橙子是我国常见的一种柑橘类水果，其表皮颜色鲜艳，果肉和果汁占比高，味道清甜，营养丰富。橙子属于不容易腐烂发霉的水果，保存期相对较长。橙子有较高的营养价值，维生素含量较高[1]。此外还具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗过敏、延缓衰老、滋润养颜、补肝安神等重要生理功能，有益于人体健康[2-4]。番茄是一种常见的营养丰富的果蔬，外观呈红色，既可以生食、炊后食用，也可加工制成酱、汁或制成番茄罐头保藏，是老幼皆宜的果蔬[5]。番茄中的番茄红素含量较高[6]，番茄红素具有抗氧化功能和清除自由基能力，还能发挥抗衰、抑癌等生理功能[7-8]。由于番茄不宜长时间贮存且不能长途运输，采摘后应尽快利用，避免造成严重损失[9]。随着消费多元化和营养健康果酒方面消费需求的增长，市面上单一品种的葡萄酒已经不能满足消费者的需要[10]，因此以橙子和番茄作为主要原料，研制具有抗氧化能力且高营养价值的酿制复合果酒，可以满足消费者对健康多元化食品的需要。
挥发性成分的种类、含量影响着果酒的感官品质[11]。傅里叶红外光谱技术（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）具有无损快速鉴定复杂体系官能团的特点。橙子和番茄中的抗氧化活性成分随着发酵过程的进行，逐渐渗透到酒液中，使果酒具有清除自由基的作用[12]。本试验以橙子、番茄为主要试材，通过改变果浆体积比、焦亚硫酸钠添加量、初始糖度、酵母接种量4个条件，以优化混合果酒的发酵工艺，在分析各因素对混合果酒的感官品质影响的基础上，采用响应面（Box-Behnken）试验优化条件。采用气相色谱-质谱联用技术对优化后的混合果酒的香气成分进行分析，并对混合果酒的抗氧化性能进行分析，采用傅里叶红外光谱技术测定果酒的特征官能团信息，丰富果酒的市场。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
伦晚橙、番茄：市售；蔗糖：厦门古龙食品有限公司；葡萄酒、果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；纤维素酶（100 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；焦亚硫酸钠（食品级）：河南华兴生物科技有限公司；无水柠檬酸（食品级）：福建缘菱鑫生物科技有限公司；硫酸亚铁、水杨酸、无水乙醇、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AR12CN型电子天平、STARTER 2100酸度计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；DK-S24恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；PYX-300G-B恒温培养箱：广东科力韶关实验仪器有限公司；PAL-1糖度计：广州爱拓（ATAGO）科学仪器有限公司；RHW-80酒精浓度计：漳州市新奥光电仪器有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；V-1100D可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；MJWBL5431J搅拌机：广东美的生活电器制造有限公司；H1850医用离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；QP2010气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；TENSORⅡ傅里叶红外光谱仪：德国布鲁克科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 混合果酒发酵操作要点
将橙子和番茄清洗干净，切块后在打浆机中打浆，橙子果浆[橙子∶水=1∶1（体积比）]与番茄果浆[番茄∶水=2∶1（体积比）]按照一定体积比混合，混合果浆加入一定量的焦亚硫酸钠，80 mg/L果胶酶和80 mg/L的纤维素酶，搅拌溶解，放入50℃水浴锅中酶解2 h，随后以白砂糖调节混合果浆的初始糖度，以柠檬酸调节pH值至3.5。将一定量的酵母加入到30 mL糖液（糖度为5°Brix）中，在38℃下活化0.5 h。将酵母液加入至果浆完成酵母接种，密封置于25℃恒温培养箱进行发酵。形成的混合果酒经过澄清、过滤后，将成品进行糖度、酒精度测定和感官评定。
1.3.2 单因素试验
按照 1.3.1 的方法，研究果浆体积比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、初始糖度（16、18、20、22、24、26 °Brix）、焦亚硫酸钠添加量（10、30、50、70、90 mg/L）、酵母接种量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L） 和发酵时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9 d）对混合果酒品质的影响。
1.3.3 响应面试验
分析单因素试验对混合果酒品质的影响，选择初始糖度、焦亚硫酸钠添加量、酵母接种量进行响应面优化，得到混合果酒的最佳工艺。试验因素水平见表1。
表1 响应面因素水平设计
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken testes design
水平C酵母接种量/（g/L）-1 22 50 0.3 0 24 70 0.4 1 26 90 0.5因素A初始糖度/°Brix B焦亚硫酸钠添加量/（mg/L）
1.3.4 混合果酒体外抗氧化活性测定
·OH清除率和Fe3+还原力的测定参考程宏桢等[12]的方法。
1.3.5 理化指标及感官评价方法
色度和透光率参考梁冬梅等[13]的方法；酒精度采用酒精度计测定；pH值采用酸度计测定；糖度采用糖度计测定；还原糖、干浸出物参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用试验方法》进行测定；感官评价参照GB/T 15037—2006《葡萄酒》检测。邀请接受过感官培训的评定小组（10人），对混合果酒的色泽、透明度、香气、滋味及典型性进行综合评价，最终得分取平均值，评分标准见表2。
表2 感官评分标准
Table 2 Sensory rating criteria
项目 标准 分值色泽（10分） 呈淡橙色或淡红色 9～10呈橙色或红色 6～8呈棕黄色 3～5呈暗褐色 0～2透明度（10分） 透过瓶身可清晰看见物体，纯净透明 9～10在正常光线下有光亮 6～8酒液乌暗 3～5明显混浊 0～2香气（30分） 酒香味清晰，芬芳馥郁 21～30香气清淡 11～20刺激性酒味 0～10滋味（30分） 口味醇正，柔和适口，回味香甜 21～30酸甜适中，回味单一 11～20有酸涩味，存在口味缺陷 0～10典型性（20分） 橙子番茄果香特征及风格突出 14～20有独特风格，但不够突出 7～13无特征 0～6
1.3.6 香气成分测定
采用气相色谱-质谱联用，参考马德秀等[14]、高馨雨等[15]和贾恺等[16]的方法进行测定。
1.3.7 特征官能团测定
将酒液干燥后进行FTIR测定。
1.4 数据处理
采用Excel 2019整合数据，Origin 8.5绘图，Design Expert8.0.6进行响应面优化。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 果浆体积比对混合果酒感官评分的影响
将橙子和番茄的果浆分别按照 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的体积比进行混合，添加果酒专用酵母进行发酵，发酵8 d后对混合果酒进行感官评价，感官评分见图1。
图1 不同果浆体积比制得的混合果酒的感官评分
Fig.1 Sensory evaluation of mixed fruit wine prepared with different pulp volume ratio
由图1可知，橙子和番茄果浆体积比为1∶2时，发酵制得的混合果酒感官评分最高。在此条件下，混合果酒颜色呈淡橙色或淡红色，有光泽且澄清，口感较柔和。番茄的香甜味较大程度地掩盖了橙子的苦味。因此，后续优化试验选用果浆体积比1∶2酿造混合果酒。
2.1.2 发酵时间对混合果酒发酵的影响
不同初始糖度下混合果酒糖度随着时间的变化结果见图2。
图2 不同初始糖度下糖度随发酵时间的变化
Fig.2 Change in sugar contents with fermentation time under different initial sugar content
由图2可知，随着混合果酒发酵时间的延长，混合果酒的糖度逐渐降低，发酵6 d后，糖度呈稳定趋势。因此，后续优化试验选择发酵时间为6 d。
2.1.3 初始糖度对混合果酒发酵的影响
初始糖度对混合果酒发酵的影响见图3。
由图3可知，初始糖度在16°Brix～24°Brix范围内，酒精度随初始糖度增加而上升。这是由于在此初始糖度范围内，可利用营养物质多，酵母生长繁殖旺盛，生成酒精量就越多。初始糖度在24°Brix～26°Brix范围内，酒精度变化很小。这是由于酒液中糖含量较高，发酵酒液渗透压升高，酵母不能生长到理想的状态，影响了酒精的合成。由于果酒酒精度不必要求过高，而过高的糖度会影响混合果酒口感并且浪费材料，结合感官评分的结果，确定初始糖度为24°Brix为较优条件。
图3 初始糖度对混合果酒发酵的影响
Fig.3 Effect of initial sugar content on fermentation of fruit wine
2.1.4 焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响
焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响见图4。
图4 焦亚硫酸钠添加量对混合果酒发酵的影响
Fig.4 Effect of addition amount of sodium pyrosulfite on fermentation of fruit wine
由图4可知，在试验范围内，焦亚硫酸钠添加量为70 mg/L时，酒精度最大。混合果酒中添加焦亚硫酸钠可降低微生物的生存率，焦亚硫酸钠添加量在10mg/L～70 mg/L时，酒液中其他杂菌难以存活而酵母菌可以生存，酒液中的白砂糖被酵母菌中的蔗糖酶水解为单糖，生成酒精和CO2，因此酒精度升高，糖度降低。当焦亚硫酸钠添加量为90 mg/L时，焦亚硫酸钠浓度过高抑制酵母菌的生长繁殖，酵母菌无法利用白砂糖转化为酒精，因此酒精度低，糖度升高。结合感官评分，确定焦亚硫酸钠添加量70 mg/L为较优条件。
2.1.5 酵母接种量对混合果酒发酵的影响
酵母接种量对混合果酒发酵的影响见图5。
图5 酵母接种量对混合果酒发酵的影响
Fig.5 Effect of inoculation amount of yeast on fermentation of fruit wine
由图5可知，当酒液中酵母接种量为0.4 g/L时，酒精度最大，糖度最小。酵母接种量低于0.4 g/L时，酵母繁殖量低，混合果酒不能得到充分发酵，因此糖不能被酵母全部吸收转化，从而酒精度低，糖度高。而酵母添加量较高时，添加量越高，酵母的生存竞争力越大，导致酵母存活率越低，最终糖度升高，酒精度降低。当酵母接种量为0.4 g/L时，酵母存活率高，且存活状态旺盛，因此糖利用率较高，糖度较低而酒精度高，结合感官评分，确定酵母接种量0.4 g/L为较优条件。
2.2 响应面优化
2.2.1 响应面试验结果
优化试验结果见表3。
表3 响应面试验设计方案及结果
Table 3 Results of Box-Behnken central composite design
B C 感官评分1 0 70 2-1 75 3-1 0 -1 71 4 0 0 0 81 1 0 5-1 1 78 6 0-1 -1 77 0 7 73 8 1-1 0 75 1 0 1 82 10 -1 -1 0 71 11 0 1 -1 69 12 -1 0 1 74 13 -1 1 0 68 14 0 0 0 81 15 0 0 0 83 16 0 1 1 72 17 0 0 0 80 9 0 0 0
根据Design Expert V8.0.6软件的分析，得到A初始糖度、B焦亚硫酸钠添加量、C酵母接种量对感官评分的回归方程：感官评分=81.4+1.13A-2.75B+0.63C-0.5AB-1.25AC+0.5BC-5.58A2-4.83B2-2.57C2。
2.2.2 方差分析
回归模型的方差分析结果见表4。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance of regression model
注：* 表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 365.58 9 40.62 23.79 0.000 2 **A初始糖度 10.13 1 10.13 5.93 0.045 1 *B焦亚硫酸钠添加量60.5 1 60.5 35.44 0.000 6 **C酵母接种量 3.13 1 3.13 1.83 0.218 1 AB 1 1 1 0.59 0.469 1 AC 6.25 1 6.25 3.66 0.097 3 BC 1 1 1 0.59 0.469 1 A2 130.87 1 130.87 76.66<0.000 1 **B2 98.02 1 98.02 57.42 0.000 1 **C2 27.92 1 27.92 16.35 0.004 9 **残差 11.95 7 1.71失拟项 6.75 3 2.25 1.73 0.298 4纯误差 5.2 4 1.3总和 377.53 16
由表 4可知，该模型极显著（P=0.000 2＜0.01），失拟项不显著（P=0.298 4＞0.05），模型的选取具有合理性。决定系数R2=0.968 3，校正系数R2adj=0.927 6，表明此模型可以用于可靠分析混合果酒的发酵工艺。一次项初始糖度差异显著（P＜0.05），焦亚硫酸钠添加量差异极显著（P＜0.01），交互项表现不显著（P＞0.05），二次项 A2、B2、C2差异均为极显著（P＜0.01），表示本试验的因素选择合理。根据F值可判断因素对响应值的影响程度，表4中一次项所对应的F值大小排序为B＞A＞C，表明焦亚硫酸钠添加量影响力最强，酵母接种量影响最弱。
2.2.3 交互作用分析
根据3D响应图中各因素的走势可以推断对响应值的作用大小。响应面曲面中，越平坦的曲面可判定为影响响应值的能力越小，反之亦然。各因素对混合果酒感官评分影响的响应面图见图6。
由图6可知，从曲面的倾斜度可以判断，焦亚硫酸钠添加量的曲面最陡峭，表明对感官评分的影响最大，初始糖度的曲面次之，酵母接种量的曲面最平缓，这与方差分析的结果一致[17]。
图6 各因素对混合果酒感官评分影响的响应面
Fig.6 Response surface graph of the effects of different factors on sensory score of mixed fruit wine
2.2.4 混合果酒最佳条件的验证
通过软件分析与优化，最优发酵参数为初始糖度24.21°Brix、焦亚硫酸钠添加量 64.25 mg/L、酵母接种量0.41 g/L，该数据下混合果酒的感官评分为81.875 5分。为了使试验操作更好地进行，修正后的参数值为初始糖度24.2°Brix、焦亚硫酸钠添加量65 mg/L、酵母接种量0.41 g/L，进行3次平行，得出的混合果酒感官评分为83分，与预测的数值十分接近，表示该试验结果可信度较高，也可以更好地预测混合果酒的发酵条件会如何影响感官评分。
2.3 混合果酒的性质分析
2.3.1 混合果酒抗氧化活性分析
混合果酒·OH清除能力见图7。
图7 混合果酒·OH清除率
Fig.7 The scacenging ability of·OH of mixed fruit wine
由图7可知，混合果酒的·OH清除率较高，在样品添加量范围内变化幅度较小，VC的·OH清除率在添加量为0.3 mL～1.2 mL之间呈现上升趋势，在添加量高于1.2 mL后，持续保持较高的清除率。在样品添加量0.3 mL～1.2 mL时，混合果酒的清除率高于VC的清除率，当混合果酒的添加量为0.3 mL时，其·OH清除率已经达到98%。样品添加量为1.2 mL～2.0 mL时，混合果酒和VC的清除率都保持较高状态，且VC的清除率略高于混合果酒的清除率[18]。
混合果酒对Fe3+还原力的影响见图8。
图8 混合果酒对Fe3+还原力的影响
Fig.8 The effect of fruit wine on Fe3+reducing ability
由图8可知，在样品添加量范围内，混合果酒及VC的Fe3+还原力均随着样品添加量的增加而逐渐增大，最后趋于稳定。由于番茄中存在的番茄红素具有强力的抗氧化特性，且在工艺过程中添加了焦亚硫酸钠（抗氧化剂），与 FeCl3发生反应可以使 K3[Fe（CN）6]的 Fe3+还原为Fe2+。混合果酒在添加量为0.25 mL～1.50 mL时，其Fe3+还原力小于VC的Fe3+还原力，当混合果酒添加量为1.75 mL～2.00 mL时，混合果酒的Fe3+还原力略高于 VC的 Fe3+还原力[19]。
2.3.2 指标分析
由最优工艺进行3组平行验证试验，测定出混合果酒的酒精度 9.6%vol，pH3.5，糖度 7.6 °Brix，透光率73.1%，色度1.303，还原糖54.12 g/L，干浸出物28.4 g/L，感官评分81分。
2.3.3 香气成分分析
混合果酒的主要香气成分见表5。
表5 混合果酒的香气成分
Table 5 Aroma components of fruit wine
序号 化合物名称 保留时间/min化学式 香气特征 峰面积百分比/%酯类1 硫酸二丁酯 2.205 C8H18O4S 花香香韵 16.22 2 乙酸丁酯 2.774 C6H12O2 果子香味 0.08 3 丁酸乙酯 3.307 C6H12O2 菠萝香味 0.16 4 甲酸正己酯 4.957 C7H14O2 水果香味 2.49 5 乙酸异戊酯 5.164 C7H14O2 香蕉气味 3.64 6 己酸乙酯 8.633 C8H16O2 曲香、菠萝香型香气 1.65 7 乙酸叶醇酯 8.816 C8H14O2 香蕉香气息 0.28 8 乙酸己酯 9.032 C8H16O2 梨、苹果香气 0.95 9 4-羟基丁酸甲酯10.193 C5H10O3 水果香气 0.37 10 苯甲酸乙酯 13.208 C9H10O2 水果气味 0.04 11 辛酸乙酯 13.969 C10H20O2 白兰地酒香味 14.80 12 乙酸己酯 14.325 C8H16O2 清香、水果香 0.12 13 乙酸苯乙酯 15.403 C10H12O2 苹果香、威士忌香 0.88 14 乙酸香茅酯 17.739 C12H22O2柠檬味果香、玫瑰香 0.08 15 癸酸乙酯 18.72 C12H24O2果香、酒香、白兰地香 10.08 16 月桂酸乙酯 22.949 C14H28O2 花果香气 0.87醇类17 异戊醇 2.165 C5H12O 苹果白兰地香气 34.37 18 正戊醇 2.659 C5H12O 特殊气味 0.03 19 正辛醇 10.62 C8H18O 油脂味、柑橘气息 0.14 20 2-甲基丁醇 11.475 C5H12O 特殊气味 0.03 21苯乙基乙醇 11.649 C8H10O 玫瑰香味 4.11 22 正庚醇 13.292C7H16O 芳香气味 0.06酸类23 庚酸 8.237 C7H14O2 脂肪样气味 0.67 24 辛酸 13.496 C8H16O2 水果香气 2.17羰基化合物25 香叶基丙酮 19.973 C13H22O 清香、果香、蜡香、木香 0.42
由表5可知，这些香气成分主要有酯类、醇类、酸类等，其中峰面积占比＞1%的香气物质有异戊醇34.37%（苹果白兰地香气）、硫酸二丁酯16.22%（花香香韵）、辛酸乙酯14.80%（白兰地酒香味）、癸酸乙酯10.08%（果香、酒香、白兰地香味）、苯乙基乙醇4.11%（玫瑰香味）、乙酸异戊酯3.64%（香蕉香气）、甲酸正己酯2.49%（水果香味）、辛酸2.17%（水果香气）、己酸乙酯1.65%（曲香、菠萝香型香气），占峰面积最高的成分为异戊醇34.37%。康明丽等[20]研究柑橘果酒香味物质中，辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯为果酒做出主要贡献，与本试验结果相近。超过800种的香气成分蕴藏在果酒中[21-22]，大多数酯类物质具有花果香味和酒香味，因此赋予了混合果酒的香气。
2.3.4 特征官能团的测定结果
果酒的红外特征光谱图见图9。
图9 果酒的红外光谱图
Fig.9 Infrared spectrum of fruit wine
由图9可知，3 297 cm-1处的强宽吸收带为O-H伸缩振动，对应酒中的羧基中的OH；2 917 cm-1为C-H 伸缩振动区（3 000 cm-1～2 700 cm-1）；1 714 cm-1的吸收峰处于羰基C=O的伸缩振动区（1 900 cm-1～1 650 cm-1），可能对应的是混合果酒中的酯类物质；1 605 cm-1的吸收峰位于双键伸缩振动区（1 690 cm-1～1 500 cm-1），可能对应的是混合果酒中含有苯环骨架的物质；1 222 cm-1和1 402 cm-1的吸收峰位于X-H面内弯曲振动及X-Y伸缩振动区（1475cm-1～1000cm-1），1 402 cm-1附近的吸收峰说明混合果酒中含脂肪族-α-氨基酸[23]，1 222 cm-1的吸收峰对应的是酯类的=CO-C基团，对应混合果酒中的酯类物质；1 035 cm-1的强尖峰说明混合果酒中含有伯醇类物质；921 cm-1位于烯烃、芳烃的C-H面外振动区。
3 结论
本文采用单因素、响应面试验，拟定橙子番茄混合果酒发酵工艺，优化后工艺条件为橙子果浆（橙子∶水=1∶2）与番茄果浆（番茄∶水=1∶1）的体积比为 1∶2，初始糖度24.2°Brix，酵母接种量0.41 g/L，焦亚硫酸钠添加量65 mg/L，感官评分为83分。在最优条件下得到的混合果酒色泽呈淡红色，果香与酒香味协调，酸甜适中，回味香甜。混合果酒的·OH清除率可达到98%，Fe3+还原力随着样品的添加量增大而增大。采用气相色谱-质谱联用技术分析混合果酒的挥发性香气物质，主要成分为异戊醇、硫酸二丁酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等。混合果酒在红外光谱图中存在较明显的特征峰，这些特征峰与混合果酒所含物质组分相符。
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