小龙虾副产物主要指对原料虾进行加工利用后所剩下的物质，包括虾头、虾壳、虾足以及低值小虾部分[1]。这些副产物约占原料的85%，其蛋白质、脂肪、矿物质以及活性成分虾青素、虾红素和甲壳素等含量丰富，其中以蛋白质的含量最高，约占副产物的36%～40%[1-3]；虾头壳粗蛋白中必需氨基酸占45.33%，与牛奶中必需氨基酸（46.59%）和酪蛋白中必需氨基酸（46.14%）极为接近[4-6]。虾副产物蛋白作为食源性蛋白是品质较高的动物性蛋白，其含有的功能性多肽安全性高、对人体无毒副作用、易被人体吸收、含量较高且具有较高的抗氧化活性和抑菌性能，可以用于制备功能性食品[2，5]。因此这些食源性多肽受到广泛关注。
由于鲜食小龙虾的庞大市场需求，同时现有小龙虾加工均处于粗加工阶段，大量的小龙虾副产物被弃置，造成了环境污染和资源浪费，小龙虾副产物资源亟需得到开发与高值化利用。从虾头、虾壳等副产物中提取的粗蛋白，再酶解制备活性多肽为解决这一问题提供了有效途径[6]。目前关于酶解法制备小龙虾副产物活性肽的研究多集中于复合酶解或超声辅助酶解，仍存在水解度低，活性肽制备不完全的问题[6]。本研究采用两步酶解法制备小龙虾副产物多肽，对其抗氧化性进行初步评价与分析，对比二次酶解产物与一次酶解产物的总抗氧化能力，本研究可作为产业化的技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小龙虾：市售。碱性蛋白酶（内切酶，酶比活力为500U/mg）、中性蛋白酶（内切酶，酶比活力为150U/mg）、胰蛋白酶（内切酶，酶比活力为250 U/mg）、木瓜蛋白酶（内切酶，酶比活力为200 U/mg）：河南仰韶生化工程有限公司；2，2’-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]试剂盒：上海如吉生物科技发展有限公司；Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒：北京酷来搏科技有限公司。
1.2 仪器与设备
恒温磁力搅拌器（EPFO-984TA7CHSEUA）：上海安谱实验科技股份有限公司；水分快速测定仪（DSH-50-5）：上海越平科学仪器有限公司；自动凯氏定氮仪（KT8400）：福斯分析仪器有限公司；粗脂肪测定仪（SZF-06A）：上海昕瑞仪器仪表有限公司；酶标仪（Multiskan FC）：上海旦鼎国际贸易有限公司；超高效液相色谱仪（AcQuity H class）：美国Waters有限公司；蛋白纯化系统（AKTA prime Plus）：GE Healthcare Life Sciences China；凝胶成像仪（伯乐BIO-RAD Gel Doc XR）：上海土森视觉科技有限公司。
1.3 原料预处理
小龙虾除虾肉，以虾壳为主的副产物进行清洗冷冻，置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥48 h，干燥后取出粉碎，过60目筛备用。
1.4 虾副产物基本成分测定
水分含量：采用水分快速测定仪；灰分含量：采用GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的干法灰化法；脂肪含量：采用GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏提取法；粗蛋白含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法。
1.5 酶解工艺
1.5.1 酶的筛选
针对胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶进行初步筛选，分别向小龙虾副产物冻干粉中加相同质量的不同蛋白酶，以水作为反应媒介，在各自最适温度和pH值下酶解（提取条件见表1），以蛋白得率作为检测指标，比较各酶对粗蛋白的提取能力。
表1 不同蛋白酶对小龙虾副产物蛋白的提取条件
Table 1 Extraction conditions of the protein from crayfish byproducts by different proteases
蛋白酶种类pH值温度/℃时间/h酶用量/%料液比/（g/mL）胰蛋白酶 8.0 37 3 2 1∶10中性蛋白酶 7.0 50 3 2 1∶10木瓜蛋白酶 6.5 60 3 2 1∶10碱性蛋白酶 8.5 55 3 2 1∶10
1.5.2 单因素与正交试验
1.5.2.1 酶解时间对蛋白得率的影响
称取小龙虾副产物冻干粉，以水作为反应媒介，调整pH值和温度，加入蛋白酶后，分别酶解2、3、4、5h，测定蛋白得率。
1.5.2.2 酶用量对蛋白得率的影响
称取小龙虾副产物冻干粉，以水作为反应媒介，调整pH值和温度，分别加入1%、2%、3%、4%蛋白酶后进行酶解，测定蛋白得率。
1.5.2.3 料液比对蛋白得率的影响
称取小龙虾副产物冻干粉，以水作为反应媒介，原料与水的比例为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL），调整pH值和温度后进行酶解，测定蛋白得率。
1.5.2.4 一次酶解正交试验
根据单因素结果，选用L9（33）的正交试验表（表2），以蛋白得率为检测指标，研究较优蛋白酶的酶用量（A）、酶解时间（B）及料液比（C）对小龙虾副产物中蛋白得率的影响。
表2 小龙虾副产物蛋白制备正交试验设计
Table 2 Orthogonal array design for the preparation of the protein from crayfish by-products
水平 因素A酶用量/%B酶解时间/hC料液比/（g/mL）1 1 2 1∶10 2 2 3 1∶15 3 3 4 1∶20
1.5.2.5 二次酶解正交试验
选取L9（33）的正交试验表（表3），以蛋白水解度为检测指标，研究蛋白酶的酶用量（A）、酶解时间（B）及料液比（C）对小龙虾副产物蛋白水解度的影响。
表3 小龙虾副产物蛋白水解正交试验设计
Table 3 Orthogonal array design for the hydrolysis of the protein from crayfish by-products
水平 因素A酶用量/%B酶解时间/hC料液比/（g/mL）1 1 2 1∶5 2 2 3 1∶10 3 3 4 1∶15
1.6 分析方法
1.6.1 蛋白得率
蛋白得率按下式计算。
式中：M1为副产物冻干粉酶解产物中粗蛋白含量，g/g；M2为副产物冻干粉中粗蛋白含量，g/g。
1.6.2 蛋白水解度测定
酶解液和10%三氯乙酸溶液混匀，静置30 min，离心，取全部上清液，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。水解度按下式计算。
1.6.3 总氨基酸组成分析
取0.025 g样品，置于5 mL安醅瓶中，加3 mL 6 mol/L盐酸或40%氢氧化钠溶液，酒精喷灯拉丝封口，110℃水解24 h，样品中蛋白全部水解成氨基酸残基后，取过膜后的上清液3 mL按照Elite－AAK氨基酸分析系统的衍生方法进行氨基酸衍生化，高效液相色谱法测定氨基酸含量。色谱分析条件：Elite－AAK氨基酸分析色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温27℃，进样体积10μL，流动相流速1.2 mL/min，检测波长360 nm。
1.6.4 总抗氧化活性
总抗氧化能力参照ABTS试剂盒说明。以Trolox作为标准品进行总抗氧化能力测定，以Trolox为标样（0.15 mmol/L～1.2 mmol/L）绘制标准曲线。待测样品的总抗氧化能力用Trolox当量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC） 的 物 质 的 量（mmol Trolox/L）来表示。
1.6.5 Tricine-SDS-PAGE分析
配制小龙虾副产物多肽干粉溶液，按体积比1∶1与2×Tricine多肽上样缓冲液混合，100℃煮沸3min～5min，冷却后上样。其他溶液的配制及具体操作参照Tricine-SDS-PAGE电泳试剂盒说明书。
1.6.6 柱层析纯化分离酶解液
采用AKTA prime Plus蛋白纯化系统分离小龙虾副产物多肽抗氧化组分。根据文献[7]方法改良，使用0.22 μm微膜过滤样品后通过注射器注射至纯化系统，1 mL小龙虾副产物多肽样品液进入AKTA蛋白纯化系统，经过含有Toyopearl HW-40S填料的INLK1660M肽柱。用H2O以0.5 mL/min的流速平衡洗脱，在4℃280 nm波长下检查洗脱情况，洗脱液组分自动收集到10 mL试管中，每管5 mL。
1.7 数据处理
所有数据均平行测定3次，试验结果以平均值±标准差来表示。使用Excel 2016软件作图。使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），不同字母表示具有显著差异（p<0.05），**表示具有极显著差异（p<0.01）。
2 结果与分析
2.1 小龙虾副产物基本营养成分分析
小龙虾副产物冻干粉中基本营养成分测定结果如表4所示。
表4 小龙虾副产物一般营养成分
Table 4 General nutrients composition in crayfish by-products%
水分 灰分6.46±0.11 60.34±0.59脂肪0.01±0.00粗蛋白 其他18.70±0.65 14.50±0.01
由表4可知，小龙虾副产物冻干粉的水分、灰分、脂肪、粗蛋白含量分别为（6.46±0.11）%、（60.34±0.59）%、（0.01±0.00）%、（18.70±0.65）%，可见，小龙虾副产物是一种高蛋白低脂肪产品，较高的灰分含量可能是因其含有丰富的甲壳素、钙等矿物质。小龙虾副产物是一种可以开发利用的优质营养源。
2.2 不同蛋白酶对蛋白得率的影响
针对目前常用的几种蛋白酶，胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶对小龙虾副产物进行水解，提取粗蛋白，不同蛋白酶对蛋白得率的影响见图1。
图1 不同蛋白酶对蛋白得率的影响
Fig.1 Effect of trypsin，neutral protease，papain and alcalase on preparation yield of protein
不同字母表示具有显著差异（p<0.05）。
根据蛋白得率的结果（图1）可知，胰蛋白酶和碱性蛋白酶对虾副产物中的粗蛋白提取率较高，提取小龙虾副产物蛋白的得率分别为（44.39±0.70）%、（43.09±0.45）%。胰蛋白酶中含有多种蛋白酶，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰糜蛋白酶等，这些蛋白酶能够共同发挥作用，酶切位点多，所以胰蛋白酶用于第二步对小龙虾副产物粗蛋白进行酶解，第一步的酶解选用碱性蛋白酶，价格低廉，反应调节易控制[8-9]。洪瑶等[10]确定了碱性蛋白酶为虾加工副产物的最佳水解酶，在最优条件下蛋白提取率为68.76%；胡川等[11]也同样用碱性蛋白酶酶解虾壳，蛋白提取率最高可达61.9%；时丽霞[12]发现酶解克氏原螯虾虾肉制备活性肽的最适酶是碱性蛋白酶，而酶解克氏原螯虾虾壳的最适酶则为胰蛋白酶。本研究中选用碱性蛋白酶作为第一步水解酶提取虾壳中粗蛋白，而胰蛋白酶作为第二步水解酶提取虾壳蛋白中多肽。
2.3 酶解条件对蛋白得率影响
2.3.1 碱性蛋白酶用量对蛋白得率的影响
碱性蛋白酶用量对虾副产物中蛋白得率的影响如图2所示。
图2 蛋白酶用量对蛋白得率的影响
Fig.2 Effect of protease dosage on preparation yield of protein
由图2可知，当碱性蛋白酶用量较低时，蛋白得率随酶用量增加呈上升趋势；当酶用量达到2%时，蛋白得率达到最大值，说明酶用量足以与底物完全结合；当酶用量超过2%时，蛋白得率呈下降趋势，没有更多的底物与酶结合。蛋白酶在水解蛋白质的同时，也水解掉与蛋白质相连的物质，能有效提高蛋白的提取率；但若底物与酶的结合位点饱和，加入过量的酶，蛋白的提取率也不会升高。蛋白酶作为一种蛋白质，本身也会以底物的形式与酶结合，和真正的底物进行竞争，导致蛋白得率下降[9，13]。
2.3.2 酶解时间对蛋白得率的影响
酶解时间对蛋白得率的影响如图3所示。
由图3可知，酶解时间越长，蛋白得率越低，这可能是由于长时间的酶解，蛋白酶逐渐失活，也可能是由于酶解产物具有对酶的抑制作用，使水解反应终止，蛋白得率下降[13-14]。
图3 酶解时间对蛋白得率的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on preparation yield of protein
2.3.3 料液比对蛋白得率的影响
酶解过程中料液比对蛋白得率的影响如图4所示。
图4 料液比对蛋白得率的影响
Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on preparation yield of protein
由图4可知，蛋白得率随水解溶剂的增加逐渐升高并趋于平缓。这可能是由于溶剂的增多，溶解的蛋白质亦增加；继续增加溶剂，会稀释酶的浓度，降低酶解速率，使提取率有下降趋势[13-14]。
2.4 一次酶解虾副产物正交试验
基于单因素试验结果，以蛋白得率为指标，通过L9（33）正交试验对虾副产物中蛋白的提取进行优化。正交试验结果如表5所示。
表5 一次酶解虾副产物蛋白得率正交试验结果
Table 5 Orthogonal array results for the preparation yield of protein in primary enzymatic hydrolysis
试验号 A酶用量 B酶解时间 C料液比 蛋白得率/%1 1 1 1 31.12 2 1 2 2 29.77 3 27.68 4 2 1 2 59.49 1 3 3 5 46.62 6 2 3 1 39.49 2 2 3 7 62.15 8 3 2 1 30.11 3 1 3 9 3 3 2 33.37 K1 29.523 50.920 33.573 K2 48.533 35.500 40.877 K3 41.877 33.513 45.483 R 19.010 17.407 11.910最优水平 A2B1C3
由表5可知，各因素影响碱性蛋白酶水解虾副产物的蛋白得率主次关系为A＞B＞C，即酶用量＞酶解时间＞料液比。正交试验的最优组合为A2B1C3，即酶用量为 2%，酶解时间为 2 h，料液比为 1∶20（g/mL），此条件下测得虾副产物蛋白得率为64.32%，高于表5中9组试验的蛋白得率，与正交试验结果相吻合。
2.5 二次酶解虾副产物蛋白正交试验
根据前期试验基础，用胰蛋白酶对虾副产物蛋白进行二次酶解。以蛋白水解度为指标，通过L9（33）正交试验对虾副产物蛋白进行二次酶解工艺优化。正交试验结果见表6。
表6 二次酶解虾副产物蛋白水解度正交试验结果
Table 6 Orthogonal array results for the hydrolysis degree of protein in secondary enzymatic hydrolysis
试验号 A酶用量 B酶解时间 C料液比 水解度/%1 1 1 1 10.88 2 1 2 2 10.96 3 1 3 3 31.90 4 2 27.30 5 2 2 3 17.83 2 1 6 1 11.32 7 3 1 3 15.04 2 3 8 1 15.79 9 3 3 2 21.21 3 2 K1 17.913 17.740 12.633 K2 18.817 14.860 19.823 K3 17.347 21.477 21.590 R 1.470 6.617 8.927最优水平 A2B3C3
由表6可知，各因素影响胰蛋白酶酶解虾副产物蛋白水解度的主次关系为C＞B＞A，即料液比＞酶解时间＞酶用量。正交试验的最优组合为A2B3C3，即酶用量为 2%，酶解时间为 4 h，料液比为 1∶15（g/mL），在此条件下的虾副产物蛋白水解度为45.2%，高于表6中9组试验的水解度。
2.6 酶解多肽总抗氧化性评价
酶解多肽总抗氧化能力如图5所示。
由图5可知，在试验浓度范围内，虾副产物酶解物的抗氧化能力与其浓度呈线性关系。随着酶解程度的加深，其总抗氧化能力随之增强，低分子量的酶解产物抗氧化性能强于高分子量的酶解产物；经二次酶解后的产物明显比一次酶解产物的总抗氧化性强。抗氧化肽一方面可以直接清除自由基或者抑制自由基的产生，其抗氧化活性与多肽分子的大小及氨基酸分子的组成、排列顺序有关，大多数抗氧化活性强的肽分子量小于3 000 Da；另一方面利用间接途径，通过作用于抗氧化酶，加强抗氧化酶对自由基的清除能力或抑制氧化酶的活性。抗氧化肽可以通过清除自由基，减少自由基对抗氧化酶的损伤、加强抗氧化酶的表达，促进抗氧化酶的产生、修复受损的抗氧化酶、抑制氧化酶的表达等方式来提高抗氧化酶活性[15-18]。
图5 酶解产物的总抗氧化能力
Fig.5 Total antioxidant capacity of enzymatic hydrolysates
**表示具有极显著差异（p<0.01）。
2.7 酶解多肽蛋白层析
酶解多肽液层析分离图谱见图6。
图6 酶解多肽液层析分离图谱
Fig.6 Elution diagram of enzymolysis polypeptide
1～10代表收集到的组分。
在含有Toyopearl HW-40S填料的INLK1660M肽柱的洗脱液中（280 nm）共收获10份多肽液，收集各组分后调整浓度（100μg/mL）相同。各组分总抗氧化性结果如图7所示。
图7 酶解多肽液各组分总抗氧化能力
Fig.7 Total antioxidant capacity of elution fractions from enzymolysis polypeptide
不同字母表示具有显著差异（p<0.05）。
由图7可知，与空白对照相比，组分3表现出最强的总抗氧化性。经过两次酶解，逐步将小龙虾副产物中的蛋白提取并水解成多肽，并且测定出其具有一定的生物活性，若进一步分离纯化出活性最强的组分，并分析多肽结构及活性机理，可以为水产品精深加工产业链的延伸提供一定科学参考。有研究表明，贻贝与合浦珠母贝的肌肉被碱性蛋白酶水解并使用超滤膜及柱层析纯化分离获得小于5 kDa的活性肽，具有一定的抗氧化性及成骨性[19-20]。可见，对水产品中活性肽的提取纯化，有一定的研究价值。
2.8 酶解产物Tricine-SDS-PAGE分析
对小龙虾副产物两次酶解产物进行Tricine-SDSPAGE分析，蛋白图谱如图8所示。
图8 酶解产物Tricine-SDS-PAGE图谱
Fig.8 Tricine-SDS-PAGE diagram of enzymatic hydrolysates
由图8可知，小龙虾副产物碱性蛋白酶一次酶解后仍有大分子蛋白存在，多集中于14 kDa；经胰蛋白酶二次酶解之后得到的多肽相对分子质量主要集中在3.3 kDa以下，说明用两步酶解作用之后小龙虾副产物中的大分子质量蛋白被降解成为小分子肽。唐志红等[9]利用胰酶（其中胰蛋白酶，4×103U/g）直接水解小龙虾副产物分离蛋白制备抗氧化肽，酶解多肽的分子质量主要集中在3.3 ku以下，且紫外-可见光谱分析表明酶解产物210 nm附近有特征吸收峰，说明用胰酶作用之后小龙虾副产物中的大分子质量蛋白质被降解成为小分子肽。
2.9 酶解多肽氨基酸组成分析
小龙虾副产物多肽中氨基酸组成如表7所示。
表7 小龙虾副产物多肽氨基酸组成
Table 7 Types and contents of amino acids in crayfish byproducts polypeptides
注：样品为冻干粉，必需氨基酸为 Thr、Val、Met、Ile、Leu、Trp、Phe、Lys，呈味氨基酸为 Asp、Glu、Ser、Gly、Thr、Ala。
氨基酸氨基酸含量/（mg/g）相对百分含量/%天冬氨酸（Asp） 14.68±2.62 4.92±0.01谷氨酸（Glu） 22.23±4.03 7.45±0.02丝氨酸（Ser） 6.61±1.15 2.22±0.01精氨酸（Arg） 12.95±2.35 4.34±0.02甘氨酸（Gly） 7.73±1.37 2.59±0.01苏氨酸（Thr） 6.70±1.23 2.25±0.01脯氨酸（Pro） 6.84±1.23 2.29±0.00丙氨酸（Ala） 10.47±1.90 3.51±0.01缬氨酸（Val） 0.72±0.25 0.24±0.04甲硫氨酸（Met） 10.38±2.13 3.47±0.09半胱氨酸（Cys） 2.68±0.65 0.89±0.06异亮氨酸（Ile） 7.07±1.29 2.37±0.02亮氨酸（Leu） 10.40±1.87 3.49±0.01色氨酸（Trp） 4.98±0.66 1.73±0.49苯丙氨酸（Phe） 9.92±2.34 3.31±0.21组氨酸（His） 14.29±2.48 4.79±0.05赖氨酸（Lys） 141.74±25.63 47.52±0.07酪氨酸（Tyr） 7.86±1.61 2.63±0.07氨基酸总量（TAA） 298.23±53.49必需氨基酸（EAA） 191.90±34.12 64.36±0.15非必需氨基酸（NEAA） 106.32±19.38 35.64±0.15呈味氨基酸 68.42±12.30 22.94±0.01
由表7可知，小龙虾副产物经二次酶解后检测出18种氨基酸。氨基酸总含量为（298.23±53.49）mg/g，其中必需氨基酸为（191.90±34.12）mg/g，占氨基酸总量的（64.36±0.15）%，呈味氨基酸含量占总氨基酸的（22.94±0.01）%。赵利等[13]用碱性蛋白酶一次水解克氏原螯虾副产物蛋白肽，其中必需氨基酸比例为47.4%，但呈味氨基酸含量相对较高，占总氨基酸的40.9%，可以用来开发海鲜调味品。
3 结论
两步酶解法制备小龙虾副产物多肽，即先用2%碱性蛋白酶，酶解 2 h，料液比 1∶20（g/mL），酶解温度55℃、pH8.5，获得虾副产物蛋白；再用胰蛋白酶二次酶解虾副产物蛋白，胰蛋白酶用量2%、酶解4 h、料液比 1∶15（g/mL），酶解温度 37 ℃、pH8.0 的条件下，虾副产物蛋白水解度为45.2%。二次酶解产物比一次酶解产物的总抗氧化性强；二次酶解多肽的分子质量主要集中在3.3 kDa以下；多肽中含有18种氨基酸，必需氨基酸占总氨基酸的（64.36±0.15）%。本研究在丰富小龙虾副产物多肽制备方法的同时，为虾副产物制备多肽的产业化提供了一定的理论指导和科学依据。
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