脂肪酸是细菌的细胞膜磷脂的重要组成部分之一，影响着细菌的生长、代谢等几乎所有的生命活动。细胞膜需要有一定的流动性，才能够正常地发挥作用，维持其结构和功能[1]。在食品行业，不同的脂肪酸具有不同的功能。有些脂肪酸可以改善食品的口感、风味和质构，也有些脂肪酸使得食品更容易被消化吸收，甚至可以促进大脑发育、改善人体健康[2]。此外，脂肪酸还可以用作工业中的润滑剂、乳化剂，合成柴油等[3]，还可应用于化妆品、医药等行业[4-5]。黄艺珠等[6]的研究表明中链脂肪酸及其甘油一酯对致病菌、病毒及寄生虫的活性具有一定的抑制作用。目前脂肪酸合成主要分为化学合成法和微生物合成法，其中化学合成法具有不可持续性、脂肪酸产量低、生产成本较高等缺陷，限制了脂肪酸的大规模生产[7-9]。因此利用微生物合成脂肪酸成为一个热点，目前用于脂肪酸合成的菌株主要为大肠杆菌。大肠杆菌由于其遗传背景清晰、易于工程调控、可高密度发酵等优点常被用作出发菌株进行代谢工程的研究。曲璟秋等[10]通过同时缺失大肠杆菌中β-氧化途径中的脂酰辅酶A合成酶基因fadD与脂酰辅酶A脱氢酶基因fadE，使得大肠杆菌脂肪酸产量达到19.2 mg/L。LU等[11]对大肠杆菌进行基因改造后，脂肪酸产量可以达到2.5 g/L，其中游离脂肪酸占50%。LIU等[12]将酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）进行表达，从而增加了大肠杆菌中短链脂肪酸的比例。
乙酰辅酶A羧化酶是微生物在脂肪酸合成过程中的一个限速酶，生物体能以乙酰辅酶A作为前体物质，通过聚合转酰基作用、缩合反应、还原反应、脱水反应和再还原反应5步循环反应合成脂肪酸[13]。乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A向丙二酰单酰辅酶A的转化[14]，然后在脂肪酸合成酶的作用下合成一系列脂肪酸[15]，是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶[16]。谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶A羧化酶由生物素化的α-亚基accBC，β-亚基 accD1 和小分子等组成，Gande等[17]研究表明accBC与accD1也是霉菌酸合成所必需的。李玲玲等[18]通过过量表达硫酯酶基因以及结合表达乙酰辅酶A羧化酶，最终获得了188.9 mg/L的中链脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFAs）。Davis等[19]利用启动子过表达大肠杆菌酰基辅酶羧化酶ACC的4个亚基，丙二酰辅酶A的含量提高了100倍，脂肪酸含量提高了6倍。
乙酰辅酶A羧化酶是在脂肪酸合成过程中的关键酶，但目前为止，对于调控乙酰辅酶A羧化酶提高脂肪酸产量的研究较少。本研究将谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶α-亚基以及β-亚基分别连接至表达载体pXMJ19，转化至表达菌株大肠杆菌BL21，构建异源表达菌株，通过诱导其过量表达，从而提高脂肪酸产量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒
本研究所用的菌种与质粒如表1所示。
表1 本研究所用的菌种与质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株及质粒 特点 来源菌株E.coli BL21 内蒙古农业大学发酵实验室保藏ATCC 13032 内蒙古农业大学发酵实验室保藏BL-19 含有质粒pXMJ19 本研究构建BL21-accBC accBC表达菌株 本研究构建BL21-accD1 accD1表达菌株 本研究构建质粒pXMJ19 氯霉素抗性 内蒙古农业大学发酵实验室保藏pXMJ19-accBC accBC基因表达载体 本研究构建pXMJ19-accD1 accD1基因表达载体 本研究构建
1.1.2 培养基
LB培养基：胰蛋白胨（10g/L），酵母提取物（10g/L），氯化钠（10 g/L），固体LB培养基添加琼脂粉（15 g/L）。添加终浓度为50 ng/μL的氯霉素。大肠杆菌在37℃条件下进行培养，谷氨酸棒杆菌在30℃条件下进行培养。
1.1.3 酶与试剂
溶菌酶（5 000 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）：北京库来博科技有限公司；限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ、GLX DNA聚合酶、T4 DNA连接酶：宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组提取试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒：天根生化（北京）有限公司。
1.1.4 仪器与设备
TC-EA-48DA PCR基因扩增仪：杭州博日科技有限公司；DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；H3018DR高速冷冻离心机：上海知信实验仪器技术有限公司；LGJ-18S冷冻干燥机：河南兄弟仪器设备有限公司；Clams680气相色谱仪：珀金埃尔默仪器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.5 引物
使用引物设计软件Primer 5.0设计引物。将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组序列作为参考，设计引物以获得谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶A羧化酶α-亚基和β-亚基DNA片段。F1、R1分别为乙酰辅酶A羧化酶α-亚基的上下游引物，F2、R2分别为乙酰辅酶A羧化酶β-亚基的上下游引物。引物序列如下（下划线部分为酶切位点）。
1.2 方法
1.2.1 谷氨酸棒杆菌基因组的提取
谷氨酸棒杆菌在30℃，180 r/min条件下进行培养。谷氨酸棒杆菌基因组利用柱式基因组DNA抽提试剂盒（细菌）来提取，提取步骤严格参照试剂盒说明书进行。由于谷氨酸棒杆菌属于革兰氏阳性菌，具有较厚的细胞壁，因此提取谷氨酸棒杆菌基因组时需要添加180 μL、终浓度为3 mg/mL溶菌酶并于37℃水浴1 h。
1.2.2 乙酰辅酶A羧化酶α-亚基accBC和β-亚基accD1的克隆
谷氨酸棒杆菌在30℃、180 r/min条件下进行培养。以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，以F1、R1为上下游引物，使用聚合酶扩增基因accBC。同理以F2、R2分别为上下游引物扩增出基因accD1。50 μL PCR 体系：上下游引物各 1 μL；模板DNA 1 μL；5*GLX buffer 10 μL；dNTP 4 μL；GLX 1 μL；双蒸水 32 μL。PCR扩增条件：预变性95℃，5 min；（95 ℃ 30 s、62℃ 15 s、72 ℃ 1 min），30 个循环；72 ℃10 min。冷却至16℃，结束反应，PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 重组菌株的构建
使用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。纯化后的accBC基因、accD1基因片段以及质粒pXMJ19分别用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，将双酶切后得到的产物在16℃下经T4 DNA连接酶作用12 h以上，热激法转化至大肠杆菌BL21中构建重组菌株。经50 ng/μL的氯霉素平板涂布后挑选抗性转化子，然后提取质粒并进行双酶切鉴定。
1.2.4 乙酰辅酶A羧化酶α-亚基和β-亚基在大肠杆菌中的诱导表达
从斜面上取一环重组菌株接种于种子培养基中，在37℃、180 r/min的条件下在摇床上进行过夜培养。按5%接种量将种子液接入50 mL培养基中，在37℃、180 r/min的条件下摇床培养。当菌液的OD600达到0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，然后在37℃、180 r/min的条件下继续培养20 h。将菌液使用预冷的超纯水低温洗涤3次，洗涤后的菌体在冷冻干燥机中进行冻干[20]。
1.2.5 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）测定
取20 μL蛋白样品与上样缓冲液进行混合，混合后进行SDS-PAGE分离。开始电泳时电压为100 V，用于蛋白样品浓缩，待样品进入分离胶后电压调节到120 V直到电泳结束。利用考马斯亮蓝R-250对凝胶染色，超纯水和脱色液进行脱色至无底色，获得重组蛋白的蛋白电泳图谱。
1.2.6 脂肪酸的测定
为了测定菌株的脂肪酸产量，使用异丙醇-正己烷溶液提取脂肪酸，并将其甲酯化进行气相色谱分析[20]。称取0.15g菌粉加入4mL正己烷-异丙醇混合物，加入Na2SO4溶液2 mL，室温（24℃）离心（5 300 r/min，20 min）。取上清液于20 mL水解管中，混合后用氮气吹干。加入2 mL氢氧化钠-甲醇溶液在50℃水浴15min，冷却后加入2 mL盐酸-甲醇溶液，在80℃水浴1.5 h。冷却至室温（24℃），加入3 mL水和6 mL正己烷，振荡、静置分层。吸取上层液体（尽量吸净），定容至10mL，加无水Na2SO4干燥后，可上机测定脂肪酸。
色谱条件：色谱柱DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）石英毛细管柱；柱箱程序升温：起始120℃，保持5 min，升温速率5℃/min，升到225℃，保持1 min，再以升温速率8℃/min，升到240℃，保持5 min。氢火焰离子化检测器260℃，进样口汽化温度260℃。载气：N21.0mL/min，氢气45mL/min，空气450mL/min。进样量1.0 μL。数据处理采用峰面积归一化法。
2 结果与分析
2.1 accBC基因、accD1基因的扩增与测序
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，使用高保真聚合酶GLX扩增accBC、accD1基因，结果见图1和图2。
图1 accBC扩增片段
Fig.1 Amplification of accBC gene
由图1和图2可知，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果中分别出现约为1 815 bp和1 700 bp的条带，结果与理论值相符，说明目的基因片段扩增成功。
图2 accD1扩增片段
Fig.2 Amplification of accD1 gene
2.2 重组质粒的构建与鉴定
对重组质粒分别进行双酶切以及菌落PCR验证，结果如图3、图4所示。
图3 重组质粒双酶切
Fig.3 Double digestion of recombinant plasmid
图4 重组菌株菌落PCR验证
Fig.4 Colony PCR verification of recombinant strains
由图3和图4可知，双酶切结果中出现约6 600 bp与1 815 bp、6 600 bp与1 700 bp的条带，与理论值相符，说明表达载体构建成功。重组菌株经液体LB培养后，进行菌液PCR验证（图4），大小与理论值一致，再次验证表达载体构建成功。
2.3 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
对菌株进行培养，前处理后进行SDS-PAGE，结果见图5。
图5 重组菌SDS-PAGE图
Fig.5 SDS-PAGE image of recombinant
M.蛋白质 Marker；1.含有 pXMJ19-accBC 的 BL21-accBC；2.含有 pXMJ19-accD1 的 BL21-accD1；3.含有 pXMJ19 的 BL-19。
由图5可知，accBC基因与accD1基因编码的蛋白大小分别63 kDa与58 kDa。蛋白条带清晰且大小与理论值一致，表明重组质粒可以在大肠杆菌中正常表达，且与对照菌株相比，目的蛋白质表达量更高。
2.4 乙酰辅酶A羧化酶α-亚基和β-亚基的过表达对脂肪酸合成的影响
使用气相色谱测定菌株中脂肪酸含量，结果见图6。
图6 菌株BL-19、BL21-accBC和BL21-accD1的脂肪酸含量
Fig.6 Fatty acid content of strains BL-19，BL21-accBC and BL-accD1
由图6可知，与对照菌株BL-19相比，重组菌株脂肪酸含量有了明显的提高，对照菌株BL-19中脂肪酸含量最高达到12.43 mg/g菌体干重，而重组菌株BL21-accD1可达到18.81 mg/g菌体干重，比对照菌株提高了51.32%；诱导菌株BL21-accBC中脂肪酸含量达到45.57 mg/g菌体干重，比对照菌株提高了266%。
重组菌株的脂肪酸组成变化如表2所示。
表2结果表明，重组菌株与对照菌株细胞内积累脂肪酸的种类基本相同，主要为 C14∶0、C16∶0、C17∶0、C17∶1、C18∶0 及 C18∶1。对照菌株中未检测到 C16∶1，但重组菌株 BL21-accBC、BL21-accD1 中出现 C16∶1，占比分别可达2.07%、2.60%。同样，重组菌株BL21-accBC中C17∶1的含量约为对照菌株的5倍，而在BL21-accD1中C17∶1也有所增加。过表达accBC与accD1基因增加了不饱和脂肪酸C16∶1与C17∶1的含量，重组菌株中的饱和脂肪酸（C18∶0）含量相对下降。此外，重组菌株的脂肪酸组成占比并没有发生明显变化，脂肪酸中主要种类仍为C16∶0。
表2 菌株BL-19及重组菌株的脂肪酸组成
Table 2 Fatty acid composition of strain BL-19 and recombinant strain
菌株脂肪酸含量/%C14∶0 C16∶0 C16∶1 C17∶0 C17∶1 C18∶0 C18∶1 C18∶2 BL-19 3.12±0.12 32.15±1.52 2.36±0.30 3.16±0.51 29.28±0.62 8.29±0.37 9.31±0.14 BL21-accBC 7.60±0.48 42.02±0.98 2.07±0.20 1.85±0.06 16.37±0.21 4.86±0.06 10.02±0.16 13.43±0.12 BL21-accD1 7.15±0.26 40.58±0.31 2.60±0.07 6.08±0.10 13.70±0.08 6.46±0.07 9.69±0.15 13.69±0.17
3 结论
本研究首次使用质粒pXMJ19构建了异源表达菌株BL21-accBC、BL21-accD1，在发酵阶段，通过添加终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，从而影响了脂肪酸合成。重组菌BL21-accBC在诱导表达20 h后，脂肪酸积累达到45.57 mg/g菌体干重，较对照菌株提高了266%，BL21-accD1脂肪酸产量为18.81 mg/g菌体干重，比对照菌株提高了51.32%。此外，异源表达乙酰辅酶A羧化酶基因也会对脂肪酸的组成产生影响，大幅度增加了不饱和脂肪酸的产量。
本试验通过代谢水平的改造来提高脂肪酸的产量，对微生物的资源开发与利用具有重大意义，是食品行业中脂肪酸合成一个新的方向。相比于大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性菌，不含有内毒素，是一种理想的基因调控宿主菌。因此，在后期可以通过在谷氨酸棒杆菌中同源表达accBC、accD1提高脂肪酸的产量。
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