黑木耳（Auricularia auricular）又名云耳，因其性平、味甘，是药食两用食用菌之一[1]。黑木耳多糖（Auricularia auricular polysaccharides，AAP） 是黑木耳中含有的活性成分之一，具有肿瘤抑制[2]、免疫力调节[3-4]、降脂[5]、抗氧化[6]、调节血糖、抗衰老、抗突变、抗炎、抗细菌等作用。
近年来，在黑木耳多糖提取方法及工艺优化方面有大量研究[7]报道。主要有热水提取法、酶提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等[8-13]，他们或多或少都有缺点，如热水提取法存在得率低、提取时间长、能耗高等缺点[13]；酶提取法存在得率偏低、提取时间长等缺点；微波辅助提取法存在有限的穿透深度和不显著的传质功能等缺点；超声波辅助提取法存在热效应不显著和空化泡范围存在局限等缺点[14]。酶解技术是利用酶反应具有的专一性特点，破坏植物细胞壁，加速活性成分的溶出。超高压技术是在高压条件下使其物理、化学性质迅速发生改变的非热加工技术，在一定程度上破坏其生物组织，促进活性物质从细胞内溶出，进而提高活性成分的得率，具有高效、快速、低能、环保等优点[15]。本试验采用复合酶协同超高压辅助法提取AAP，首先通过复合酶处理提取，然后再进行超高压辅助提取，此法是一种得率高、提取温度低、提取时间短、能耗低、对活性成分损伤小的新型天然产物提取技术[16-17]，近年来，利用复合酶协同超高压法提取AAP的研究尚未见报道。因此，本研究旨在为AAP的提取提供一种新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑木耳：市售；纤维素酶（20 000 U/g）：河北利华生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：陕西源优生物科技有限公司；柠檬酸、葡萄糖、硫酸、无水乙醇、苯酚、磷酸氢二钠（均为分析纯）：四川佰春科技有限责任公司。
1.2 仪器与设备
UHP900×2-Z型超高压处理设备：包头文天科技有限责任公司；RE-3000A旋转蒸发器：上海耀特仪器设备有限公司；760CRT紫外-可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PE-28酸度计：北京梅特勒-托利多仪器有限公司；D2015W电动搅拌器：上海梅颖浦仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 复合酶协同超高压法提取AAP
黑木耳→烘干→粉碎（过80目筛）→黑木耳粉→加入料液比为1∶30（g/mL）的水，混合均匀→调节pH值（柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液）→按照酶解工艺条件进行复合酶法提取→取出装入真空袋中、密封→置于超高压设备中超高压提取→得到提取液（里面含有大量的胶状物质，主要为蛋白和多糖）→经Sevag法[18]脱蛋白→离心（5 000 r/min，10 min）→取上清液减压浓缩→醇沉（3倍体积95%的乙醇溶液）→静置（4℃冰箱，24 h）→离心（5 000 r/min，10 min）→取沉淀进行真空干燥→黑木耳粗多糖。
1.3.2 AAP含量的测定
采用池源等[19]苯酚-硫酸法进行测定。每次测定时，先制作标准曲线（以葡聚糖为标准），根据标准曲线计算AAP的含量。
1.3.3 AAP得率的计算采用文献[20-21]中的公式计算AAP得率。
式中：c为由标准曲线计算得出的AAP质量浓度，mg/mL；V 为定容体积，mL；N 为稀释倍数；m 为黑木耳干粉质量，g。
1.3.4 复合酶协同超高压法提取AAP试验设计
1.3.4.1 复合酶法提取AAP单因素试验设计
准确称取10 g黑木耳粉5份，利用缓冲液（pH值为8.0磷酸氢二钠、pH值为3.0的柠檬酸）分别调节黑木耳料液 pH 值为 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，复合酶（纤维素酶∶木瓜蛋白酶质量比为1∶1，根据预试验，复合后的酶解最适pH值在6左右）添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，酶解温度为 30、40、50、60、70℃，酶解时间为 20、30、40、50、60 min 的条件下，按 1.3.1 方法中酶解工艺条件进行复合酶法提取工艺单因素试验，测定并计算AAP得率，其余条件不变，分析上述4个因素对AAP得率的影响，每组试验重复测定3次，取平均值。
1.3.4.2 复合酶法提取AAP正交试验设计
在预试验和单因素试验的基础上，选取表1所列的4个因素，采用L9（34）进行正交试验优化。
表1 复合酶法正交试验因素水平
Table 1 Orthogonal assay factor level by compound enzyme method
水平D酶解时间/min 1 2.0 5.5 40 40 2 2.5 6.0 50 50 3 3.0 6.5 60 60因素A复合酶添加量/%B酶解pH值C酶解温度/℃
1.3.4.3 复合酶协同超高压法提取AAP单因素试验
准确称取10 g黑木耳粉5份，经复合酶法提取后，取出再装入真空袋中密封后，置于超高压设备中进行超高压提取，分别设置压力为 200、300、400、500、600 MPa，料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），提取温度为 30、40、50、60、70 ℃，保压时间为 2、4、6、8、10 min，按1.3.1方法中超高压工艺条件进行超高压提取，测定并计算AAP得率，其余条件不变，分析上述4个因素对AAP得率的影响，每组试验重复测定3次，取平均值。
1.3.4.4 复合酶协同超高压法提取AAP正交试验设计
在预试验和单因素试验基础上，选取表2所列的4个因素，采用L9（34）正交试验进行优化。
表2 复合酶协同超高压法正交试验因素水平
Table 2 The level of orthogonal test factors of compound enzyme-assisted ultra-high pressure method
水平D保压时间/min 1 1∶20 300 40 4 2 1∶30 400 50 6 3 1∶40 500 60 8因素A料液比/（g/mL）B压力/MPa C提取温度/℃
1.3.5 数据处理
试验数据采用Excel整理，采用正交设计助手进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 复合酶法提取AAP单因素试验
2.1.1 复合酶添加量对AAP得率的影响
复合酶添加量对AAP得率的影响见图1。
图1 复合酶添加量对AAP得率的影响
Fig.1 Effect of compound enzyme addition on the AAP extraction rate
由图1可知，当复合酶添加量≤2.5%时，AAP得率随着复合酶添加量的增加而逐渐升高，当复合酶添加量>2.5%后，得率变化不明显。这是因为，增加复合酶添加量，酶解更充分，多糖溶出增多，AAP得率升高。当复合酶添加量达到2.5%后，酶解反应基本完全，再继续增加复合酶添加量，AAP得率无明显变化并趋于稳定。故取2.5%为最佳复合酶添加量。
2.1.2 酶解pH值对AAP得率的影响
酶解pH值对AAP得率的影响见图2。
图2 酶解pH值对AAP得率的影响
Fig.2 Effect of enzymolysis pH value on the AAP extraction rate
由图2可知，AAP得率随着酶解pH值的升高呈先升高再降低的趋势，当酶解pH值为6.0时，AAP得率达到最大，随酶解pH值继续增大，AAP得率反而降低。这是因为，纤维素酶和木瓜蛋白酶复合后的最适pH值在6.0左右，因此pH值为6.0时，复合酶活性最高，酶解最充分，AAP得率也最高，pH值降低或升高，AAP得率均降低。故取6.0为最佳酶解pH值。
2.1.3 酶解温度对AAP得率的影响
酶解温度对AAP得率的影响见图3。
图3 酶解温度对AAP得率的影响
Fig.3 EffectofenzymolysistemperatureontheAAPextractionrate
由图3可知，AAP得率随着酶解温度的升高先升高再降低。这是因为，随着酶解温度的升高，酶活性逐步增强，酶解反应加快，多糖溶出增多，AAP得率升高；当酶解温度>50℃后，酶活性降低，再继续增加酶解温度，会导致部分酶会失去活性，AAP得率降低。故取50℃为最佳酶解温度。
2.1.4 酶解时间对AAP得率的影响
酶解时间对AAP得率的影响见图4。
由图4可知，AAP得率随着酶解时间的增加而逐步升高并趋于稳定，当酶解时间达到50 min时，AAP得率达到最大，再延长酶解时间，AAP得率也不会明显升高而趋于稳定。这是因为，酶解时间过短，酶解程度较低，酶解不充分，多糖溶出不多；而酶解时间达到最佳时间后，酶解已经完全，再延长酶解时间，AAP得率也不会明显升高。故取50 min为最佳酶解时间。
图4 酶解时间对AAP得率的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis time on the AAP extraction rate
2.1.5 复合酶法提取AAP正交试验结果
复合酶法提取AAP正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 复合酶法正交试验结果
Table 3 Results of the orthogonal assay by compound enzyme method
验序号D酶解时间/min 1 2.0 5.5 40 40 6.09 2 2.0 6.0 50 50 8.64 3 2.0 6.5 60 60 7.37 4 2.5 5.5 50 60 8.43 5 2.5 6.0 60 40 7.36 6 2.5 6.5 40 50 8.46 7 3.0 5.5 60 50 9.25 8 3.0 6.0 40 60 8.23 9 3.0 6.5 50 40 8.68 k1 7.367 7.923 7.593 7.377 k2 8.083 8.077 8.583 8.783 k3 8.720 8.170 7.993 8.010 R 1.353 0.247 0.990 1.406 A复合酶添加量/%B酶解pH值因素 AAP得率/%C酶解温度/℃
表4 复合酶法方差分析结果
Table 4 The variance analysis results by the complex enzyme method
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性复合酶添加量/A 2.750 2 29.570 19.000 *酶解pH值/B 0.093 2 1.000 19.000酶解温度/C 1.488 2 16.000 19.000酶解时间/D 2.978 2 32.022 19.000 *误差 0.09 2
由表3，表4的结果分析可知，4个因素的影响顺序为：D＞A＞C＞B。酶解时间和复合酶添加量对AAP得率影响较大，达到了显著水平，其他因素不显著。最佳工艺参数为：A3B3C2D2，即酶解时间50 min，复合酶添加量3%，酶解温度50℃，酶解pH值6.5。在上述最优条件下做验证试验，平行3次，得到AAP得率为9.26%（3次平均值），高于试验组A3B1C3D2的AAP得率（9.25%）。因此，选取工艺参数A3B3C2D2为复合酶法提取AAP最佳工艺。
2.2 复合酶协同超高压法提取AAP的工艺优化
在复合酶法提取AAP的最佳工艺条件下，再进一步协同超高压法提取AAP。
2.2.1 料液比对AAP得率的影响
料液比对AAP得率的影响见图5。
图5 料液比对AAP得率的影响
Fig.5 Effect of solid-liquid ration on the AAP extraction rate
由图 5 可知，当料液比为 1∶10（g/mL）～1∶30（g/mL）时，AAP得率随着溶剂的量增加而不断升高，当料液比达到 1∶30（g/mL）后，再继续增大溶剂的量，AAP 得率也不再显著变化而趋于平缓。这是因为，溶剂的量增多，黑木耳细胞内外的浓度差增大，传质速率加快，多糖溶出增多，得率升高；但溶剂量达到一定程度时，多糖溶出基本完全，再增加溶剂，AAP得率也不再明显变化。故取1∶30（g/mL）为最佳料液比。
2.2.2 压力对AAP得率的影响
压力对AAP得率的影响见图6。
图6 压力对AAP得率的影响
Fig.6 Effect of pressure on the AAP extraction rate
由图6可知，当压力≤400 MPa时，AAP得率随着压力的增加而升高，当压力>400 MPa后，再继续增加压力，AAP得率也不会明显变化。这是因为，随着压力的增加，细胞破裂程度和数量增多，多糖从细胞中的传质速率和溶出率提高，AAP得率升高；但当压力达到400 MPa后，细胞已破裂基本完全，再增加压力，AAP得率也不再明显变化。故取400 MPa为最佳压力。
2.2.3 提取温度对AAP得率的影响
提取温度对AAP得率的影响见图7。
图7 提取温度对AAP得率的影响
Fig.7 Effect of extraction temperatrue on the AAP polysaccharide yield
由图7可知，当提取温度≤50℃时，AAP得率随着提取温度的升高而升高，当提取温度>50℃后，AAP得率变化趋于平缓。这是因为，溶解度随温度升高而升高，促使多糖成分在提取溶剂中的渗透和溶出加快，得率升高，当温度>50℃后，多糖溶出基本完全，再继续增加提取温度，AAP得率不再明显变化而趋于平缓。故取50℃为最佳提取温度。
2.2.4 保压时间对AAP得率的影响
保压时间对AAP得率的影响见图18。
图8 保压时间对AAP得率的影响
Fig.8 Effect of ultra-high pressure extraction holding time on the AAP extraction rate
由图8可知，当保压时间≤6 min时，AAP得率随着保压时间的增加而升高，当保压时间>6 min后，再继续增加保压时间，AAP得率也基本不再变化。这是因为，细胞需要一定时间才能破碎，时间增加，细胞破碎增多，多糖溶出增多，AAP得率升高，当保压时间超过6 min后，细胞破裂和多糖溶出基本完全，继续增加保压时间，AAP得率也不会明显升高。故取6 min为最佳保压时间。
2.2.5 复合酶协同超高压法提取AAP正交试验结果
复合酶协同超高压法提取AAP正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。
表5 复合酶协同超高压法正交试验结果
Table 5 The result of orthogonal experimental design by compound enzyme-assisted ultra-high pressure method
试验序号D保压时间/min 1 1∶20 300 40 4 10.25 2 1∶20 400 50 6 11.31 3 1∶20 500 60 8 11.62 4 1∶30 300 50 8 12.21 5 1∶30 400 60 4 10.92 6 1∶30 500 40 6 10.67 7 1∶40 300 60 6 10.73 8 1∶40 400 40 8 11.95 9 1∶40 500 50 4 10.73 k1 11.060 11.063 10.957 10.633 k2 11.267 11.393 11.417 10.903 k3 11.137 11.007 11.090 11.927 R 0.207 0.386 0.460 1.294 A料液比/（g/mL）B压力/MPa因素 AAP得率/%C提取温度/℃
表6 复合酶协同超高压法方差分析结果
Table 6 The variance analysis results by compound enzymeassisted ultra-high pressure method
注：* 表示差异显著，P＜0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A料液比 0.065 2 1.000 19.000 B压力 0.262 2 4.031 19.000 C提取温度 0.336 2 5.169 19.000 D保压时间 2.793 2 42.969 19.000 *误差 0.07 2
由表5、表6的结果分析可知，4个因素的影响顺序为：D＞C＞B＞A。保压时间对AAP得率影响较大，达到了显著水平，其他因素不显著，最佳工艺参数为：A2B2C2D3，即保压时间8 min，提取温度50℃，压力400 MPa，料液比 1∶30（g/mL）。在上述最优条件下做验证试验，平行3次，得到AAP得率为12.23%（3次平均值），高于试验组A2B1C2D3的AAP得率（12.21%）。因此，选取工艺参数A2B2C2D3为复合酶协同超高压法提取AAP最佳工艺。
3 结论
本试验采用复合酶协同超高压法提取AAP，并对其工艺进行优化，得到最佳工艺条件：酶解时间50min，复合酶添加量3%，酶解温度50℃，酶解pH值6.5。然后再协同超高压法提取AAP，得到最佳工艺条件：保压时间8 min，提取温度50℃，压力400 MPa，料液比1∶30（g/mL），该协同条件下，AAP 得率为 12.23%，比单独使用复合酶法提取AAP，得率提高了32.07%。本试验方法为AAP的提取及应用提供一种参考。
[1]LI L,DING J N,LUO L,et al.Preliminary studies on the early quality identification of Auricularia auricular[J].Journal of Forestry Research,2005,16(1):61-64.
[2] SONG G L,DU Q Z.Isolation of a polysaccharide with anticancer activity from Auricularia polytricha using high-speed countercurrent chromatography with an aqueous two-phase system[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(38):5930-5934.
[3] 郑林用,何希德,何权,等.毛木耳对小鼠免疫功能的影响研究[J].中国食用菌,2010,29(5):43-45.
ZHENG Linyong,HE Xide,HE Quan,et al.Effect of Auricularia auricular on immune function in mice[J].Edible Fungi of China,2010,29(5):43-45.
[4] 夏尔宁,陈琼华.黑木耳多糖的生物活性[J].中国药科大学学报,1989,20(4):227-230.
XIA Erning,CHEN Qionghua.Biological activities of polysaccharide from a uricularia Auricula underw[J].Journal of China Pharmaceutical University,1989,20(4):227-230.
[5] 沈丛微,罗霞,江南,等.毛木耳多糖的药理研究进展[J].安徽农业科学,2011,39(22):13407-13408,13411.
SHEN Congwei,LUO Xia,JIANG Nan,et al.Research progress on pharmacological activities of Auricularia polytricha polyaccharide[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(22):13407-13408,13411.
[6]SUN Y X,LI T B,LIU J C.Structural characterization and hydroxyl radicals scavenging capacity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Auricularia polytricha[J].Carbohydrate Polymers,2010,80(2):377-380.
[7] 许海林,吴小勇,聂少平,等.黑木耳多糖提取工艺优化及其对小鼠巨噬细胞功能的影响[J].食品科学,2016,37(10):100-104.
XU Hailin,WU Xiaoyong,NIE Shaoping,et al.Optimization of extraction conditions of crude polysaccharide from Auricularia auricular and its effects on the functions of mouse peritoneal macrophages[J].Food Science,2016,37(10):100-104.
[8] 林敏,吴冬青,李彩霞.黑木耳多糖提取条件的研究[J].河西学院学报,2004,20(5):87-89.
LIN Min,WU Dongqing,LI Caixia.Technology study on extraction of polysaccharide from Auricularia[J].Journal of Hexi University,2004,20(5):87-89.
[9] 包海花,高雪玲,祖国美.一种改良的黑木耳多糖提取方法[J].中国林副特产,2005(4):29.
BAO Haihua,GAO Xueling,ZU Guomei.An improved extraction method of Auricularia auricular polysaccharide[J].Quarterly of Forest by-Product and Speciality in China,2005(4):29.
[10]姜红,孙宏鑫,李晶,等.酶法提取黑木耳多糖[J].食品与发酵工业,2005,31(6):131-133.
JIANG Hong,SUN Hongxin,LI Jing,et al.Study on enzymatic hydrolysis of Auricularia auricular[J].Food and Fermentation Industries,2005,31(6):131-133.
[11]王雪,王振宇.响应面法优化超声波辅助提取黑木耳多糖的工艺研究[J].中国林副特产,2009(3):1-5.
WANG Xue,WANG Zhenyu.Optimization of the ultrasonic waveassisted extraction condition of Auricularia auricular polysaccharides using response surface analysis[J].Forest by-Product and Speciality in China,2009(3):1-5.
[12]张钟,高智谋.微波辅助野生黑木耳多糖的提取工艺条件优化[J].包装与食品机械,2006,24(2):7-10.
ZHANG Zhong,GAO Zhimou.Optimization of the microwave-assisted extraction of polysaccharides from wild Auricularia auricula(hook.)underw[J].Packagingand Food Machinery,2006,24(2):7-10.
[13]杨春瑜,薛海晶.超微粉碎对黑木耳多糖提取率的影响[J].食品研究与开发,2007,28(7):34-38.
YANG Chunyu,XUE Haijing.The effect of super-fine grinding on extraction yield of Auricularia auricula polysaccharides[J].Food Research and Development,2007,28(7):34-38.
[14]夏日照,廖晓兰.农用植物活性成分提取技术研究进展[J].生物技术通报,2015,31(3):49-56.
XIA Rizhao,LIAO Xiaolan.Research progress of agricultural crop active component extraction[J].Biotechnology Bulletin,2015,31(3):49-56.
[15]张渊超,孙钦秀,魏帅,等.超高压结合酶解法提取鱼油工艺优化[J].广东海洋大学学报,2020,40(2):71-76.
ZHANG Yuanchao,SUN Qinxiu,WEI Shuai,et al.Optimization of extraction parameter of fish oil by ultra-high pressure combined with enzymatic hydrolysis[J].Journal of Guangdong Ocean University,2020,40(2):71-76.
[16]纵伟,张薇薇,赵光远,等.超高压提取大蒜渣多糖工艺条件的优化[J].中国调味品,2014,39(8):20-22.
ZONG Wei,ZHANG Weiwei,ZHAO Guangyuan,et al.Optimization of process conditions for polysaccharides from garlic residues by ultra-high pressure method[J].China Condiment,2014,39(8):20-22.
[17]李亚辉,马艳弘,黄开红,等.响应面法优化复合酶提取芦荟多糖工艺及其抗氧化活性分析[J].食品科学,2014,35(18):63-68.
LI Yahui,MA Yanhong,HUANG Kaihong,et al.Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for the extraction of Aloe polysaccharides using response surface methodology and assessment of their antioxidant activity[J].Food Science,2014,35(18):63-68.
[18]崔亦华,崔英德,易国斌.应用广泛的天然多糖及其提取方法[J].广州化工,2002,30(3):7-9.
CUI Yihua,CUI Yingde,YI Guobin.Widely application and it's extraction methods of the natural polysaccharide[J].Guangzhou Chemical Industry,2002,30(3):7-9.
[19]池源,王丽波.苯酚-硫酸法测定南瓜籽多糖含量的条件优化[J].食品与机械,2014,30(1):89-92.
CHI Yuan,WANG Libo.Study on phenol-sulfuric acid method for determination of polysaccharide content in pumpkin seeds[J].Food&Machinery,2014,30(1):89-92.
[20]BAO H K,SUN L J,ZHU Y,et al.Lentinan produces a robust antidepressant-like effect via enhancing the prefrontal Dectin-1/AMPA receptor signaling pathway[J].Behavioural Brain Research,2017,317:263-271.
[21]罗其昌,崔春,李文治.提取温度对香菇多糖理化性质和免疫活性的影响[J].现代食品科技,2017,33(11):23-30.
LUO Qichang,CUI Chun,LI Wenzhi.Effects of extraction temperature on physicochemical properties and immune activity of polysaccharide from Lentinula[J].Modern Food Science and Technology,2017,33(11):23-30.