虾是一种生活在水中的节肢动物，属甲壳类，含有丰富的蛋白质和钙等营养物质[1]。铬是一种毒性很大的重金属元素，具有生物毒性和环境迁移性，在虾中容易富集。我国对水产品中铬含量有明确的限量要求，GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定水产动物及其制品铬含量不得超过2.0 mg/kg[2]。故对鲜虾中有毒有害元素含量的检测是非常必要的。
目前国家标准中规定的食品中铬含量的测定方法主要有石墨炉原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）、电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma optical emission spectrometry，ICP-OES）[3-4]。与上述测定方法相比，催化动力学光度法具有仪器简单、测定费用较低、灵敏度高等优点[5]，因此，本试验探讨催化动力学光度法对鲜虾中铬含量的测定条件及动力学条件，建立一种测定鲜虾中铬含量的新方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜虾：市售。
100 μg/mL铬标准溶液：北京北方伟业计量技术研究院；30%过氧化氢：苏州晶瑞化学股份有限公司；茜素红：天津市福晨化学试剂厂；甲基红：天津市大茂化学试剂厂；溴甲酚绿：郑州派尼化学试剂厂；茜素绿：北京百灵威科技有限公司；亮绿：国药集团化学试剂有限公司；无水乙酸钠：郑州世纪凯美化工产品有限公司；浓硝酸：淮南市友友化工有限公司；冰醋酸：天津市致远化学试剂有限公司。以上均为分析纯。
1.2 主要仪器
iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；756PC紫外可见分光光度计：上海悦丰仪器仪表有限公司；M6微波消解仪：上海屹尧仪器科技发展有限公司；DZKW-D-4恒温水浴箱：北京市永光明医疗仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 样品的预处理
参考朱有涛等[6]方法，采用微波消解的前处理方法来处理样品。称取样品0.5 g，清洗干净，向其中添加5.00 mL硝酸、2.00 mL过氧化氢，放入微波消解仪中，根据微波消解仪的操作步骤消解试样（设置条件为第一步：设置温度120℃，升温时间5 min，恒温时间5 min；第二步：设置温度160℃，升温时间5 min，恒温时间10 min；第三步：设置温度180℃，升温时间5 min，恒温时间10 min）。待消解完成冷却后，取出消解罐，用少量蒸馏水洗涤消解罐2次～3次，将洗涤液移入50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容备用。
1.3.2 样品分析方法
取两支干燥洁净的25 mL具塞比色管。向标有催化体系的比色管中加入1.2 mL的铬标准溶液，非催化体系不加铬标准溶液，然后再依次加入5.00 mL醋酸-醋酸钠溶液、0.40 mL溴甲酚绿溶液、0.10 mL过氧化氢，轻轻晃动使其混合均匀，再加入蒸馏水，稀释至刻度线。60℃恒温水浴锅中加热5 min，取出后立即用流水冲刷外壁降温到室温（25℃），备用。以蒸馏水为空白，调整波长为610 nm，分别测定催化和非催化这两种体系的吸光度A和A0，计算差值ΔA。
式中：ΔA为吸光度差值；A0为非催化体系吸光度；A为催化体系吸光度。
1.3.3 样品中铬含量的测定
在25 mL比色管中依次加入5.00 mL醋酸-醋酸钠溶液、0.40 mL溴甲酚绿溶液、0.10 mL过氧化氢，加水稀释至刻度，测定其吸光度记为空白。吸取5.00 mL样品消化液于25 mL的比色管中，再向比色管中依次加入5.00 mL醋酸-醋酸钠溶液、0.40 mL溴甲酚绿溶液、0.10 mL过氧化氢，用蒸馏水稀释至刻度，轻摇混合均匀，随后置于60℃的恒温水浴箱中加热5 min，水浴加热完成后，将比色管冷却至室温（25℃），测定其吸光度，样品中铬含量按下列公式计算。
式中：X样为吸取的试样中铬含量，mg/kg；C为试样中铬的浓度，μg/mL；V1为所取样品的体积，mL；V2为消解后样品的定容体积，mL；m样为称取样品的质量，g。
1.3.4 精密度分析
按1.3.3方法，在最优条件下，进行铬含量的测定，做5次平行，验证该方法的稳定性及检测结果的精密度。
1.3.5 催化动力学光度法与ICP-MS测定结果比较
取鲜虾样品，在相同的消化条件下，分别使用催化动力学光度法和GB 5009.268—2016《食品安全国家标准食品中多元素的测定》中的ICP-MS测定样品中的微量铬，各进行5次平行测定，使用t检验比较两种方法是否存在显著性差异。
1.4 数据处理
用SPSS单因素方差分析对试验结果进行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 最佳色素的选择
色素对吸光度的影响结果见表1。
表1 色素对吸光度的影响
Table 1 Effect of pigments on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
色素 吸光度非催化A0 催化A ΔA茜素红 0.287 2±0.000 2a0.290 2±0.004 9a-0.003 0±0.003 4d溴甲酚绿 0.209 1±0.000 8c0.143 2±0.000 6d 0.065 9±0.000 6a甲基红 0.036 4±0.001 3d0.032 2±0.001 3e 0.004 2±0.001 9c茜素绿 0.288 6±0.010 3a0.261 5±0.009 6b 0.027 1±0.008 7b亮绿 0.257 4±0.001 1b0.231 5±0.025 2c 0.025 9±0.024 7b
在催化动力学光度法中，选择合适的色素更有利于对于测定结果的判定。由表1可知，在非催化体系中，茜素绿吸光度最大，甲基红吸光度最小；催化体系中茜素红的吸光度最大，甲基红的吸光度最小。色素不同，ΔA不同。色素为茜素红时，ΔA最小；色素为溴甲酚绿时，ΔA最大，ΔA值的大小可直接表征催化效果强弱，因此确定的最佳色素为溴甲酚绿。Cr（Ⅵ）对溴甲酚绿-H2O2体系的褪色作用催化效果最佳，从而确定Cr（Ⅵ）测定的最佳反应体系为Cr（Ⅵ）-溴甲酚绿-H2O2催化反应体系。
2.2 最佳波长的选择
波长对吸光度影响较大，选取波长590nm～630nm，考察其对吸光度的影响，结果见表2。
表2 波长对吸光度的影响
Table 2 Effect of wavelength on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
波长/nm 吸光度非催化A0 催化A ΔA 590 0.342 8±0.004 5c0.334 5±0.000 4d 0.008 3±0.003 0c 600 0.542 5±0.001 3b0.498 7±0.012 2c 0.043 8±0.011 6b 610 0.599 0±0.006 4a0.529 1±0.005 5b 0.069 9±0.006 0a 620 0.597 4±0.006 6a 0.5587±0.005 5a 0.038 7±0.005 7b 630 0.529 5±0.013 1b0.523 3±0.006 4b 0.006 2±0.011 3c
由表2可知，非催化和催化体系在波长为610 nm～620 nm吸光度较大，偏离此范围两体系吸光度均减小。波长从590 nm到610 nm，ΔA整体呈上升趋势；超过610 nm后呈下降趋势，波长在600 nm～620 nm范围内催化效果较明显，在610 nm时，ΔA值最大，说明Cr（Ⅵ）对过氧化氢氧化溴甲酚绿反应在610 nm的催化效果最显著，因此确定的最适波长为610 nm。
2.3 最佳pH值的选择
pH值对吸光度的影响结果见表3。
表3 不同pH值对吸光度的影响
Table 3 Effect of pH on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
pH值 吸光度非催化A0 催化A ΔA 3.2 0.043 9±0.001 9e0.042 4±0.001 4e 0.001 5±0.001 7b 3.8 0.185 2±0.003 6d0.182 8±0.001 5d 0.002 4±0.003 1b 4.4 0.593 0±0.001 7c0.583 0±0.000 4c 0.010 0±0.001 5a 5.0 1.085 3±0.002 9b1.080 2±0.001 0b 0.005 1±0.001 9b 5.6 1.185 0±0.002 9a1.180 8±0.027 0a 0.004 2±0.002 6b
酸度对催化反应体系影响很大。酸度太大，会导致溶液反应体系不稳定；酸度太小，不利于元素测定。由表3可知，ΔA值随着pH值增加而变化，pH值在3.2～4.4范围内，ΔA值随着pH值增加而增加；继续增加pH，ΔA值又呈下降趋势，pH值为4.4时，ΔA最大，Cr（Ⅵ）的催化作用最强，因此确定最适pH值为4.4。
2.4 过氧化氢最佳用量的选择
过氧化氢用量对吸光度的影响结果见表4。
过氧化氢作为氧化剂，其用量对反应影响较大。由表4可知，随着过氧化氢用量的增大，ΔA先增加随后下降，过氧化氢用量在0.10 mL～0.20 mL范围内催化效果较明显，且当过氧化氢用量为0.10 mL时，体系ΔA值最大，其用量过高、过低时催化作用均不明显。因此确定过氧化氢最佳用量为0.10 mL。
表4 过氧化氢用量对吸光度的影响
Table 4 Effect of Hydrogen peroxide dosage on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
用量/mL 吸光度非催化A0 催化A ΔA 0.05 0.593 1±0.000 7a0.591 4±0.001 2a 0.001 7±0.001 5c 0.10 0.594 4±0.002 4a0.550 9±0.008 3d 0.043 5±0.009 7a 0.15 0.592 6±0.001 1a0.574 6±0.002 5b 0.018 0±0.002 2b 0.20 0.595 8±0.003 7a0.587 2±0.000 9a 0.008 6±0.003 3b 0.25 0.572 0±0.002 4a0.564 1±0.001 8c 0.007 9±0.002 2c
2.5 溴甲酚绿最佳用量的选择
溴甲酚绿对吸光度的影响结果见表5。
表5 溴甲酚绿用量对吸光度的影响
Table 5 Effect of bromocresol green on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
体积/mL 吸光度非催化A0 催化A ΔA 0.20 0.521 7±0.000 8e0.520 6±0.000 6e 0.001 1±0.000 4b 0.40 0.531 4±0.000 4d0.528 9±0.000 2d 0.002 5±0.000 6a 0.60 0.598 5±0.003 3a0.597 3±0.000 3a 0.001 2±0.000 4b 0.80 0.586 2±0.001 1b0.585 4±0.000 7b 0.000 8±0.000 4b 1.00 0.565 3±0.000 4c0.564 8±0.000 7c 0.000 5±0.000 3b
溴甲酚绿用量直接影响氧化还原作用效果。由表5可知，溴甲酚绿用量对催化和非催化体系吸光度影响显著（p<0.05）。随着溴甲酚绿用量不断增加，ΔA先增加后减少，溴甲酚绿用量在0.20 mL～0.60 mL催化效果较明显，0.40 mL时催化效果最佳，ΔA值最大。可能由于用量过少时，氧化反应底物较少；用量过多时，Cr（Ⅵ）的催化作用相对较弱。因此选择溴甲酚绿的最佳用量为0.40 mL。
2.6 最佳反应温度的选择
反应温度对吸光度的影响结果见表6。
表6 反应温度对吸光度的影响
Table 6 Effect of reaction temperatures on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
温度/℃ 吸光度非催化A0 催化A ΔA 30 0.508 9±0.000 5e 0.509 3±0.000 2e -0.000 4±0.0002c 40 0.513 2±0.002 6d 0.513 1±0.001 7d 0.000 1±0.000 4c 50 0.519 7±0.000 5c 0.519 5±0.000 4c 0.000 2±0.000 1b 60 0.526 6±0.000 2b 0.525 5±0.000 5b 0.001 1±0.000 3a 70 0.528 6 ±0.001 1a 0.528 1±0.000 5a 0.000 5±0.000 2b
由表6可知，反应温度对非催化和催化体系吸光度影响显著（p<0.05）。反应温度30℃～50℃时，Cr（Ⅵ）只起到微弱的催化作用，催化反应进行相对缓慢，ΔA值变化不明显。反应温度为60℃时，ΔA达到最大，催化效果最明显，之后反应温度继续升高，ΔA有所降低，反应温度为60℃时，其ΔA值与其它温度的ΔA值存在显著性差异（p<0.05），因此选择反应温度为60℃。
2.7 最佳反应时间的选择
反应时间对吸光度的影响结果见表7。
表7 反应时间对吸光度的影响
Table 7 Effect of reaction time on absorbance
注：同列不同字母表示差异显著（p<0.05）。
时间/min 吸光度非催化A0 催化A ΔA 3 0.525 4±0.001 7b0.524 8±0.000 8b 0.000 6±0.000 4b 5 0.527 8±0.001 5a0.525 9±0.001 4b 0.001 9±0.000 1a 7 0.526 4±0.002 3b0.527 8±0.001 7a-0.001 4±0.000 6c 9 0.526 5±0.001 8b0.527 6±0.001 6b -0.001 1±0.000 2c 11 0.526 0±0.002 5b0.527 6±0.001 3b -0.001 6±0.001 2c
由表7可知，反应时间由3 min延长至5 min，ΔA随着反应时间的延长而增加；反应时间5 min时，ΔA最大，继续增加反应时间，ΔA甚至出现负值，说明相对较短的反应时间内，催化效果更佳；反应时间为5min时，其ΔA值与其它时间ΔA值之间存在显著性差异（p<0.05），因此选择最佳反应时间为5 min。
2.8 工作曲线的确定
在上述确定的最佳反应条件下，分别移取浓度为10 μg/mL 的铬标准溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 加入到反应体系，计算ΔA，绘制标准曲线，回归方程为y=9.982 2x+0.000 4，相关系数R2=0.998 9，方法的准确度及灵敏性较好，适用于测定鲜虾中的微量铬。
2.9 精密度试验结果
在最优试验条件下，对铬含量进行5次平行测定，测定结果分别为 0.877、0.905、0.843、0.926、0.930 mg/kg，测定的平均值为0.896 mg/kg，标准偏差S=0.036，相对标准偏差为4.0%，说明该方法的精密度较高，重现性较好。
2.10 催化动力学光度法与ICP-MS测定结果比较
在最优条件下对铬含量进行5次平行测定，测定结果分别为 0.877、0.905、0.843、0.926、0.930 mg/kg，测定的平均值为0.896 mg/kg；ICP-MS法5次平行测定结果分别为 0.871、0.922、0.834、0.963、0.932 mg/kg，测定的平均值为0.904 mg/kg，计算t值=0.388，根据自由度为4，查t值表t（4）0.05=2.776，t（4）0.01=4.604，所得t值小于临界值，说明两种检测方法不存在显著性差异。
3 讨论
近年来，相关学者对铬含量的测定方法进行了一些研究，探索出一些食品中铬元素的检测方法，对有毒有害元素检测具有一定的理论指导意义。高向阳等[7]通过微波消解－流动注射化学发光法快速测定调味品中的微量铬，在最佳条件下，铬浓度线性关系良好，加标回收率高，为微量铬的测定提供了一种较为理想的分析方法，有较高的普及推广和应用价值。昝川南[8]进行食用明胶中微量铬含量测定的方法研究，结果表明样品使用硝酸-双氧水消解体系进行微波密闭消解，并采用原子吸收-石墨炉法测定食用明胶中微量铬，灵敏度高、精密度高、回收率高，质控样测定结果接近中值，是适合用于明胶中微量铬测定的较好的方法。李辉等[9]利用双波长双指示剂催化动力学光度法测定市售散装低价粉条中铬含量，方法准确度好、重现性好。王玉兰等[10]采用氢化物原子荧光光度法测定婴幼儿配方奶粉中的铬、铅、无机砷含量。
目前，催化动力学测定微量铬在水处理方面研究较多[11-14]，在食品检测中应用研究相对较少[15-17]。催化动力学测定方法可作为一种操作简单的食品组分定量分析手段。白静等[18]建立了溴酸钾-酸性铬蓝K催化动力学反应体系测定酱油中甲醛含量。赵桦萍等[19]催化动力学光度法测定肉制品中亚硝酸盐含量，精密度高、准确性好。郭振良等[20]利用催化动力学光度法测定奶制品中微量三聚氰胺，操作简单、选择性好。
4 结论
建立催化动力学光度法测定微量铬的Cr（Ⅵ）-H2O2-溴甲酚绿的催化反应体系。通过单因素试验确定最佳试验条件：在波长为610nm的条件下，使用5.00mL、pH 4.4的HAc-NaAc缓冲溶液，0.10 mL 3%的过氧化氢溶液，0.40 mL的溴甲酚绿溶液，随后在60℃的恒温水浴锅中加热5 min。方法相对标准偏差为4.0%，精密度良好，t检验结果显示其与ICP-MS方法相比，不存在显著性差异。该方法操作简便，分析成本低，而且准确性较高，可以较好用于鲜虾中微量铬的测定。
[1] 李强,舒永红,霍柱健,等.石墨炉原子吸收光谱法测定鲜虾中镉含量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报,2020,11(20):7397-7403.LI Qiang,SHU Yonghong,HUO Zhujian,et al.Uncertainty evaluation for the determination of cadmium in fresh shrimp by graphite furnace atomic absorption spectroscopy[J].Journal of Food Safety&Quality,2020,11(20):7397-7403.
[2] 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中污染物限量:GB 2762—2017[S].北京:中国标准出版社,2017.National Health and Family Planning Commission,China Food and Drug Administration.Food safety national standard Contaminant limits in food:GB 2762—2017[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[3]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中铬的测定:GB 5009.123—2014[S].北京:中国标准出版社,2015.National Health and Family Planning Commission.Food safety national standard Determination of chromium in foods:GB 5009.123—2014[S].Beijing:Standards Press of China,2015.
[4]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品中多元素的测定:GB 5009.268—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.National Health and Family Planning Commission,China Food and Drug Administration.Food safety national standard Determination of calcium,iron,zinc,sodium,potassium,magnesium,copper and manganese in foods for infants and young children,milk and milk products:GB 5009.268—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[5] 郭楠楠,段秋虹.催化动力学光度法测定食品中的痕量硒[J].食品工业,2019,40(7):317-320.GUO Nannan,DUAN Qiuhong.Catalytic kinetic spectrophotometric determination of trace selenium in foods[J].The Food Industry,2019,40(7):317-320.
[6] 朱有涛,张遐,邵梅,等.微波消解ICP-MS法检测肉制品中的铅、铬、镉、铝、锰、锡[J].食品研究与开发,2018,39(14):172-176.ZHU Youtao,ZHANG Xia,SHAO Mei,et al.Determination of plumbum,chromium,cadmium,manganese,aluminum and tin in meat product by microwave digestion with ICP-MS method[J].Food Research and Development,2018,39(14):172-176.
[7] 高向阳,高遒竹,张小燕,等.微波消解-流动注射化学发光法快速测定调味品中的微量铬[J].中国调味品,2016,41(10):101-104,108.GAO Xiangyang,GAO Qiuzhu,ZHANG Xiaoyan,et al.Rapid determination of trace chromium in condiment by flow injection chemiluminescence method after microwave digestion[J].China Condiment,2016,41(10):101-104,108.
[8] 昝川南.食用明胶中微量铬含量测定的方法研究[J].食品研究与开发,2019,40(5):197-202.ZAN Chuannan.The research on determination of trace chromium in edible gelatin[J].Food Research and Development,2019,40(5):197-202.
[9] 李辉,周长虹,徐文聪,等.市售散装低价粉条中有害物质铝和铬的检测[J].农产品加工,2017(21):42-44,48.LI Hui,ZHOU Changhong,XU Wencong,et al.Detection of harmful substances alum and industrial gelatinand in the commercial vermicelli[J].Farm Products Processing,2017(21):42-44,48.
[10]王玉兰,徐红颖,包玉龙.婴幼儿配方奶粉中重金属铬、铅、砷的含量测定[J].食品研究与开发,2015,36(7):102-105.WANG Yulan,XU Hongying,BAO Yulong.Determination of the content of heavy metals chromium,lead,arsenic in infant formula dried milk[J].Food Research and Development,2015,36(7):102-105.
[11]朱化雨,杨秀英,谭继承.催化动力学光度法测定水中痕量铬(Ⅵ)[J].山东师大学报(自然科学版),1994,9(1):38-39.ZHU Huayu,YANG Xiuying,TAN Jicheng.Determination of trace chromium(Ⅵ)in water by catalytic kinetic method[J].Journal of Shandong Normal University(Natural Science),1994,9(1):38-39.
[12]赵桦萍.催化动力学光度法测定工业废水中的Cr(Ⅵ)[J].化工环保,2016,36(3):345-349.ZHAO Huaping.Determination of Cr(Ⅵ)in industrial wastewater by catalytic kinetic spectrophotometry[J].Environmental Protection of Chemical Industry,2016,36(3):345-349.
[13]XIA S P,SONG Z L,JEYAKUMAR P,et al.A critical review on bioremediation technologies for Cr(VI)-contaminated soils and wastewater[J].Critical Reviews in Environmental Science and Technology,2019,49(12):1027-1078.
[14]PARLAYICI S,PEHLIVAN E.Comparative study of Cr(VI)removal by bio-waste adsorbents:Equilibrium,kinetics,and thermodynamic[J].Journal of Analytical Science and Technology,2019,10(1):15.
[15]张皓爽,姬泓巍,宰敬喆,等.过氧化氢-茜素红s体系催化动力学分光光度法测量痕量钴(Ⅱ)[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2017,47(11):61-69.ZHANG Haoshuang,JI Hongwei,ZAI Jingzhe,et al.Catalytic kinetic determination of trace cobalt(Ⅱ)based on oxidation of alizarin red s by hydrogen peroxide[J].Periodical of Ocean University of China,2017,47(11):61-69.
[16]开小明,徐伟,吴健,等.碘酸钾-酸性铬蓝K催化动力学光度法测定人发中微量铁[J].广州化工,2019,47(6):101-102.KAI Xiaoming,XU Wei,WU Jian,et al.Determination of microamount iron of human hair by catalytic kinetic spectrophotometry with potassium iodate oxidation acidic chromium blue K[J].Guangzhou Chemical Industry,2019,47(6):101-102.
[17]韩虹,韩星,苏天鹅.催化动力学光度法测定水果中的痕量铁[J].广州化工,2015,43(11):129-130,167.HAN Hong,HAN Xing,SU Tiane.Determination of trace iron in fruit using catalytic kinetic spectrophotometry[J].Guangzhou Chemical Industry,2015,43(11):129-130,167.
[18]白静,王会,舒航.催化动力学光度法测定酱油中甲醛含量[J].食品科技,2019,44(10):362-366.BAI Jing,WANG Hui,SHU Hang.Catalytic kinetic spectrophotometric determination of formaldehyde in soy sauce[J].Food Science and Technology,2019,44(10):362-366.
[19]赵桦萍,陈伟,李涛.催化动力学光度法测定肉制品中亚硝酸盐含量[J].中国调味品,2016,41(6):139-141.ZHAO Huaping,CHEN Wei,LI Tao.Kinetic spectrophotometric determination of nitrite in meat product[J].China Condiment,2016,41(6):139-141.
[20]郭振良,唐清华,蒙延峰,等.催化动力学光度法测定奶制品中微量三聚氰胺[J].理化检验-化学分册,2013,49(11):1349-1351.GUO Zhenliang,TANG Qingha,MENG Yanfeng,et al.Catalytic kinetic photometric determination of trace amount of melamine in dairy products[J].Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis),2013,49(11):1349-1351.