甘露醇是一种六碳线型多元醇，为白色粉末结晶，其分子式为C6H14O6，分子量182.17[1]。甘露醇是一种重要的精细化工产品，在食品、医药和化工等行业具有广泛的应用[2-4]。甘露醇是食品和药物管理局允许使用的一种食品添加剂，人体吸收慢，可制作适合糖尿病人、肥胖病人食用的低热值、低糖的产品[5-8]。此外，它可作为无糖口香糖增塑剂、自由基清除剂和药物赋形剂[9-11]；因其渗透性高，也可作为利尿剂[12]。甘露醇存在于许多植物中，包括南瓜、芹菜、洋葱、橄榄等，也可以由细菌、酵母、真菌、地衣和藻类等微生物产生[6]，特别是在褐色海藻中均有存在，且提取效果明显[2]。目前，国内外生产甘露醇的方法主要为萃取法、化学合成法、发酵法和酶法等[6]。利用海藻提取的方法是我国生产甘露醇的主要方法[13]。目前世界甘露醇年产量与年总需求量不平衡，随着甘露醇应用领域的不断拓宽，甘露醇的需求量仍然会有较大的增长，发展前景乐观[14]。
张氏马尾藻（Sargassum zhangii）是我国亚热带沿海特有种类，主要分布于雷州半岛等，属于褐藻门，圆子纲，墨角藻目，马尾藻科，马尾藻属，是一种大型经济褐藻[15]。目前利用海带提取甘露醇的研究较多，但利用马尾藻提取甘露醇的研究鲜有报道。本文对张氏马尾藻中的甘露醇提取工艺进行了初步研究。考察浸提时间、浸提温度和料液比3个因素对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响，再根据正交试验优化得到最佳组合条件，旨在为张氏马尾藻甘露醇的工业化制备提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
张氏马尾藻（Sargassum zhangii）：2019年 9月下旬采集于广东省湛江市徐闻县南山镇二墩，晒干后备用。
D-甘露醇、L-鼠李糖、乙酸铵、乙酰丙酮（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；高碘酸钠、冰醋酸（均为分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；浓盐酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司 。
1.2 仪器与设备
FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；DHG-9245A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；AUY220电子天平（精度0.000 1 g）：日本岛津公司；DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；RJ-LDL-50A低速立式大容量离心机：无锡瑞江分析仪器有限公司；UV754紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 甘露醇水浴提取工艺流程
张氏马尾藻→烘干研磨至粉末状→水浴浸提→离心（5 000 r/min，15 min）→准确吸取1 mL上清液按标准曲线操作方法配制、加入试剂→测吸光度→计算甘露醇含量。
1.3.2 标准曲线的制作
D-甘露醇标准溶液（0.100 mg/mL）：准确称取D-甘露醇标准品10 mg，用纯水定容至100 mL即得。
Nash试剂：75.000 0 g乙酸铵、1 mL冰醋酸、1 mL乙酰丙酮混合，加纯水定容至500 mL即得。
取适量标准溶液分别稀释至 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL，备用。各移取1 mL上述稀释溶液分别置于具塞试管中；分别向各试管加入1 mL 15.10 mmol/L高碘酸钠溶液，混匀后室温25℃下静置10 min；各加入2 mL 0.1%L-鼠李糖溶液，混匀；依次加入4 mL新配制的Nash试剂，混匀后于53℃恒温水浴中加热15min使其显色，放置冷却至室温25℃；以纯水作为空白对照，在413 nm处测量D-甘露醇的吸光度（OD413）[16-17]。
1.3.3 单因素试验
1.3.3.1 浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
准确称取0.500 0 g张氏马尾藻藻粉，按料液比1∶100（g/mL）加入 50 mL 纯水，分别置于 50、60、70、80、90、100℃下水浴回流提取2 h后，5 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL测量吸光度，考察浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响，共6个组别，每组重复试验3次。
1.3.3.2 料液比对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
准确称取0.500 0 g张氏马尾藻藻粉，加入纯水使料液比分别为 1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶110（g/mL），浸提时间设为2 h，浸提温度设为100℃，研究料液比对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响，共6个组别，每组重复试验3次。
1.3.3.3 浸提时间对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
准确称取0.500 0 g张氏马尾藻藻粉，按料液比1∶100（g/mL）加入 50 mL 纯水，在 100℃下水浴回流提取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，考察浸提时间对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响，共6个组别，每组重复试验3次。
1.3.4 正交试验
根据单因素试验结果所确定的因素与水平，分别进行张氏马尾藻甘露醇提取工艺的L9（34）正交试验[18]，最终确定其最佳提取组合工艺条件。正交试验因素水平见表1。
表1 因素水平
Table 1 Factors and levels
水平浸提温度/℃浸提时间/h料液比/（g/mL）1 80 1.5 1∶90 2 90 2.0 1∶100 3 100 2.5 1∶110
1.4 数据处理
试验数据采用SPSS25和Excel 2010进行分析。
2 结果与分析
2.1 D-甘露醇标准曲线
D-甘露醇的标准曲线见图1。
图1 D-甘露醇的标准曲线
Fig.1 Standard curve of D-mannitol
由图1可知，D-甘露醇标准曲线方程为y=72.846x-0.7432，R2=0.9990。式中：y为D-甘露醇质量浓度，mg/L；x为吸光度（OD413）。该D-甘露醇标准曲线具有很好的线性关系。
2.2 张氏马尾藻甘露醇提取的单因素试验
2.2.1 浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响见图2。
图2 不同浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
Fig.2 Effects of different extracting temperature on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii
由图2可知，从整体趋势上看，随着浸提温度的上升，甘露醇的提取量随之增大，这是由甘露醇本身的物理特性所决定的，其溶解度在一定范围内会随着温度的升高而增大。由于水浴提取法的加热温度最高只能达到100℃，基于实验室的设备条件，甘露醇浸提温度选取为80、90、100℃。
2.2.2 料液比对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
料液比对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响见图3。
图3 不同料液比对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
Fig.3 Effects of different solid-liquid ratio on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii
由图 3 可知，当料液比从 1∶60（g/mL）至 1∶100（g/mL）递变，甘露醇的提取量逐渐增加；当料液比达到 1∶100（g/mL），甘露醇提取量达到最大；但当料液比达到1∶110（g/mL）时，甘露醇提取量反而下降。因此，张氏马尾藻甘露醇提取的料液比选取为1∶90、1∶100、1∶110（g/mL）。
2.2.3 浸提时间对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
浸提时间对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响见图4。
图4 不同浸提时间对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响
Fig.4 Effects of different extracting time on extraction content of mannitol from Sargassum zhangii
由图4可知，浸提时间在1.0 h～2.0 h时，浸提时间越长，甘露醇提取量越大，这可能是因为随着回流时间的加长使得甘露醇充分溶解于溶剂中；当浸提时间为2.0 h时，甘露醇提取量达到峰值；然而当浸提时间超过2.0 h，提取量开始下降。因此，张氏马尾藻甘露醇的浸提时间选取为1.5、2.0、2.5 h。
2.3 张氏马尾藻甘露醇提取的正交试验结果
根据单因素试验所得的结果，以浸提温度、浸提时间、料液比这3个单因素为考察因素，各取3个水平，进行L9（34）的正交试验设计，以确定张氏马尾藻甘露醇的最佳提取条件，以甘露醇提取量为评价指标。正交试验结果见表2。
表2 张氏马尾藻甘露醇提取的正交试验方案与结果
Table 2 The orthogonal test scheme and results of mannitol extraction from Sargassum zhangii
试验号 A浸提温度 时间 C料液比 D空白 甘露醇提取量/（mg/g）1 1 1 1 1 4.971 5 2 1 2 2 2 5.327 5 3 1 3 3 3 5.075 8 4 2 1 2 3 5.296 0 5 2 2 3 1 5.020 8 6 2 3 1 2 5.105 9 7 3 1 3 2 5.491 4 8 3 2 1 3 5.448 7 9 3 3 2 1 5.537 6 k1 5.125 5.253 5.175 5.177 k2 5.141 5.266 5.387 5.308 k3 5.493 5.240 5.196 5.274 R 0.368 0.026 0.215 0.131 B浸提
由表2可知，A、B、C因素的极差分别为 0.368、0.026、0.215，表明本试验中，浸提温度对张氏马尾藻甘露醇提取量的影响最大，其次为料液比，浸提时间影响最小。张氏马尾藻甘露醇提取的最佳水平组合为A3B2C2，即最佳工艺条件为浸提温度100℃、料液比1∶100（g/mL）、浸提时间 2.0 h。经 3 组验证试验，在上述最佳组合条件下，张氏马尾藻甘露醇的平均提取量为5.636 mg/g，高于正交试验各组合，由此证明该正交试验的实际最佳水平组合与理论最佳水平组合一致。
3 结论
研究采用水浴浸提法提取张氏马尾藻中的甘露醇，结果表明对提取效果影响最大的因素是浸提温度，其次是料液比，影响最小的是浸提时间。张氏马尾藻甘露醇提取的最佳工艺条件为浸提温度100℃、料液比 1∶100（g/mL）、提取时间 2.0 h。经验证试验，在最优条件下提取的甘露醇平均提取量为5.636 mg/g。试验结果丰富了利用马尾藻提取甘露醇的研究，可为以马尾藻为原料的甘露醇产业化提供参考。
[1] GHOREISHI S M,SHAHRESTANI R G.Innovative strategies for engineering mannitol production[J].Trends in Food Science&Technology,2009,20(6/7):263-270.
[2] SAHA B C,RACINE F M.Biotechnological production of mannitol and its applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(4):879-891.
[3] 王春霞,王晓梅,张娟娟,等.甘露醇的生产应用进展[J].轻工科技,2013,29(8):43-45.WANG Chunxia,WANG Xiaomei,ZHANG Juanjuan,et al.Progress in production and application of mannitol[J].Light Industry Science and Technology,2013,29(8):43-45.
[4]CHEN M,ZHANG W L,WU H,et al.Mannitol:Physiological functionalities,determination methods,biotechnological production,and applications[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104(16):6941-6951.
[5]MARTǍU G A,COMAN V,VODNAR D C.Recent advances in the biotechnological production of erythritol and mannitol[J].Critical Reviews in Biotechnology,2020,40(5):608-622.
[6]DAI Y W,MENG Q,MU W M,et al.Recent advances in the applications and biotechnological production of mannitol[J].Journal of Functional Foods,2017,36:404-409.
[7]VON WEYMARN F N W,KIVIHARJU K J,JAASKELAINEN S T,et al.Scale-up of a new bacterial mannitol production process[J].Biotechnology Progress,2003,19(3):815-821.
[8] ZHANG M,GU L,CHENG C,et al.Recent advances in microbial production of mannitol:Utilization of low-cost substrates,strain development and regulation strategies[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2018,34(3):1-7.
[9]GREMBECKA M.Sugar alcohols—their role in the modern world of sweeteners:A review[J].European Food Research and Technology,2015,241(1):1-14.
[10]OHREM H L,SCHORNICK E,KALIVODA A,et al.Why is mannitol becoming more and more popular as a pharmaceutical excipient in solid dosage forms?[J].Pharmaceutical Development and Technology,2014,19(3):257-262.
[11]ANDRÉ P,VILLAIN F.Free radical scavenging properties of mannitol and its role as a constituent of hyaluronic acid fillers:A literature review[J].International Journal of Cosmetic Science,2017,39(4):355-360.
[12]詹天荣.甘露醇系列衍生物的合成及其生物活性[D].青岛:中国科学院海洋研究所,2004.ZHAN Tianrong.The synthesis and bioactivities of series derivatives from D-mannitol[D].Qingdao:Institute of Oceanology,Chinese A-cademy of Sciences,2004.
[13]魏倩倩.甘露醇的生产与应用研究进展[J].食品工业科技,2010,31(12):401-404.WEI Qianqian.Research progress in preparation and application of mannitol[J].Science and Technology of Food Industry,2010,31(12):401-404.
[14]胡梦莹,张涛.微生物发酵转化甘露醇的研究进展[J].食品与发酵工业,2020,46(18):245-251.HU Mengying,ZHANG Tao.Research progress on mannitol production by microbial fermentation[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(18):245-251.
[15]曾呈奎.中国海藻志[M].北京:科学出版社,2005.ZENG Chengkui.Records of Chinese seaweed[M].Beijing:Science Press,2005.
[16]蒋华,陈卫,赵建新,等.分光光度法测定乳酸菌发酵体系中甘露醇的含量[J].食品与发酵工业,2005,31(4):105-107.JIANG Hua,CHEN Wei,ZHAO Jianxin,et al.Quantitative analysis of mannitol in lactic acid bacteria broth with a spectrophotometric method[J].FoodandFermentationIndustries,2005,31(4):105-107.
[17]李雪芹,包天桐,王雁.比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量[J].中草药,1999,30(1):19-21.LI Xueqin,BAO Tiantong,WANG Yan.Determination of mannitol in Dongchongxiacao(Cordyceps sinensis)by colorimetric method[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,1999,30(1):19-21.
[18]徐仲安,王天保,李常英,等.正交试验设计法简介[J].科技情报开发与经济,2002(5):148-150.XU Zhongan,WANG Tianbao,LI Changying,et al.Brief introduction to the orthogonal test design[J].Sci/Tech Information Development&Economy,2002(5):148-150.