沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科沙棘属小乔木或灌木[1]。沙棘果油与沙棘籽油是从沙棘的果实中提取的一种有特色的、有价值的油品，具有极高的食用和药用价值[2-4]。沙棘果油富含酚类、黄酮类、有机酸、多糖等生物活性物质和人体所需的各种营养物质，如维生素、不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素等[5-8]，具有抗氧化、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长、止咳祛痰、抗辐射、活血散瘀、防治冠状动脉粥样硬化等作用[9-12]，广泛应用于食品、药品、保健品和化妆品行业。
油脂精炼为除去沙棘果油中杂质的过程，包括脱胶、脱色、脱酸、脱臭等一系列工序[13]。目前植物油常用的脱胶方法有水化脱胶、酸法脱胶、酶法脱胶、吸附脱胶、膜法脱胶和螯合脱胶等[13-15]。目前对沙棘果油的研究，多集中于应用超声辅助酶法提取沙棘果油，有关超声辅助酶法对沙棘果油脱胶的工艺鲜有报道。基于此，该文在优化沙棘果油酶法脱胶的基础上，将超声波与酶法脱胶相结合，研究超声处理对沙棘果油酶法脱胶的作用效果，以期为高品质沙棘果油的工业化提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘果油（磷脂含量1.210 mg/g）：新疆慧华沙棘生物科技有限公司；磷脂酶A1（酶活≥10 kUL/g）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氢氧化钠、柠檬酸、丙酮（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
KQ-250DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；JJ-1电动搅拌器：金坛市医疗仪器厂；PHB-4型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；TDL-5-A飞鸽牌离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 pH值和磷含量的测定
反应体系pH值的测定，依据Jahani等[16]报道的方法测定pH值，校正公式为pH实际=pH测定－0.26。
样品磷含量的测定采用重量法，参考GB/T 5537—2008《粮油检验磷脂含量的测定》。
1.3.2 超声辅助酶法脱胶工艺
沙棘果油10.00 g，80℃水浴，加入50%柠檬酸0.030 mL，搅拌20 min，取出冷却至室温25℃，加入一定量4%NaOH，加入去离子水，400 r/min搅拌5 min，加入磷脂酶，转到超声波反应器中，设定温度、时间和功率，搅拌，反应结束后，95℃水浴加热灭酶搅拌，3 000 r/min离心15 min，收集上层油相测定各项指标。
1.3.3 单因素试验设计
确定初始提取条件为超声温度50℃，去离子水添加量2%，pH 5.0，超声时间40 min，超声功率150 W，酶添加量4%，3 000 r/min离心15 min，在此基础上考察不同酶添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、超声温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（4.2、4.5、4.8、5.0、5.3、5.5）、水添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、超声功率（100、125、150、175、200、225 W）对脱胶效果的影响。
1.3.4 响应面优化试验
根据单因素试验结果，采用Design-Expert 12对响应变量酶添加量（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、超声功率（D）和响应值磷脂含量（Y）进行设计与分析，因素水平设计见表1。
表1 响应面设计试验因素水平及编码
Table 1 Experimental factor level and coding table of response surface design
因素水平D超声功率/W-1 4 30 45 150 0 5 40 50 175 1 6 50 55 200 A酶添加量/%B超声时间/min C超声温度/℃
1.3.5 数据分析
采用Origin 2019软件作图，利用SPSS 22软件进行相关性分析和差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，并用Design-Expert 12软件对参数进行优化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 酶添加量对脱胶效果的影响
酶添加量对脱胶效果的影响见图1。
图1 酶添加量对脱胶效果的影响
Fig.1 Influence of enzyme dosage on degumming effect
由图1可知，随着磷脂酶添加量的增加，沙棘果油中的磷脂含量呈先下降后上升的趋势。当磷脂酶添加量为5%时，磷脂含量为0.259 mg/g，与添加量为4%时相比明显降低。这是因为磷脂酶对磷脂组分有水解作用，生成对应的溶血磷脂，溶血磷脂生成甘油酰磷脂[17]。当磷脂酶添加量达到5%时，沙棘果油磷脂含量降至最低，继续添加磷脂酶，水解力下降，沙棘果油磷脂含量上升。所以，磷脂酶添加量为5%时脱胶效果最优。
2.1.2 超声时间对脱胶效果的影响
超声时间对脱胶效果的影响见图2。
图2 超声时间对脱胶效果的影响
Fig.2 Influence of ultrasonic time on degumming effect
由图2可知，超声时间在10 min～40 min时，随时间的延长沙棘果油中的磷脂含量逐渐下降，超声时间在30 min～40 min时，磷脂含量迅速下降且降幅明显。当超声时间在40 min～60 min时，随时间的延长磷脂含量逐渐增加。当超声时间为40 min，磷脂含量为0.420 mg/g，与超声时间30 min时相比明显降低，因此选择超声时间为40 min。脱胶时间过长，磷脂会重新扩散到油相中，使胶体和油相发生局部的乳化现象[18]，超声时间是否充分，直接影响脱胶的效果[19]。
2.1.3 超声温度对脱胶效果的影响
超声温度对脱胶效果的影响见图3。
图3 超声温度对脱胶效果的影响
Fig.3 Influence of ultrasonic temperature on degumming effect
由图3可知，超声温度在35℃～50℃时，随着温度的升高，脱胶效率不断上升，磷脂含量降低；超声温度在50℃～60℃时，磷脂含量逐渐增加。当超声温度为50℃，磷脂含量为0.419 mg/g，与超声温度45℃时相比明显降低，因此选择超声温度为50℃。原因是温度对磷脂酶活性有着不同程度的影响。温度过低，影响磷脂酶与底物的结合，酶促反应效果差；当温度过高时酶的稳定性和酶活力降低[20]。
2.1.4 pH值对脱胶效果的影响
pH值对脱胶效果的影响见图4。
图4 pH值对脱胶效果的影响
Fig.4 Influence of pH value on degumming effect
由图4可知，随着pH值的增加，沙棘果油的磷脂含量随着pH值的升高呈现先下降后上升的趋势。pH值在4.2～4.8时，磷脂含量随pH值的增加迅速降低，当pH值在4.8～5.6时，磷脂含量逐渐升高。当pH值为4.8时，磷脂含量为0.589 mg/g，与pH值为4.5时相比明显降低。原因是酶在适宜的pH值范围内才能保持较高的活性，当酸碱度高于一定范围时，酶的活性降低甚至失活。因此，脱胶最佳pH值为4.8时脱胶效果最优。
2.1.5 水添加量对脱胶效果的影响
水添加量对脱胶效果的影响见图5。
图5 水添加量对脱胶效果的影响
Fig.5 Influence of water addition amount on degumming effect
由图5可知，当水添加量在1.5%～2.5%时，沙棘果油中的磷脂含量随着水添加量的增加不断下降，脱胶效率不断上升。当水添加量大于2.5%时磷脂含量迅速上升，涨幅明显。当水添加量为2.5%时，磷脂含量为0.588 mg/g，与添加量2%时相比明显降低。说明随着水添加量的不断增加，部分磷脂会发生凝固和沉淀的现象，水添加量过多则会发生胶体和油体乳化现象，导致反应结束后难以分离[21]。所以，水添加量为2.5%时脱胶效果最优。
2.1.6 超声功率对脱胶效果的影响
超声功率对脱胶效果的影响见图6。
图6 超声功率对脱胶效果的影响
Fig.6 Influence of ultrasonic power on degumming effect
由图6可知，随着超声功率的增加，沙棘果油的磷脂含量呈先下降后上升的趋势。当超声功率增加到175 W时，磷脂含量降至最低且降幅明显，磷脂含量为0.294 mg/g。当超声功率在175 W～225 W范围时，磷脂含量逐渐升高。说明在低强度超声波对酶催化反应具有协同加速作用[22-23]，当超声波过高时会改变酶分子的内部结构，导致其失活[24]。因此，选择超声功率为175 W。
2.2 响应面优化试验结果与分析
根据单因素试验结果，以酶添加量（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、超声功率（D）为自变量，以磷脂含量（Y）为响应值，通过使用Design-Expert 12软件，设计响应面试验为四因素三水平，其设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface test design and results
序号 A酶添加量/%磷脂含量/（mg/g）1 -1（4） 0（40） 0（50） 1（200） 0.757 2 0（5） 0 0 0（175） 0.097 3 0 1（50） 0 -1（150） 0.507 4 0 0 0 0 0.157 5 0 -1（30） -1（45） 0 0.557 6 1（6） 0 -1 0 0.557 7 -1 -1 0 0 0.587 8 0 0 0 0 0.096 9 -1 0 -1 0 0.587 10 1 1 0 0 0.507 11 0 0 -1 1 0.437 12 1 0 0 -1 0.577 13 0 0 0 0 0.097 14 -1 0 1（55） 0 0.647 B超声时间/min C超声温度/℃D超声功率/W
续表2 响应面试验设计与结果
Continue table 2 Response surface test design and results
序号 A酶添加量/%磷脂含量/（mg/g）15 -1 1 0 0 0.587 16 -1 0 0 -1 0.687 17 0 1 0 1 0.487 18 0 -1 1 0 0.427 19 1 0 1 0 0.567 20 0 1 -1 0 0.547 21 0 -1 0 1 0.287 22 0 0 -1 -1 0.567 23 0 0 1 1 0.437 24 0 -1 0 -1 0.597 25 1 0 0 1 0.327 26 0 0 1 -1 0.567 27 1 -1 0 0 0.487 28 0 0 0 0 0.096 29 0 1 1 0 0.617 B超声时间/min C超声温度/℃D超声功率/W
2.2.1 以磷脂含量为响应值的回归方程方差分析
由Design-Expert 12分析得到回归方程如下。
方差分析结果见表3。
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface test results
注：*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 0.970 14 0.069 21.620 <0.000 1**A 0.057 1 0.057 17.890 0.000 8**B 8.008×10-3 1 8.008×10-3 2.500 0.136 5 C 8.333×10-6 1 8.333×10-6 2.597×10-3 0.960 1 D 0.049 1 0.049 15.400 0.001 5**AB 1.000×10-4 1 1.000×10-4 0.031 0.862 4 AC 6.250×10-4 1 6.250×10-4 0.190 0.665 7 AD 0.026 1 0.026 7.980 0.013 5*BC 0.010 1 0.010 3.120 0.099 3 BD 0.021 1 0.021 6.550 0.022 7*CD 1.110×10-16 1 1.110×10-163.459×10-14 1.000 0 A2 0.460 1 0.460 144.220 <0.000 1**B2 0.220 1 0.220 67.040 <0.000 1**C2 0.320 1 0.320 99.720 <0.000 1**D2 0.230 1 0.230 70.770 <0.000 1**残差 0.045 14 3.209×10-3失拟项 0.042 10 4.200×10-3 5.740 0.053 5净误差 2.929×10-3 4 7.323×10-4总离差 1.020 28
由表3可知，回归模型在统计学上呈极显著（P＜0.01），说明该沙棘果油脱胶试验模型具有统计学意义；A、D、A2、B2、C2和 D2对磷脂含量的影响极显著，交互项AD和BD对模型的影响显著，说明试验因素与响应值不是简单的线性关系；失拟项结果为不显著（P＝0.053 5＞0.05），说明该试验模型具有较好的拟合度，方程模型的残差可能来源于试验过程中的随机误差。模型的R2Adj=0.911 6说明试验可靠、误差小，该模型能解释91.16%的响应值变化，R2为0.955 8,表明磷脂含量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度，该模型可预测沙棘果油超声辅助酶法脱胶工艺的实际情况。在试验所选取的各因素中，影响顺序为酶添加量＞超声功率＞超声时间＞超声温度。
2.2.2 响应曲面分析
响应面磷脂含量与酶添加量对沙棘果油脱胶效果的结果见图7～图8。
图7 超声功率与超声时间对沙棘果油脱胶效果的响应面和等高线
Fig.7 Response surface diagram and contour of ultrasonic power and ultrasonic time on deguming effect of seabuckthorn fruit oil
图8 超声功率与酶添加量对沙棘果油脱胶效果的响应面和等高线
Fig.8 Response surface and contour of ultrasonic power and enzyme addition to degumening effect of seabuckthorn fruit oil
由图7和图8可知，随着酶添加量、超声时间和超声功率的增大或延长，沙棘果油磷脂含量也随之下降，但当酶添加量、超声时间、超声功率增大或延长到一定程度后，沙棘果油磷脂含量呈上升的趋势，超声功率和超声时间、酶添加量和超声功率的交互作用对模型影响显著，其余均不显著，从等高线图中可以看出其椭圆程度和疏密程度，与模型回归中的方差分析一致。
2.3 最佳脱胶条件的验证
由响应面法试验分析数据可得出沙棘果油超声辅助酶法脱胶的最佳工艺为酶添加量5.140%、超声时间39.230 min、超声温度49.970℃、超声功率179.730 W，磷脂含量为0.095 mg/g。为了试验的可行，修正后工艺条件为酶添加量5%、超声时间39 min、超声温度50℃、超声功率为180 W，在此工艺条件下试验重复3次得到磷脂含量为0.097 mg/g。
3 结论
采用响应面法优化超声辅助酶法脱胶，通过单因素试验确定最佳酶添加量、超声时间、超声温度和超声功率，以磷脂含量作为响应值进行响应面试验建立回归方程进行分析。工艺条件为酶添加量5%、超声时间39 min、超声温度50℃、超声功率为180 W时，影响顺序为酶添加量＞超声功率＞超声时间＞超声温度，酶添加量和超声功率对沙棘果油脱胶后磷脂含量影响极显著。在最佳工艺条件下模型预测沙棘果油的磷脂含量为0.095 mg/g，验证试验重复进行3次，得到沙棘果油的磷脂含量实际值为0.097 mg/g，与预测值相差2.100%，说明该模型可行。利用超声辅助酶法对沙棘果油进行脱胶处理，磷脂含量降至最低。
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