紫苏（Perilla frutescens L.）是一年生草本植物，属于唇形科（Labiatae）[1]，又被称作赤苏、香苏等。紫苏是一种药食同源的经济作物[2]，是我国最早公布的药食同源植物之一[3]。据研究表明，紫苏中的活性物质有抗菌[4]、抗过敏、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、抑菌防腐等功效。经常食用紫苏能起到降血脂、抗衰老、抗癌、提高记忆力、健脑等功能[7]。紫苏的各个部位在食品行业都被广泛应用[8-9]。紫苏叶作为优质食材深受消费者喜爱。另外，市场上还有许多与紫苏有关的产品，如紫苏汁、紫苏保健茶、紫苏籽精油、紫苏保健酒等[10-14]。国内学者对紫苏叶的研究也越来越多。由于紫苏丰富的营养价值，对紫苏中化学成分及生物活性的研究已成为国内外食品领域研究的热点，但我国对于紫苏的研究起步较晚，大多集中在紫苏黄酮提取工艺优化方面，对紫苏黄酮抗菌活性的研究甚少[15]。
本研究利用超声波辅助乙醇提取法对紫苏黄酮进行提取。分别以大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、霉菌及酵母菌（Saccharomycetes）为供试菌，采用滤纸片法等研究方法，通过抑菌圈、最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）、最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）等指标测定，探究紫苏黄酮抗菌活性。在此基础上，进一步研究紫苏黄酮抗菌活性的pH值稳定性和热稳定性，为紫苏的开发利用和新型纯天然食品保鲜剂的研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
紫苏：市售；蒸馏水：吉林农业大学食品科学与工程学院实验室自制；无水乙醇、氢氧化钠、硫酸亚铁、亚硝酸钠、硝酸铝、氯化钙、盐酸、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾：广州化学试剂厂；植物蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂粉：上海缘肽生物技术有限公司；酵母提取物：山东玉宝生物科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖：西亚化学试剂有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌：丰晖生物科技有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器与设备
鼓风干燥箱（DHG-9037A）、电子天平（FA2004）：上海一恒科学仪器有限公司；粉碎机（SZFJ-200）：中国旭朗机械有限公司；超声波提取仪（HJ911-8P）：上海达洛科技有限公司；高速冷冻离心机（KH20R）：湖南凯达科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV759/UV759CRT）：湖南聚创环保有限公司；生化培养箱（BJPX-150）、高压蒸汽灭菌锅（BKQ-B100I）：山东博科科学仪器有限公司；旋转蒸发仪（R502B）：上海SENCO有限公司；循环水式真空泵（SHB-III型）：郑州长城科工贸有限公司；普通型冷冻干燥机（LGJ-10）：北京松源华兴科技发展有限公司；pH计（pH-9701）：北京格乐普高新技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 紫苏黄酮提取
将紫苏叶放入鼓风干燥箱中进行60℃恒温干燥，干燥后将冷却至37℃的紫苏叶放入粉碎机进行粉碎，粉碎后的紫苏粉过80目筛，准确称取紫苏干粉5.0 g，置于锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶剂，置于超声波提取仪中进行一定时间的提取、抽滤并收集滤渣，重复此步骤提取2次，合并滤液，放置于旋转蒸发器中，对其进行减压浓缩，将浓缩后的样品用60%乙醇定容至100 mL，即得黄酮提取液，备用。
1.3.2 黄酮含量测定
参考杜若源等[16]的方法稍作修改，以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al（NO3）3显色法制作标准曲线，得到芦丁标准曲线详见图1。标准曲线回归方程为y=0.853 4x+0.525 1，R2=0.999 5。黄酮含量以每克干燥样品中所含的相当于芦丁的量进行计算[17]，根据芦丁标准曲线方程计算紫苏中黄酮的含量。
图1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard curve of rutin
1.4 紫苏黄酮抗菌活性研究
1.4.1 菌种培养及菌悬液的制备
将活化好的4种供试菌种接种于营养琼脂培养基中，大肠杆菌与金黄色葡萄球菌通过37℃恒温培养24h待其活化。用接种环挑取少量供试菌于50mL的培养基内，37℃振荡培养24h，酵母菌在28℃下培养24 h，霉菌在30℃下培养48 h。分别取适量菌液用无菌水进行稀释，使菌悬液浓度达到108CFU/mL备用[18]。
1.4.2 抑菌圈试验
采用滤纸片法[19]，取浓度为108CFU/mL的各菌液1.0 mL分别加入到25 mL营养琼脂培养基中，均匀混合后倒入平皿恒温培养，以菌能够长满培养皿且能够分布均匀为评判适宜菌液浓度标准。
1）利用打孔器，将渗透性强的滤纸片打孔，孔径为8 mm左右，并将其放置于干净的培养皿中，在121℃高温高压蒸汽灭菌20min，灭菌后置无菌操作台，备用。
2）设置不同浓度紫苏黄酮提取液为试验组，分别为 2.5、5、10、15 mg/mL；设置浓度为 5 mg/mL 的山梨酸钾作为阳性对照组；以无菌水作空白对照组，进行后续试验操作。
3）在无菌操作台中操作配制好的菌悬液，吸取100 μL摇匀后的菌悬液放在平板上，使用灭菌后的涂布棒将已经冷却凝固的固体培养基均匀涂布。每个培养基平皿设置无菌水为空白对照组（C）、设置5 mg/mL的山梨酸钾为阳性对照组（P）、试验组 1（T1，2.5mg/mL）、试验组 2（T2，5 mg/mL）、试验组 3（T3，10 mg/mL）、试验组4（T4，15 mg/mL）。将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含有不同浓度黄酮提取液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子夹取含黄酮的滤纸片，将多余液体在内培养皿边上擦掉，放置在含菌平板培养基表面，并进行按压，且不能破坏培养基，使滤纸片能与培养基进行密切接触。滤纸片距培养皿边缘10 mm。每个培养皿均匀放置6张纸片。
4）将处理好的细菌平板于37℃恒温培养箱中进行恒温培养24 h～48 h后取出，观察菌落的生长情况，用十字交叉法测量抑菌圈直径，测量3次取平均值。
1.4.3 MIC测定
采用曹铭晨等[20]方法，略作修改。采用倍比稀释法，取试管分别编号1号～8号，1号管装1.8 mL液体培养基，2号～8号管分别装入1 mL液体培养基。通过高温高压灭菌后冷却，在无菌台上操作，分别加入0.2 mL浓度为1 mg/mL紫苏黄酮溶液子1号管中，摇匀，从1号试管吸取1 mL混合液移入2号管，按这种方式依次进行操作。1号～7号管中紫苏提取物浓度分别为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 mg/mL。到 8号管弃去1 mL，用8号管作为对照组。再在1号～8号试管各加入菌悬液0.1 mL，37℃恒温培养24 h后，肉眼观察试管混浊还是澄清，澄清试验管的最低浓度为紫苏黄酮对该菌的MIC值。
1.4.4 MBC测定
将紫苏黄酮提取液的浓度大于等于MIC的试管继续进行为期24 h的培养，并观察其生长的情况，以依旧没有菌生长的黄酮提取液浓度为其MBC值[21]。
1.4.5 pH值对紫苏黄酮抗菌活性的影响
按照程道梅等[22]方法稍作修改。用柠檬酸溶液（0.1 mol/L）和NaOH溶液（2%）分别调节培养基pH值，使其 pH 值分别为 3、4、5、6、7、8。然后利用各菌的 MIC的黄酮提取液分别进行抗菌性试验，以对照组乙醇进行对比，研究pH值对紫苏黄酮抗菌活性的影响。
1.4.6 紫苏黄酮抗菌活性热稳定性试验
将黄酮提取液置于80、100、121℃的条件下分别处理15 min后，以对各菌的MIC的黄酮进行抗菌试验，探究紫苏黄酮抗菌活性成分的热稳定性。
1.5 数据处理
每组试验分别进行3次，详细记录试验数据；利用SPSS软件对各组数据进行分析处理，对紫苏黄酮的抗菌性进行基础研究。
2 结果与分析
2.1 紫苏黄酮对各供试菌抑菌活性的抑菌圈测定
紫苏黄酮对各供试菌抑菌活性的抑菌圈测定结果见表1。
表1 紫苏黄酮对各供试菌的抑菌活性的抑菌圈测定结果
Table 1 Results of the bacteriostatic circle of perilla flavone on the bacteriostatic activities of each tested bacteria
注：-表示无明显抑菌圈出现。
16.86±0.26金黄色葡萄球菌 - 3.62±0.05供试菌种 抑菌圈直径/mm C T1 T2 T3 T4 P大肠杆菌 - 4.33±0.02 8.67±0.08 14.17±0.03 14.36±0.02 15.42±0.29酵母菌 - 3.31±0.04 8.31±0.06 12.17±0.04 12.41±0.04 21.34±0.41霉菌 - 2.97±0.03 7.23±0.02 8.98±0.04 9.28±0.01 5.11±0.04 8.72±0.03 8.89±0.04 24.49±0.46
由表1可知，不同浓度的紫苏黄酮对4种供试菌均有一定的抑菌效果，随着浓度的增加其抑菌效果也有明显的增长，这是因为紫苏中的活性成分有效抑制了各类菌种的生长。在相同浓度下，紫苏对大肠杆菌的抑菌效果明显优于其他3种供试菌，其抑菌效果排列顺序为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞酵母菌＞霉菌。对照组山梨酸钾对各供试菌种也有一定抑菌效果，对革兰氏阳性菌的抑菌效果要明显小于革兰氏阴性菌，所以对霉菌、酵母菌和好氧性细菌有良好的抑制作用；其主要是将微生物的脱氢酶系统进行抑制，从而达到抗微生物以及防腐作用。
抑菌活性能力的结果表明，紫苏黄酮对革兰氏阴性菌的抑菌能力要强于革兰氏阳性菌，可能是这两种细胞膜的组成与排列方式不同导致的。革兰氏阴性菌的外部磷脂膜带有结构性脂多糖，它与孔蛋白构成选择性屏障，使得抑菌物质渗透完全，革兰氏阳性菌细胞膜外部有一个肽聚糖层，是无效的渗透屏障，从而抑菌作用没有那么明显[23]。研究表明，黄酮分子上有很多酚羟基，这些基团能够与蛋白质或酶以氢键的方式结合，破坏蛋白质的分子结构使其变性失活，导致细菌细胞质固缩、解体，从而起到抑菌作用[24]。
2.2 紫苏黄酮对各供试菌的MIC及MBC测定
紫苏黄酮对各供试菌的最低抑菌浓度测定结果见表2。
表2 紫苏黄酮对各供试菌的最低抑菌浓度测定结果
Table 2 Results of minimal inhibitory concentration of perilla flavone on each strain tested
注：+表示有细菌显著生长；-表示无肉眼可见菌生长；CK为对照组乙醇溶液。
浓度/（mg/mL）大肠杆菌金黄色葡萄球菌霉菌酵母菌CK 10 － － － － ＋5－－－ － ＋2.5 － － － － ＋1.25 － － ＋ ＋ ＋0.625 － ＋ ＋ ＋ ＋0.3125 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋0.156 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
紫苏黄酮对各供试菌的最低抑菌浓度及最低杀菌浓度测定结果见表3。
表3 紫苏黄酮的最低抑菌浓度及最低杀菌浓度测定结果
Table 3 Determination results of minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of flavonoids from perilla flavone
供试菌种 MIC/(mg/mL) MBC/(mg/mL)大肠杆菌 0.625 1.3金黄色葡萄球菌 1.25 2.5霉菌 2.5 5酵母菌 2.5 4.8
由表2可知，在提取物浓度为0.625 mg/mL时，大肠杆菌的生长完全被抑制；在提取物浓度为1.25 mg/mL时，金黄色葡萄球菌的生长完全被抑制，提取液浓度为2.5 mg/mL时，酵母菌和霉菌的生长完全被抑制，而对照组中各菌生长均呈现明显上升趋势。因此，紫苏提取液对大肠杆菌的MIC为0.625 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为1.25 mg/mL，对酵母菌和霉菌的MIC均为2.5 mg/mL。
2.3 紫苏黄酮抑菌活性的pH值稳定性试验
紫苏黄酮抑菌活性的pH值稳定性试验结果见表4。
由表4可知，在pH值为3～7的范围内，在紫苏黄酮溶液浓度为0.625 mg/mL时，大肠杆菌的生长完全被抑制；在黄酮溶液浓度为1.25 mg/mL时，金黄色葡萄球菌的生长完全被抑制，浓度为2.5 mg/mL时，霉菌和酵母菌的生长完全被抑制，当pH值上升至8时，紫苏黄酮的抑制活性逐渐减弱，微生物生长加快，但生长趋势小于对照组。未添加紫苏黄酮的空白组在pH值小于5时，对各菌的生长抑制性较强，但当pH值大于7时，对各菌的生长抑制强度降低。
表4 pH值对紫苏黄酮抗菌活性的影响
Table 4 Effect of pH on the antibacterial activity of perilla flavone
注：C表示试验组；CK表示对照组乙醇溶液；－表示无肉眼可见细菌生长；+表示有菌显著生长；++表示有细菌显著生长并具有扩大趋势；+++表示有细菌大量生长。
供试菌种 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 CCK CCK C CK CCK CCK CCK大肠杆菌 － － － － － ＋ － ＋＋ － ＋＋＋ ＋ ＋＋金黄色葡萄球菌 － － － － － ＋ － ＋＋＋ － ＋＋＋ ＋ ＋＋酵母菌 － － － ＋ － ＋ － ＋＋＋ － ＋＋＋ ＋ ＋＋霉菌 － － － ＋ － ＋ － ＋＋＋ － ＋＋＋ ＋ ＋＋
2.4 紫苏黄酮抑菌活性的热稳定性试验
紫苏黄酮抑菌活性的热稳定性试验结果见表5。
表5 热处理对紫苏黄酮抗菌活性的影响
Table 5 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of perilla flavone
注：+表示有细菌显著生长；-表示无肉眼可见菌生长。
80℃ 100℃ 121℃大肠杆菌 － － ＋金黄色葡萄球菌 － － ＋酵母菌 － － ＋霉菌 － － ＋供试菌种
由表5可知，温度设定为80℃以下时，紫苏提取物黄酮的抗菌活性未受到影响，均呈较为稳定的抗菌性。设定温度为100℃，加热15 min，紫苏黄酮的抗菌活性仍不受影响，设定温度为121℃，15 min时，高温处理会使其抗菌活性减弱，这是由于受高温的影响，黄酮中的活性成分发生分解或改性。故控制温度条件在100℃以下，对试验不会产生较大影响。
3 讨论与结论
植物源抗菌物质在自然界中广泛存在，植物体内的许多代谢产物如生物碱、黄酮类、有机酸类和酚类化合物等存在抑菌性[25]，而植物源黄酮类物质具有广谱抑菌性。本试验研究了紫苏提取物黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌及酵母菌的抗菌作用，结果显示：紫苏提取物黄酮对这4种供试菌均有一定的抑菌效果，其对大肠杆菌抑菌效果最好，其次为金黄色葡萄球菌，再次为酵母菌和霉菌。
作为常用酸性防腐保鲜剂的苯甲酸、山梨酸只有在酸性条件下其防腐效果才能达到优秀。本研究结果显示在pH值为3～7的范围内，紫苏黄酮均能对微生物的生长呈现出较好抑制作用，可见其pH值范围较广，对酸、弱碱性食品均可起到一定的保藏效果。
目前已从紫苏总黄酮中分离出许多单体成分，如迷迭香酸、柠檬酸、黄芩苷芹菜素-6，8-二-C-葡萄糖苷、木犀草素-7-氧-二葡萄糖醛酸苷、丹参素、咖啡酸、原儿茶酸。本研究为紫苏黄酮抗菌作用的深入研究，为天然植物保鲜剂的开发提供一定的理论依据，促进紫苏黄酮资源更加合理利用。
热处理作为食品加工储藏的有效方法之一，使得保鲜防腐剂要发挥其抗菌作用必须具有一定的耐热性。本研究结果显示，紫苏黄酮热稳定性较好，100℃加热15 min抗菌活性未受影响。
本研究结果表明，紫苏黄酮对4种供试菌均有一定的抗菌效果，其对大肠杆菌的抗菌活性最强（MIC，MBC分别为0.625、1.3mg/mL），其次为金黄色葡萄球菌（1.25、2.5 mg/mL），再次为酵母菌（MIC，MBC 分别为 2.5、4.8 mg/mL）和霉菌（MIC，MBC 分别为 2.5、5 mg/mL）。在pH值为3～7的范围内，提取液浓度在各菌的MIC浓度下，均能完全抑制受试微生物的生长；温度条件在100℃以下时，紫苏黄酮的抗菌能力不受影响，当温度上升至121℃及以上时，会对抗菌活性有显著影响。综上所述，紫苏作为一种天然优质抗菌植物资源可以加以研究开发利用。
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