膳食纤维（dietary fiber，DF）主要是植物的细胞壁多糖，不能被人体消化道的内源酶消化[1]。膳食纤维通常分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF），主要包括纤维素、木质素和非淀粉多糖[2]（如半纤维素、果胶和阿拉伯木聚糖低聚糖）。膳食纤维在人体小肠内不能被消化吸收，故其能够以基本完整的形式进入结肠，从而增加粪便的黏度和体积[3]。饮食干预研究表明，补充膳食纤维可以有益地改变肠道的微生物群，保护肠道屏障功能，对维持机体正常生理功能具有重要作用[4-5]。
生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科植物，在世界各地被用作香料[6]、调味品[7]和传统草药[8]。生姜中主要含有淀粉、脂肪、蛋白质、纤维素、维生素等多种成分[9]。生姜加工过程中剩余的姜渣中含大量的膳食纤维，但由于主要成分是不溶性膳食纤维，姜渣与蛋白、淀粉等结合程度较差，不利于作为食品原料进行加工，从而导致其利用率较低。通过利用酸碱化学法[10]、酶法[11]、生物发酵法[12]等方法对果蔬残渣进行改性处理，可以有效提高果蔬残渣中可溶性膳食纤维含量，增加了果蔬残渣作为食品原料的可操作性[13]。微生物发酵法改性果蔬残渣中膳食纤维是一种相对高效且低成本的手段[14]。因此，本文采用保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌复合菌种发酵改性姜渣膳食纤维，以提高姜渣中可溶性膳食纤维的含量，制备高品质的姜渣膳食纤维，提高姜渣的利用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 试验材料与试剂
山东泥姜：市售；脱脂奶粉：雀巢（中国）有限公司；果葡糖浆：邢台平安糖业有限公司；保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌（商业冻干粉100亿cfu/g，食品级）：郑州百益宝生物技术有限公司。
1.1.2 试验设备
破壁机（L12-Y3）：九阳股份有限公司；纱布：常州富羽莱贸易有限公司；智能恒温培养箱（HW-80）：辽宁赛亚斯科技有限公司；电热恒温干燥箱（DHG-9203A）：甘易仪器设备（上海）有限公司；高压灭菌锅（BKQ-B50II）：鑫贝西科学仪器（山东）有限公司；高速离心机（TGL-16）：浙江纳德科学仪器有限公司；X射线衍射（X’Pert MP）：荷兰Nalytical公司；扫描电镜（SU8220）：日本日立公司；固体核磁共振（Bruker AVANCE III 400 WB）：瑞士布鲁克公司。
1.2 姜渣发酵过程
取一定量的山东泥姜，切碎。称取500 g姜碎和2 000 mL 蒸馏水，用破壁机搅碎（20 min），煮沸 5 h，用纱布（4层）过滤。过滤后得到的姜渣在60℃下干燥48 h。称取干燥姜渣5.0 g和蒸馏水按照一定的料液比调配均匀，将脱脂奶粉1.0 g和果葡糖浆1.0 g加入到液料中，搅拌溶解，装于发酵罐中，置于高压灭菌锅中，120℃灭菌20 min。冷却后，接种2%保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌（1∶1，质量比），在一定条件下进行发酵，发酵结束后，加入样本3倍体积的95%乙醇，静置12 h，过滤并收集滤渣。将滤渣在60℃下干燥24 h，即得到改性后的姜渣。
1.3 单因素试验
根据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》[15]，以姜渣中可溶性膳食纤维（SDF）得率为考察指标，分别对发酵温度、发酵时间、料液比3个因素进行单因素试验。初步确定复合菌种发酵姜渣的最佳工艺条件。
1.4 响应面优化发酵工艺提高姜渣SDF得率
采用Design-Expert 12.0软件中Box-Behnken试验设计方案，根据前期试验研究结果，选取发酵时间（A）、发酵温度（B）和料液比（C）3个条件进行响应面优化，试验安排见表1。
表1 响应面设计因素水平
Table 1 The factors and levels of response surface for ginger dregs
水平A发酵时间/hB发酵温度/℃C料液比/（g/mL）-1 46 40 1∶8 0 48 42 1∶10 1 50 44 1∶12
1.5 发酵对姜渣加工性能及结构的影响
1.5.1 姜渣持水力的测定
取发酵前后的姜渣各1.00 g分别置于100 mL烧杯中，分别加入50 mL蒸馏水，在室温（27℃）下用磁力搅拌器搅拌30 min，4 000 r/min离心20 min，除去上层水分，称取残留物的质量（g），按照式（1）计算持水力，并比较两者之间持水力的变化。
1.5.2 姜渣溶胀力测定
取发酵前后的姜渣各1.00 g，加入20 mL量筒中，摇动样品，使其在量筒中平铺均匀，记录下此时干样品的体积（mL），分别加入10 mL蒸馏水，均匀振荡后，在室温（25℃）下静置24 h后，分别记录此时样品的体积（mL），比较两者溶胀力的变化并按式（2）计算。
1.6 发酵对姜渣的形貌及结构的影响
1.6.1 光学显微镜（optical microscope，OPM）观察
取少量发酵前后的姜渣置于凹槽载玻片上，用乙醇∶甘油（2∶1，体积比）分散，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。
1.6.2 扫描电镜（scanningelectronmicroscope，SEM）观察
取发酵前后的姜渣，用棉棒沾取少量，分别放于导电胶上，喷镀，采用SEM观察。
1.6.3 X-射线衍射（X-ray diffraction，XRD）测定
XRD的主要扫描参数如下：Cu靶，测试电压40kV，电流 40 mA；扫描速度 2°/min，扫描范围 3°～40°。
1.6.4 13C固体核磁共振波谱（solid-state nuclear magnetic resonance spectrometer，CP MAS NMR）测试
13C CP MAS NMR测试的操作频率为75.5 MHz。样品放入4 mm的ZrO2回转管中，转速是5 kHz，补偿时间20 ms，接触时间1 ms，2个脉冲之间延迟3 ms。
1.7 数据处理
试验数据均平行测定3次，以平均值±标准差的方式表示最终的结果。数据采用origin 9.0统计软件进行分析。响应面试验数据采用Design-Expert 12.0进行分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 发酵温度对姜渣中SDF得率的影响
准确称取5.0 g未发酵的姜渣置于50 mL发酵培养液中，在发酵液料中加入2%的发酵剂，然后分别在38、40、42、44、46 ℃的培养温度下培养 48 h，测定 SDF得率，结果如图1所示。
图1 发酵温度对姜渣中SDF得率的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of SDF in ginger dregs
由图1可知，随着发酵温度的逐渐升高，SDF得率不断增加，当发酵温度为42℃时，姜渣中SDF得率达到最大。发酵温度继续增加，SDF得率显著下降，这可能是因为过高的发酵温度抑制了复合菌种的反应活性。因此，选择42℃为最佳发酵温度。
2.1.2 发酵时间对姜渣中SDF得率的影响
准确称取5.0 g未发酵的姜渣置于50 mL发酵培养液中，在发酵液料中加入2%的发酵剂，在42℃下分别培养 24、36、48、60、72、84 h，测定 SDF 得率，结果如图2所示。
图2 发酵时间对姜渣中SDF得率的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of SDF in ginger dregs
由图2可知，姜渣中SDF得率随发酵时间的增加先增加后减少，在48 h达到最大值。处于较短的发酵时间时，菌种处于生长期，菌种的数量和活力均较低。随着发酵时间的增加，菌种生长到达稳定期，姜渣中SDF得率逐渐达到最大值。持续发酵后，菌种的活力下降，发酵产生的次级代谢产物不断增加，部分SDF被分解，造成得率下降。因此，选择48h为最佳的发酵时间。
2.1.3 料液比对姜渣中SDF得率的影响
按照料液比 1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）将未发酵的姜渣与发酵液混合，分别在液料中加入2%的发酵剂，在42℃下培养48 h，测定SDF得率，结果如图3所示。
图3 料液比对姜渣中SDF得率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of SDF in ginger dregs
由图3可知，随着溶剂添加量增加，菌种与姜渣的接触更加充分，姜渣中SDF得率增加，在料液比为1∶15（g/mL）时达到最大值。但当溶剂添加量大于1∶10（g/mL）后，姜渣中SDF的含量变化趋势平缓后下降，可能是由于随着水体积的继续增大，反应底物被稀释。因此，选择1∶10（g/mL）为最佳发酵液料比。
2.1.4 响应面结果与分析
根据单因素试验结果，选取发酵时间、发酵温度、料液比3个因素的最优试验条件，采用Box-Benhnken试验设计对姜渣发酵条件进行3因素3水平的响应面分析试验，包括17个析因试验和5个中心试验。运用Design-Expert 12.0软件中Box-Behnken程序对各个试验点的响应值进行回归分析，试验结果见表2。利用ANOVA分析表2数据，结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计及相应结果
Table 2 Box-Behnken design and the experimental results
标准序 运行序 A发酵时间 B发酵温度 C料液比 SDF得率/%1 1 -1 -1 0 8.96 9 2 0 -1 -1 8.96 15 3 0 0 0 9.42 14 4 0 0 0 9.43 5 5 -1 0 -1 9.08 17 6 0 0 0 9.42 3 7 -1 1 0 9.05 6 8 1 0 -1 9.15 13 9 0 0 0 9.41 16 10 0 0 0 9.40 8 11 1 0 1 9.22 10 12 0 1 -1 8.97 4 13 1 1 0 9.14 2 14 1 -1 0 9.12 11 15 0 -1 1 8.96 7 16 -1 0 1 9.13 12 17 0 1 1 9.11
表3 回归方程中回归系数的估计值及方差分析
Table 3 Results of the Box-Behnken design regression analysis
注：P值<0.01时表示差异性极显著；P值<0.05时表示差异性显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 0.497 7 9 0.055 3 233.91 <0.000 1 A发酵时间 0.021 0 1 0.021 0 88.87 0.000 2 B发酵温度 0.009 1 1 0.009 1 38.54 0.000 4 C料液比 0.008 5 1 0.008 5 35.74 0.000 6 AB 0.001 2 1 0.001 2 7.18 0.047 0 AC 0.000 1 1 0.000 1 2.42 0.136 2 BC 0.004 9 1 0.004 9 20.73 0.002 6 A2 0.041 9 1 0.041 9 177.20 <0.000 1 B2 0.252 2 1 0.252 2 1 066.80 <0.000 1 C2 0.117 8 1 0.117 8 498.16 <0.000 1残差 0.001 7 7 0.000 2失拟项 0.001 4 3 0.000 5 3.53 0.127 5误差项 0.000 3 4 0.000 1总和 0.499 4 16
该试验回归方程为：R1=9.412+0.05125A+0.03375B+0.032 5C-0.017 5AB+0.005AC+0.035BC-0.099 75A2-0.247 5B2-0.176 725C2。
该模型的复相关系数的平方R2=99.63%，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小，可以用该方程进行模拟分析。失拟项的P=0.127 5，没有显著性影响，信噪比为15.838远大于4，说明数据中没有异常点，回归方程拟合度和可信度较高，模型适当。
通过表3中P值可知：方程中A2、B2、C2对SDF得率的影响达到极显著水平，BC、AB为影响显著，表明试验因子的二次项对响应值影响较大，这和模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。当姜渣SDF得率最大时，A=0.021；B=0.01；C=0.01；从而分析得到姜渣发酵的最佳工艺条件为发酵温度42.02℃，发酵时间48.01 h，料液比 1∶10.01（g/mL），得到姜渣 SDF 得率为9.416%。根据实际操作性，发酵工艺采用发酵温度42 ℃、发酵时间 48 h、料液比 1∶10（g/mL），实际测得SDF得率为9.42%，两者相对误差很小。因此，Box-Behnken试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。
各个因子交互作用的响应面的3D和等值线分析如图4～图6所示。
图4 发酵时间和发酵温度对SDF得率响应面分析
Fig.4 The analysis on response surface of fermentation time and fermentation temperature
图5 发酵时间和料液比对SDF得率响应面分析
Fig.5 The analysis on response surface of fermentation time and solid-liquid ratio
图6 发酵温度和料液比对SDF得率响应面分析
Fig.6 The analysis on response surface of fermentation temperature and solid-liquid ratio
由图4可知，图形略呈椭圆形，说明发酵时间和发酵温度的具有一定的交互作用。发酵温度的轴向等高线变化比发酵时间轴向等高线的变化相对密集。因此，发酵温度对响SDF得率的影响较发酵时间影响大。
由图5可知，当发酵温度位于中心水平时，图形呈圆形，发酵时间和发酵温度的交互作用不强。
由图6可知，图形呈现椭圆形，说明发酵时间和料液比的交互作用显著。发酵温度的轴向等高线的密集程度显著高于料液比轴向等高线的变化。因此，发酵温度对SDF得率的影响较料液比影响大。
2.2 发酵对姜渣加工性能及结构的影响
2.2.1 发酵对姜渣持水力和溶胀力的影响
发酵对姜渣持水力和溶胀力的影响如表4所示。
表4 发酵对姜渣的膨胀力和持水力的影响
Table 4 Effect of fermentation on swelling power and water holding capacity of ginger dregs
注：每一列字母不同表示差异显著。
样品膨胀力/（mL/g）持水力/（g/g）发酵前姜渣 6.23±0.12a 9.53±0.71d发酵 48 h 后姜渣 8.47±0.53ab 10.48±0.37a
由表4可知，发酵后姜渣的膨胀力和持水力分别增加了35.96%和9.97%。姜渣中含有大量的膳食纤维素。这些膳食纤维素存在着无定形区，当吸水后，无定区变大，膳食纤维表现出膨胀。膳食纤维的大分子中含有许多—OH，可以与H2O分子形成配位键，形成持水力。发酵后姜渣的膨胀力和持水力均提高，说明发酵促使姜渣中形成了更多聚合度低、具有无定型结构的可溶性膳食纤维，同时，姜渣膳食纤维的结构更加疏松，更多亲水基团（如—OH）暴露出来。姜渣的持水力增加，加工性能提升，可用于食品工业中食品品质改性，如改善食品黏度与质构特性等。
2.2.2 发酵对姜渣结构的影响
在光学显微镜下观察发酵对姜渣结构的影响，结果如图7所示。
图7 姜渣发酵前和发酵后的显微镜图片（20×20倍）
Fig.7 The microscope images of ginger dregs before fermentation and after fermentation
从图7可以看出，发酵前姜渣中的纤维素等交错重叠，呈现面积较大的团聚物。发酵后，团聚物体积减小，纤维结构的交错减少，碎片结构增加。发酵促使姜渣的团聚减小、比表面积增大，增加了纤维中的亲水基团暴露率，提高姜渣的持水力和膨胀力。
2.2.3 发酵对姜渣微观结构的影响
在扫描电镜下观察发酵对姜渣微观结构的影响，结果如图8所示。
图8 姜渣发酵前后的SEM图片
Fig.8 SEM images of ginger dregs before and after fermentation
图8A1～A2显示了未发酵的姜渣有完整清晰的纤维结构，纤维聚集在一起，形成网络空腔结构，团聚的颗粒表面也具有大量褶皱。图8B1～B2显示，发酵在一定程度上分解了姜渣纤维的微结构、切断其大分子结构，形成了分子量较小、链长较短的结构。图8B2显示发酵后姜渣中的物质干燥后粘结成片层状，说明水溶性物质增多，样品干燥后更易粘结。
2.2.4 发酵对姜渣晶体结构的影响
在XRD下观察发酵对姜渣晶体结构的影响，结果如图9所示。
图9 姜渣发酵前后的XRD图片
Fig.9 XRD pictures of ginger dregs before and after fermentation
图9显示，姜渣发酵后，14°和16°左右的峰消失，说明姜渣中体积较大的晶体结构减少。20°和22°的峰的分辨率下降，说明发酵后姜渣中无定型物质（如SDF等）增加。
2.2.5 发酵对姜渣13C CP MAS NMR图谱的影响
在13C CP MAS NMR下观察发酵对姜渣晶体结构的影响，结果如图10所示。
图10 姜渣发酵前后的13C CP MAS NMR图片
Fig.10 13C CP MAS NMR images of ginger dregs before and after fermentation
由图10可知，发酵前姜渣的结构中C1的信号峰位于 92×10-6～108×10-6；C2、C3 和 C5 的信号峰出现在65×10-6～75×10-6之间；C4 和 C6 的信号峰则分别位于75×10-6～85×10-6和 55×10-6～62×10-6处。发酵对姜渣的核磁共振图谱的分辨率的差异主要在C1位置。姜渣经过发酵处理后，C1位置出现了两个显著的峰形，说明发酵后纤维的聚集程度降低，结构更加松散，原本重叠的信号峰被区分出来。
3 结论
采用接种2%复合菌种，发酵制备姜渣SDF的最佳工艺参数如下：发酵温度42℃、发酵时间48 h、料液比1∶10（g/mL），该条件下发酵姜渣中SDF的得率为9.42%。发酵后的姜渣的SDF含量显著提升，膨胀力和持水力增加。通过显微观察和结构测定发现发酵后姜渣的表面结构改变，无定型物质增多，膳食纤维结构更加规整。乳酸菌复合发酵法可以提高姜渣中SDF的含量，但是对于发酵后姜渣膳食纤维的物质组成及结构变化有待进一步研究。
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