被应用。超临界流体是指物体的温度和压力超过临界值的状态。超临界流体萃取技术的基本原理是利用超临界流体特有的选择性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来，以达到分离和纯化的目的。
Sun等[19]利用超临界二氧化碳脱除绿茶中的咖啡因，为提高咖啡因在超临界二氧化碳中的溶解度，增加了助溶剂乙醇，结果表明在70.2%的咖啡因被分离的同时只有6.2%的儿茶素被移除。但是水作为助溶剂时，78%的咖啡因被去除的同时会导致67.6%的儿茶素被去除，表明该方法只适用于干茶叶脱咖啡因的研究，不适用于水溶液的体系。Tang等[20]进行了超声增强超临界流体萃取技术去除绿茶中的咖啡因研究，该方法与Sun等[21]的方法的不同之处是增加了超声技术，超声空化产生的局部高温高压会破坏化学键，破坏或削弱基质与溶质的结合，提高了萃取速率，咖啡因的去除率为82.28%，超声增强超临界流体萃取技术为低咖啡因或去咖啡因茶的生产提供了新途径。Lee等[22]研究了超临界二氧化碳萃取技术去除绿茶中咖啡因时对绿茶挥发性成分的影响，发现咖啡因去除得越多，挥发性成分就减少得越多，萜烯类化合物减少得最显著，芳香型化合物也会有所减少，造成茶叶的风味淡化，导致茶叶失去了饮用价值。Lee等[11]研究了超临界二氧化碳脱除绿茶中咖啡因时对绿茶风味和色泽的影响，发现在去除咖啡因的过程中芳樟醇等绿茶特征芳香成分减少，且破坏了叶绿素的固有结构，导致绿茶的绿色淡化，原因是超临界二氧化碳呈酸性，在用超临界CO2萃取时，叶绿素变成了脱镁叶绿素[23]，所以绿色淡化，从而严重影响绿茶应有的绿色外观。综上所述，超临界流体萃取技术只适用于不含水的干茶叶，不适用于茶叶提取液，所以限制了其在食品等领域的应用。
2.1.2 水脱除法
在热水中，咖啡因能迅速分散溶解，而儿茶素类物质由于分子量大于咖啡因，且溶解度低，比咖啡因浸出得速度慢，从而可以利用浸出速度和溶解度的不同来分离咖啡因[24]。
Liang等[25]研究了温度、时间和茶水比等因素对热水分离新鲜绿茶茶叶中咖啡因的影响。结果表明当温度从室温（20℃）升到100℃时，茶汤中咖啡因的浓度从23.7mg/g下降到4.0mg/g，而儿茶素的浓度从134.5mg/g下降到127.6 mg/g，可以去除绿茶中83.12%的咖啡因，儿茶素的损失只有5.13%。新鲜茶叶经杀青、揉捻、烘干后脱咖啡因，发现咖啡因含量降至1.2 mg/g～3.2 mg/g，但会减少16%～64%的儿茶素，所以水提法适用于新鲜叶子脱咖啡因，不适用于揉捻烘干后的叶子。Vuong等[26]利用此方法与喷雾干燥相结合制备低咖啡因的绿茶茶粉，结果表明可以去除绿茶中83%的咖啡因同时保留94%的儿茶素，低咖啡因茶粉中咖啡因含量为7 mg/g，可以为脱咖啡因绿茶茶粉提供理论依据，也可以应用于食品、化妆品等行业。但是这一方法存在局限性，如果红茶的新鲜叶片采用热水处理法脱去咖啡因，则会抑制发酵，因为高温会使多酚氧化酶失活，从而使儿茶素不能被氧化成茶红素，使红茶色泽受到影响，所以水脱除法不适用于红茶脱咖啡因的研究。且新鲜叶片经短时的高温热水处理，会使茶叶中易溶于水的物质（氨基酸等）浸出，导致茶叶中其它成分质量的降低，脱咖啡因的茶叶继续加工成干茶叶，需蒸汽固定再搓卷烘干，会导致茶叶的风味、颜色等其他营养成分的损失更大，所以热水提取法不适合茶叶脱咖啡因。
2.1.3 乳酸乙酯脱除法
乳酸乙酯的结构是2-羟基丙酸乙酯，由于其具有较高的溶解能力、可生物降解、无腐蚀性、无致癌性、无致畸性、无臭氧等特点[27]，使其应用面很广，例如，乳酸乙酯可以应用于污染土壤的螯合剂[28-29]，用于制药行业[30-31]，作为食品成分或者营养药品的成分之一[32]等，因此工业上将它作为绿色溶剂使用越来越受到关注。在30℃时，咖啡因在乳酸乙酯中的溶解度为3.2%，这与咖啡因在水中的溶解度很相近[33]。Bermejo等[34]研究了乳酸乙酯对咖啡豆中咖啡因的萃取分离，得到咖啡因的回收率高达60%左右的结果。该方法与水提法的不同点在于是直接萃取，水提法需要先将原料浸泡在水中加热，这个过程可能会导致基本的风味和芳香物质的损失。
Bermejo等[35]研究了乳酸乙酯与超临界二氧化碳相结合对绿茶中咖啡因的影响，结果表明咖啡因的提取率为13 mg/g～14 mg/g，且萃取速度是超临界二氧化碳的7倍左右，可以缩短提取时间，但会导致绿茶中挥发性成分散失以及绿色的淡化。Villanueva等[32]在咖啡豆脱咖啡因的基础上又进行了茶叶中脱咖啡因的进一步研究，主要选用水、乳酸乙酯、乳酸乙酯与水的混合物作为提取溶剂，进行咖啡因的提取，发现乳酸乙酯与水混合后提取效果更佳，结果表明在100℃时，咖啡因的脱除率为53%，咖啡因和儿茶素的回收率之比为2，而Park等[36]采用超临界二氧化碳流体进行绿茶中脱咖啡因的研究发现咖啡因与儿茶素回收率的比为1.5左右，对比得到乳酸乙酯与水混合后分离咖啡因的效果较好，但是当温度超过150℃时，咖啡因的脱除率为76%～92%，但是儿茶素却有下降趋势，说明高温可以提高咖啡因的脱除率，同理，不利于儿茶素的溶解，降低了儿茶素的提取率。综上所述，乳酸乙酯加压萃取法脱除咖啡因时会导致绿茶中芳香物质的损失，颜色的淡化以及儿茶素在高温下的损失，所以需要进一步优化其脱除咖啡因的条件。
2.2 物理吸附法
2.2.1 树脂吸附法
目前，关于树脂吸附法分离咖啡因的研究很多，不同的树脂吸附分离咖啡因的效果存在差异。极性的树脂主要通过氢键键合实现分离，分离效果较好，而非极性的树脂主要通过范德华力进行分离，分离效果不如极性树脂[37]。
王瑞芳等[38]用大孔树脂研究茶水提取液中咖啡因的分离，发现咖啡因的相对百分含量由6.37%降至0.3%左右，而儿茶素类的回收率只有65.21%，儿茶素的损失较大。Li等[39]研究超滤联合吸附树脂法从绿茶提取液中分离茶多酚和咖啡因，其主要过程：水浸提法→超滤→PA树脂吸附→洗脱。所得到的绿茶提取液中咖啡因含量小于4%，茶多酚含量高于90%，该方法与王瑞芳等[40]研究的不同点在于将醋酸纤维素钛复合超滤膜与树脂进行了结合，提高了分离的效率，减少了茶多酚的损失。王瑞芳等[40]研究了树脂吸附法脱绿茶中的咖啡因，结果表明RS-2树脂可使绿茶茶汤中咖啡因的含量由10.08%降至0.18%左右，RS-1树脂由于其极性较强会吸附溶液中的色素，导致茶汤的颜色明显变浅，脱色率达74.96%，导致绿茶失去绿色，影响其外观，故树脂吸附法不适用于绿茶脱咖啡因。
2.2.2 活性炭吸附法
活性炭具有孔结构、吸附能力强、比表面积大、可回收利用等特点，广泛应用于食品、饮料、电子、化工和国防等领域[41-42]。活性炭吸附法是利用活性炭对不同物质选择性吸附的原理[43]，从而实现不同的物质的分离，咖啡因具有多羟基嘌呤环和共轭双键结构，容易被活性炭这种多孔的物质吸附分离[44]。
薛长晖等[44]在活性炭吸附咖啡因的研究中得到咖啡因的脱除率为69%左右。王平等[45]研究了时间、活性炭用量、温度和样品溶液浓度对脱除绿茶提取液中咖啡因的影响，结果表明茶多酚与咖啡因的质量比由原来的6.9增至64.8，但该方法吸附时间不容易控制，超过一定的吸附时间可能会导致茶多酚的大量损失。黄继轸等[46]研究了脱咖啡因的速溶绿茶，在活性炭表面，制备一层厚度适当、具有疏水性、能够选择性地使咖啡碱通过的膜，结果表明咖啡因的脱除率达80%以上，速溶茶产品中咖啡因的含量在1%左右。但是不同制备膜的材料会在脱咖啡因时产生不良的影响，如三丁酸甘油酯会使茶的风味变差等。活性炭具有脱色的特点，会影响茶汤的色泽，此法不适用于脱除茶叶中的咖啡因。
2.2.3 蒙脱土吸附法
蒙脱土是一种层状黏土矿物，具有膨胀、增厚、吸附和塑性等性能，被广泛应用于农业、土木工程、制药、化妆品和食品等行业[47-49]。它由超薄结晶硅酸盐组成，由水合夹层隔开，层间空隙中补偿负电荷硅酸盐层的阳离子很容易与各种有机阳离子交换。与较小尺寸的有机铵阳离子，如四甲基铵和三甲基苯基胺离子阳离子进行交换反应，形成被阳离子硅酸盐层结构包围的纳米空间[50]，从而能够吸附咖啡因。
蒙脱土独特的结构性质也为茶汤的浑浊机理提供了进一步的解释，绿茶经蒙脱土处理脱去咖啡因后会产生浑浊现象，这是由于蒙脱土中间层释放的钙离子与绿茶中的草酸根离子反应生成草酸钙沉淀所致。可以通过层间效应，用离子法制备蒙脱土的中间离子，用Na、K、Mg或NH4离子取代蒙脱土层间的钙离子[51]，从而可以抑制脱咖啡因绿茶中草酸钙的析出，经过离子交换的蒙脱土可以分离绿茶中的咖啡因，保持绿茶的外观质量。
Shiono等[51]以蒙脱土为原料，对茶叶提取物进行了脱咖啡因的研究，结果发现蒙脱土在吸附咖啡因时，对咖啡基奎宁酸等均无明显吸附，而活性炭在同样条件下吸附咖啡因的同时也吸附了咖啡基奎宁酸和咖啡基奎宁内酯，由此可以表明蒙脱土对茶叶提取物中咖啡因的吸附效果优于活性炭，且不影响其它物质的质量。Okada等[50]以天然钠蒙脱土和合成钠皂苷为主要材料进行了脱咖啡因的研究，与Shiono等[51]研究的不同点在于利用苄胺盐酸盐对蒙脱土进行了前处理。结果表明在低浓度的咖啡因中，经处理得到的改性蒙脱土吸附咖啡因的效率高达96%以上，该试验也分析了水溶液中蒙脱土的纳米结构改性前后的变化，蒙脱土经苄胺盐酸盐处理后减少了插入的阳离子数量，同时增加了硅氧烷与苄胺盐酸盐的作用从而增加了对咖啡因的吸附表面积，水分子的插入引发了对咖啡因吸附的协同作用，从而提高了对咖啡因的吸附，但是蒙脱土与咖啡因之间的作用机理需要进一步证实。Yamamoto等[52]通过X射线衍射、漫反射红外傅里叶光谱法转换光谱学（漂移）和扫描探针显微镜探究了蒙脱土与咖啡因之间的相互作用，发现咖啡因分子都被吸附到层间空间和表面，与Si-OH和硅氧烷之间发生相互作用。这一发现将有助于在生产咖啡饮料和食品时，选择层间空间中的离子和有机化合物，以提高蒙脱土吸附咖啡因的量。
2.3 生物脱除法
2.3.1 微生物降解法
Kurtzman等[53]在1970年首次提出了微生物可以降解咖啡因。细菌的降解途径主要是通过脱甲基化[54]，但真菌降解咖啡因的途径尚不明确，需要进一步研究。
Ramarethinam等[55]研究了茶植物中的咖啡因的代谢机理，发现将地衣芽孢杆菌喷洒在茶树上时，茶叶中咖啡因的含量明显下降，且不影响其它茶叶成分的质量与含量，此方法为低咖啡因茶树的种植提供了理论依据。Gokulakrishna等[56]进行了将咖啡因作为微生物培养基的唯一碳源和氮源的测试，发现假单胞菌GSC1182在48 h内对咖啡因的降解率达到80%，当有蔗糖存在时咖啡因的降解率提高，但在蔗糖没有被消耗时，对咖啡因的降解也表现出了促进作用，其促进作用的机理尚不明晰，需要进一步的研究。Babu等[57]利用分离的P.alcaligenes假单细胞菌CFR 1708细胞碎片进行生物脱咖啡因的研究，结果表明含量为3%～7%的咖啡因的样品需要80 h左右才能被降解完全。该方法的降解速率低，时间长，而且在脱咖啡因食品饮料等中的应用需要进一步研究。
2.3.2 酶降解法
咖啡因是由黄嘌呤合成的，因此可以通过抑制能促使黄嘌呤合成的酶活性而停止植物中咖啡因的合成[54]，从而减少咖啡因的含量，达到脱除咖啡因的效果。
Ogita等[58]利用RNA干扰技术抑制咖啡植株中的可可碱合酶和咖啡因合酶基因，使植株的咖啡因含量降低50%，此方法可用来种植含低咖啡因茶叶的茶树。周斌星[59]研究了普洱茶发酵分离出两种优势菌种黑曲霉NCBT 110A和聚多曲霉NRRL 250，发现当葡萄糖等营养物质缺失时，sydowii曲霉NRRL 250可以利用咖啡因作为碳源，从而降解82.09%的咖啡因。此方法克服了Babu等研究方法的局限性，可以应用于生产不含咖啡因的茶。在生物中降解咖啡因的酶主要是去甲基酶，Yamoka等[60]进行了去甲基酶的纯化，发现纯化后这种酶很不稳定，很容易失活。因此，目前该方法不适用脱咖啡因的研究，需要进一步探究去甲基酶稳定的条件，为茶叶中脱咖啡因的研究提供理论依据。
3 总结和展望
本文综述了水提法、超临界流体萃取法、乳酸乙酯加压萃取法、活性炭吸附法、树脂吸附法、蒙脱土吸附法、微生物降解法以及酶降解法来脱除茶叶中咖啡因的研究进展及优缺点，这些方法均能达到脱除咖啡因的效果，但是一些方法会影响茶叶中其它成分的质量，如挥发性成分的散失、绿色的淡化以及茶多酚的损失等，需要进一步优化条件进行脱咖啡因的研究。此外，通过对比目前脱除咖啡因的方法，得到蒙脱土能较高效率的脱除茶叶中的咖啡因，且不影响茶叶中的其它成分。但是蒙脱土在脱除咖啡因的产品和茶饮料中应用较少，这是今后研究的一个方向。同时，在进行改性蒙脱土脱咖啡因的研究时，由于咖啡因呈弱碱性，所以pH值对脱除咖啡因有一定的影响，可以通过调节pH值来进一步优化改性蒙脱土的条件来进行咖啡因的脱除。不同的温度、时间、茶叶与水的比例对咖啡因脱除的效果也有不同程度的影响。本文为改性蒙脱土进一步脱除茶叶中咖啡因的研究提供了理论依据和方法。
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