青虾（Macrobrachium nipponense）学名日本沼虾，其味道鲜美、营养丰富，深受消费者青睐，市场需求量逐年上升[1]，但值得关注的是，包括青虾在内的虾类水产品在被捕获离水后容易死亡，且在后续加工和冷藏过程中由于微生物增殖、内源酶作用和脂质氧化等因素的影响，往往会导致新鲜虾产品发生腐败变质现象[2]。虽然已有的冷冻技术能够有效地延长虾类水产品的保藏期，但冷冻和解冻工序会对青虾色泽、质地、风味以及持水力等感官品质造成不可逆的负面影响，极大地影响青虾的质量和经济性[3-4]。随着消费者对低温肉制品接受度的与日俱增和我国冷链技术的完善，如何提升新鲜青虾的冷藏货架期成为行业关注的热点，众多学者对之开展了大量研究，其中天然保鲜剂技术以其高效、安全、低成本和易实施的特点而备受关注。
近年来，随着天然保鲜剂研究的深入，各种具有抑菌保鲜作用的天然物质正在被逐步开发应用于水产品保鲜中，取得了较好的冷藏保鲜效果。但研究同时也表明，使用单一天然保鲜剂进行食品保鲜时，往往会出现保鲜剂用量过大且保鲜效果有限的现象，根据栅栏技术的原理，将不同的天然保鲜剂进行复配，可发挥其协同效应使保鲜效果大幅提升[5]。于淑池等[6]将壳聚糖、ε-聚赖氨酸盐酸盐和茶多酚进行复配，对金鲳鱼进行冷藏保鲜，结果表明使用复配保鲜剂处理的金鲳鱼样品的一级鲜度和货架期均延长4 d，保鲜效果优于单独使用壳聚糖的对照组。Na等[7]研究表明，相比单一组分涂膜，壳聚糖和赖氨酸复配涂膜对南美青虾肌肉内以假单胞菌为代表的嗜温菌和以硫化氢产生菌为代表的嗜冷菌生长有显著抑制作用（P＜0.05）。赵海鹏[8]对壳聚糖、茶多酚和乳酸链球菌素的复配抑菌试验结果表明，该复配保鲜剂能使菌体变形，在菌体表面形成泡状结构，破坏细胞壁和细胞膜的结构，抑菌效果显著。因此，本研究拟将壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素4种天然保鲜剂通过正交试验进行配方优化，开发出复配天然保鲜剂应用于青虾冷藏保鲜。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青虾：浙江恒通生物科技股份有限公司养殖基地，捕捞后以鲜活状态运输至实验室进行后续样品保鲜处理；胡萝卜：市售。
壳聚糖（脱乙酰度≥90%）、迷迭香提取物、卡拉胶、乳酸链球菌素（均为食品级）：河南圣斯得实业有限公司；硼酸、氧化镁、硫酸、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
全自动凯氏定氮仪（K9860）：山东海能科学仪器有限公司；生物洁净工作台（BCM-1300A）：苏净集团安泰公司；电子天平（CP114）：美国奥豪斯仪器（上海）有限公司；pH计（PHS-3C）：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 复配保鲜剂的配制及样品处理方法
分别称取一定质量的壳聚糖粉末，用1%醋酸溶液溶解制成壳聚糖溶液，再将迷迭香提取物、卡拉胶和乳酸链球菌素分别按比例称取并溶解至壳聚糖溶液中，搅拌均匀制成复配保鲜剂，置于4℃贮藏备用。将新鲜青虾洗净、沥干，按料液比1∶2（g/mL）浸没至复配保鲜剂中10 min，捞出置于4℃环境沥干30 min后，分组装入保鲜袋中置于4℃进行冷藏。
1.3.2 壳聚糖成膜浓度考察
在复配天然保鲜剂中，壳聚糖是重要的成膜材料，其成膜性好坏直接决定青虾的保鲜效果，因此，确定壳聚糖的成膜浓度至关重要。分别配制浓度为0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%的壳聚糖溶液，分别将其涂在胡萝卜块表面，制备成装片置于低倍镜下（100倍）进行成膜性观察。然后分别取10 mL壳聚糖溶液均匀涂布在载玻片表面，50℃烘干30 min后观察壳聚糖在载玻片表面的成膜连续性。以蒸馏水为空白对照（CK）。
1.3.3 单因素试验设计
采用单因素试验，考察壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素的质量分数对涂膜处理后的青虾在4℃冷藏3 d后保鲜效果的影响。设定复配天然保鲜剂基础配方为壳聚糖质量分数1.5%，卡拉胶质量分数0.20%，迷迭香提取物质量分数0.06%，乳酸链球菌素质量分数0.06%，考察壳聚糖质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、卡拉胶质量分数（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、迷迭香提取物质量分数（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和乳酸链球菌素质量分数（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）对青虾冷藏保鲜效果的影响。
1.3.4 复配天然保鲜剂优化
根据单因素试验结果，以壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素的质量分数为因素，每个因素设3个水平，以贮藏3d后青虾的挥发性盐基氮（total volatilebasicnitrogen，TVB-N）值为参考指标，采用L9（34）正交试验优化复配天然保鲜剂配方。因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平D乳酸链球菌素质量分数/%1 0.75 0.175 0.07 0.05 2 1.00 0.200 0.08 0.06 3 1.25 0.225 0.09 0.07因素A壳聚糖质量分数/%B卡拉胶质量分数/%C迷迭香提取物质量分数/%
1.3.5 挥发性盐基氮值
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》，采用凯氏定氮法进行测定，平行测定3次。
1.4 数据处理
试验数据采用SPSS 18.0软件的one-way ANOVA程序进行方差分析，采用Duncan氏多重比较检验，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著性标准。
2 结果与分析
2.1 壳聚糖成膜浓度的确定
青虾体内富含大量多酚氧化酶类，在保鲜贮藏过程中如不充分隔绝氧气，青虾极易发生由于酚类氧化而导致的褐变现象，造成青虾贮藏品质的下降[9]。因此，在青虾冷藏保鲜过程中不仅要考虑壳聚糖对青虾体内腐败微生物的抑菌效果，而且更要关注壳聚糖在青虾表面成膜的效果。
不同浓度（0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%）壳聚糖溶液涂膜胡萝卜的显微观察结果见图1，成膜效果见图2。
图1 不同浓度壳聚糖成膜显微观察图（100×）
Fig.1 The microscope photo of chitosan film with different concentration（100×）
图2 不同浓度壳聚糖成膜效果
Fig.2 Theperformanceofchitosanfilmwithdifferentconcentration
图1中，壳聚糖浓度低于1.00%时，其在胡萝卜表面形成的膜不连续且各部位薄厚不一，成膜性较差，而壳聚糖浓度≥1.00%以上时，开始在胡萝卜表面形成连续且薄厚均一的膜，随着壳聚糖浓度的逐步增大，膜的厚度随之增加。同样，当壳聚糖浓度≥1.00%时，在玻璃载玻片上涂膜形成的壳聚糖膜连续且厚薄均一（图2），无空缺现象。因此，可确定壳聚糖成膜浓度为1.00%。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 壳聚糖质量分数的确定
不同质量分数的壳聚糖对青虾TVB-N值的影响见图3。
图3 不同质量分数的壳聚糖对青虾TVB-N值的影响
Fig.3 Effect of different concentration of chitosan on TVB-N value of shrimp
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
挥发性盐基氮是动物源食品原料贮藏和加工过程中，由于体内内源酶和外界微生物的共同作用导致肌肉蛋白质分解产生氨及低级别胺类化合物，其含量高低是评判动物源食品保鲜效果的重要参数[10]。GB 2733—2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》[11]规定淡水鱼虾TVB-N≤20 mg/100 g。经过涂膜处理的青虾4℃冷藏3 d后，无添加组（0%）和0.5%壳聚糖涂膜组青虾样品的TVB-N值分别为22.19、20.99 mg/100 g，超过20 mg/100 g的限量标准。当壳聚糖的质量分数大于0.5%后，4组试验组（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）样品的TVB-N值之间无明显差异（P＞0.05），但均显著低于空白组和0.5%壳聚糖涂膜组（P＜0.05），且均低于水产品卫生限量标准。因此，确定壳聚糖的质量分数为1.0%进行后续正交优化试验。
2.2.2 卡拉胶质量分数的确定
不同质量分数的卡拉胶对青虾TVB-N值的影响见图4。
图4 不同质量分数的卡拉胶对青虾TVB-N值的影响
Fig.4 Effect of different concentration of carrageenin on TVB-N value of shrimp
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图4可知，无添加组（0%）、0.10%卡拉胶组和0.15%卡拉胶组的TVB-N值之间无显著差异（P＞0.05），且均低于20 mg/100 g。当卡拉胶质量分数大于0.15%时，0.20%、0.25%、0.30%卡拉胶涂膜试验组样品的TVB-N值无显著差异（P＞0.05），但均显著低于0%、0.10%和0.15%卡拉胶试验组（P＜0.05）。以往的研究[12-13]表明，卡拉胶能够与其它食品胶进行复配，形成协同增效的作用来提高膜的成膜性能、凝胶强度和对被涂膜材料的黏附性等，进而提高复配保鲜剂的涂膜保鲜效果，本研究结果与之相符。因此，单因素试验确定卡拉胶的质量分数为0.20%进行后续正交优化试验。
2.2.3 迷迭香提取物质量分数的确定
不同质量分数的迷迭香提取物对青虾TVB-N值的影响见图5。
图5 不同质量分数的迷迭香提取物对青虾TVB-N值的影响
Fig.5 Effect of different concentration of rosemary extract on TVB-N value of shrimp
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图5可知，当迷迭香提取物质量分数≤0.06%时，4组（0%、0.02%、0.04%、0.06%）样品间的 TVB-N值没有显著差异（P＞0.05），当迷迭香提取物质量分数≥0.08%时，0.08%和0.10%迷迭香提取物涂膜试验组样品的TVB-N值没有显著差异（P＞0.05），且均显著低于其它4组的TVB-N值（P＜0.05）。迷迭香提取物富含迷迭香酸、精油和众多酚类物质[14]，具有较好的抑菌和抗氧化特性，Ozogul等[15]用4%迷迭香精油纳米乳浸泡处理虹鳟鱼，虹鳟鱼表面嗜冷菌生长被抑制，在2℃下贮藏期达到24 d。Shi等[16]用0.2%迷迭香提取物浸泡伍氏蝼蛄虾10 s～15 s，处理后的伍氏蝼蛄虾在-20℃冷冻条件下可以贮藏24周。本研究结果也表明复配天然保鲜剂中迷迭香提取物的添加有助于保鲜剂抗菌性能的提升。因此，单因素试验确定迷迭香提取物的质量分数为0.08%，进行后续正交优化试验。
2.2.4 乳酸链球菌素质量分数的确定
不同质量分数的乳酸链球菌素对青虾TVB-N值的影响见图6。
图6 不同质量分数的乳酸链球菌素对青虾TVB-N值的影响
Fig.6 Effect of different concentration of nisin on TVB-N value of shrimp
不同字母表示差异显著，P＜0.05。
由图6可知，0.04%试验组青虾样品的TVB-N值显著低于无添加组和0.02%试验组（P＜0.05），但乳酸链球菌素质量分数≥0.06%时，3组试验组（0.06%、0.08%、0.10%）青虾样品的TVB-N值基本没有差别（P＞0.05），但均显著低于0.04%处理组的TVB-N值（P＜0.05）。乳酸链球菌素以其高效抑菌和安全特性被广泛应用于各类食品加工和贮藏中[17-18]，本研究中乳酸链球菌素质量分数为0.06%时青虾的TVB-N值低至13.83 mg/100 g，大幅低于其它单因素试验结果，也反映出乳酸链球菌素对青虾的高效抑菌保鲜效果。因此，单因素试验确定乳酸链球菌素的质量分数为0.06%，进行后续正交优化试验。
2.3 正交试验
正交试验结果见表2。方差分析结果见表3。
表2 正交试验结果
Table 2 The results of orthogonal experiment
组号A/%B/%C/%D/%TVB-N值/（mg/100 g）1 0.75（1） 0.175（1） 0.07（1） 0.05（1） 13.93±0.64 2 0.75（1） 0.200（2） 0.08（2） 0.06（2） 14.42±1.25 3 0.75（1） 0.225（3） 0.09（3） 0.07（3） 11.59±0.42 4 1.00（2） 0.175（1） 0.08（2） 0.07（3） 12.28±1.12 5 1.00（2） 0.200（2） 0.09（3） 0.05（1） 15.47±0.42 6 1.00（2） 0.225（3） 0.07（1） 0.06（2） 14.10±0.61 7 1.25（3） 0.175（1） 0.09（3） 0.06（2） 12.42±0.80 8 1.25（3） 0.200（2） 0.07（1） 0.07（3） 11.88±0.27 9 1.25（3） 0.225（3） 0.08（2） 0.05（1） 13.55±0.21 k1 13.31 12.88 13.30 14.32 k2 13.95 13.92 13.42 13.65 k3 12.62 13.08 13.16 11.92极差R 1.33 1.04 0.26 2.40较优水平 k3 k1 k3 k3主次顺序 D＞A＞B＞C
表3 正交试验方差分析
Table 3 Variance analysis on the results of orthogonal experiment
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）；—表示差异不显著（P＞0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著水平A 8.008 2 4.004 7.659 0.004 **B 5.510 2 2.755 5.269 0.016 *C 0.293 2 0.146 0.280 0.759 —D 27.636 2 13.818 26.429 0.000 **离差
分析表2和表3可知，4种天然保鲜剂中，壳聚糖质量分数、卡拉胶质量分数和乳酸链球菌素质量分数对青虾TVB-N值的影响显著，其中壳聚糖质量分数和乳酸链球菌素质量分数影响极显著（P＜0.01）。迷迭香提取物质量分数对青虾TVB-N值影响不显著（P＞0.05）。各组分对青虾TVB-N值的影响主次顺序为乳酸链球菌素质量分数（D）＞壳聚糖质量分数（A）＞卡拉胶质量分数（B）＞迷迭香提取物质量分数（C）。确定各因素较优水平分别为k3（A）、k1（B）、k3（C）、k3（D），以TVB-N值为指标得到青虾复配天然保鲜剂的最佳配方组合为A3B1C3D3，即壳聚糖质量分数1.25%、卡拉胶质量分数0.175%、迷迭香提取物质量分数0.09%、乳酸链球菌素质量分数0.07%。
2.4 验证试验
采用正交试验优化后的最优复配天然保鲜剂配方（壳聚糖质量分数1.25%、卡拉胶质量分数0.175%、迷迭香提取物质量分数0.09%、乳酸链球菌素质量分数0.07%）对新鲜青虾进行涂膜保鲜验证试验，4℃冷藏3 d后，涂膜试验组青虾的TVB-N值为（11.22±0.81）mg/100 g，均低于所有正交试验组的TVB-N值，符合一级鲜度（≤15 mg/100 g）标准。因此，可以确定采用该复配天然保鲜剂能提升青虾冷藏保鲜效果，所得方案切实可行。
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，采用正交试验对壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素4种天然保鲜剂的质量分数进行优化，确定青虾复配天然保鲜剂的最优配方为壳聚糖质量分数1.25%、卡拉胶质量分数0.175%、迷迭香提取物质量分数0.09%、乳酸链球菌素质量分数0.07%，采用最优复配天然保鲜剂涂膜处理的青虾在4℃条件下贮藏3 d后，青虾的 TVB-N 值为（11.22±0.81）mg/100 g，符合一级鲜度（≤15 mg/100 g）标准，青虾保鲜效果良好，说明采用壳聚糖、卡拉胶、迷迭香提取物和乳酸链球菌素4种天然保鲜剂进行复配对青虾进行涂膜保鲜处理，能抑制青虾体内腐败微生物生长，达到延缓青虾腐败变质的效果。
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