大果木姜子是樟科樟属米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果实，主要分布在我国西南地区，如贵州、云南和广西等地[1-2]，具有温中散寒、理气止痛的治疗作用。可用于治疗胃痛、腹痛、胸痛等疾病[3]。大果木姜子在贵州是一种药食两用的植物，大果木姜子油常用于调味、去腥。而近年来研究表明大果木姜子具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化的作用，以大果木姜子作为原料制成的中成药在临床中有很好的治疗作用[3-4]。此外，大果木姜子常用于治疗胃溃疡，已经有数百年历史，且效果显著。
近年来研究主要集中在大果木姜子的药理作用上，而对大果木姜子成分及提取工艺的研究未见报道[5-8]。传统的提取方法存在耗时长、溶剂使用量大、工艺复杂等弊端，不利于产业化生产；而超声辅助提取法具有操作简单、超声时间短、节省溶剂、提取效率高等优点，有利于大果木姜子的提取规模化和产业化生产。多糖被认为是生命科学中生物基材料（例如食品、化妆品、医疗设备和药物）生产的关键成分[9]。在过去的几十年中，多糖的生物活性已在生物化学和医学中引起越来越多的关注。在各种天然抗氧化剂中，多糖通常具有强抗氧化活性。抗氧化作用是多糖的主要的生物活性之一，多糖可以作为新型潜在的抗氧化剂而被探索[10-11]。大果木姜子抗氧化活性的研究目前尚未报道[12]，因此本文采用响应面分析法优化大果木姜子多糖的提取工艺，并对多糖的抗氧化活性进行了研究，为大果木姜子深度开发提供了基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
DR3900台式可见分光光度计：美国哈希公司；ES-A分析天平：天津市德安特传感技术有限公司；BKE-1006HT小型超声波清洗仪：山东博可超声设备有限公司。
葡萄糖标准品、DPPH：美国默克公司。其它化学试剂均为分析纯试剂。
1.2 材料
大果木姜子：采摘自贵州省黔南州罗甸县坝碰村，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为樟科樟属植物米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）的干燥成熟果实。
1.3 方法
1.3.1 样品的前处理
将新鲜的大果木姜子置于阴凉处快速晾干，防止发霉，除去杂质，粉碎，过筛，即得大果木姜子粉末。
1.3.2 超声辅助提取的单因素试验
分别称取大果木姜子粉末5 g，以液料比、提取功率和超声时间为考察因素，考察不同单因素对多糖得率的影响。按照固定2个条件，考察另一个因素对多糖得率的影响程度，进行单因素试验，测定多糖得率。固定液料比20∶1（mL/g），提取功率80 W，考察超声时间在 25、30、35、40、45、50 min 时对多糖得率的影响；固定液料比 20∶1（mL/g），超声时间 30 min，考察提取功率在 20、40、60、80、100、120 W 时对多糖得率的影响；固定提取功率80 W，超声时间30 min，考察液料比在 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）时对多糖得率的影响。
1.3.3 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，对3个影响因素进行三因素三水平试验，试验方法参照文献中方法进行设计[13]，表1为响应面因子水平及编码。
表1 响应面设计试验因素水平及编码
Table 1 Response surface design test factor level and coding
水平A超声时间/minB提取功率/WC液料比/（mL/g）因素-1 30 60 30∶1 0 35 80 40∶1 1 40 100 50∶1
1.3.4 多糖得率的测定
通过参考文献中的方法得到葡萄糖标准曲线为Y=7.999 8x+0.069 9，R2=0.999 6，样品多糖得率的测定参考文献[14]的方法。
1.3.5 大果木姜子多糖抗氧化活性研究
样品前处理参考文献[15]的方法，将溶液稀释分别得到 40、80、160、320、640、1 280 μg/mL 的待测样品溶液。大果木姜子对DPPH自由基清除能力[15-16]、对超氧阴离子自由基的清除作用[17-18]和对羟基自由基的清除作用[19]分别参考文献中的方法进行测定。
1.4 数据处理
将测得的数据用SPSS 22.0软件进行统计计算，运用Design-Expert 8.0.7软件进行响应面优化分析处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
超声时间对大果木姜子多糖得率的影响见图1。
图1 超声时间对大果木姜子多糖得率的影响
Fig.1 The effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides
由图1可知，固定液料比和提取功率，改变超声时间，大果木姜子多糖得率在35 min达到最高值，多糖得率为5.54%，35 min后多糖得率显著下降，可能是随着超声时间增加，大果木姜子中其他易溶于水的成分也被提取出来，使多糖在溶液中的占比下降，在45 min后水提液达到饱和，无更多成分被提取出来。
提取功率对大果木姜子多糖得率的影响见图2。
图2 提取功率对大果木姜子多糖得率的影响
Fig.2 The effect of extraction power on the yield of polysaccharides
由图2可知，固定液料比和超声时间，改变提取功率，大果木姜子多糖得率在80 W达到峰值，多糖得率为5.13%，当提取功率超过80 W后，多糖得率显著下降，可能是随着提取功率增大，超声波对多糖连接的键起到破坏作用，使得多糖结构破碎，得率下降。
液料比对大果木姜子多糖得率的影响见图3。
图3 液料比对大果木姜子多糖得率的影响
Fig.3 The effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides
由图3可知，固定超声时间和提取功率，改变液料比，大果木姜子多糖得率在40∶1（mL/g）时达到最高值5.79%，当液料比超过40∶1（mL/g）后多糖得率显著下降，可能原因是溶剂量过大，杂质分子被溶出，与多糖分子竞争溶出空间导致得率下降。
2.2 响应面方案与试验结果
利用响应面软件Design Expert 8.0.7设计三因素三水平的试验，设计方案及结果见表2，测定多糖得率，得到回归模型方差分析见表3。
表2 响应面设计及结果
Table 2 Response surface design and results
试验号 多糖得率/%1 0-1 1 2.940 2-1 -1 0 2.971 3 1 1 0 5.050 A B C 4-1 5.302 5 0 0 0 5.918 0 1 6 1 3.696 7 1-1 0 4.446 0 1-1 1 0 5.187 9-1 0 -1 3.359 10 0 0 0 5.722 11 1 0 -1 3.911 12 0 0 0 5.769 13 -1 0 1 4.034 14 0 -1 -1 3.156 15 1 0 1 5.464 16 0 0 0 5.930 17 0 0 0 5.809 8
表3 响应面二次模型多糖得率的方差和回归系数分析
Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model
注：*P<0.05表示差异显著，**P<0.01表示差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 17.90 9 1.99 6.52 0.001 9极显著A超声时间 1.38 1 1.38 4.51 0.041 2 显著B提取功率 4.09 1 4.09 13.14 0.008 1极显著C液料比 0.021 1 0.021 0.068 0.802 5 AB 0.65 1 0.65 2.13 0.018 0 显著AC 0.19 1 0.19 0.63 0.452 9 BC 0.48 1 0.48 1.58 0.248 7 A2 1.05 1 1.05 3.43 0.006 4极显著B2 3.54 1 3.54 11.61 0.011 3 显著C2 5.46 1 5.46 17.89 0.003 9极显著残差 2.14 7 0.31失拟项 2.10 3 0.70 83.53 0.512 5纯误差 0.034 4 0.008 392总和 20.04 16
将自变量超声时间（A）、提取功率（B）、液料比（C）与大果木姜子多糖得率（Y）的数据进行回归拟合，得到二次多元回归方程如下。
由表3可知，矫正系数R2Adj=0.956 3，预测复相关系数R2=0.963 7，预测相关系数R2（Pred）=0.956 3与预测复相关系数接近，说明拟合度比较好。失拟项P=0.5125>0.05，表明差异不显著，变异系数C.V.%为3.94%，说明选择的模型对该试验的拟合度较好。由表3可知，3个因素对大果木姜子多糖得率的影响程度的大小顺序为提取功率>超声时间＞液料比。
2.3 响应面分析
当液料比固定时，提取功率与超声时间相互作用见图4。
图4 超声时间和提取功率对多糖得率响应面图
Fig.4 Response surface graph of ultrasonic time and extraction power versus polysaccharide yield
由图4可知，在提取功率一定时，随着超声时间的变化，多糖得率先增大后趋于平缓，但响应面坡度不明显；在超声时间一定时，随着提取功率的变化，多糖得率先增加再降低，响应面坡度较大。
当提取功率固定时，超声时间和液料比相互作用见图5。
图5 超声时间和液料比对多糖得率响应面图
Fig.5 Response surface graph of ultrasonic time and materialliquid ratio versus polysaccharide yield
由图5可知，在液料比一定时，随着超声时间的变化，多糖得率变化不大，响应面坡度较平缓，先增加后趋于平缓；在超声时间一定时，随着液料比的变化，多糖得率先显著增加后显著降低，响应面坡度较陡峭。
当超声时间固定时，提取功率和液料比相互作用见图6。
图6 液料比和提取功率对多糖得率的响应面图
Fig.6 Response surface diagram of the ratio of material to liquid and extraction power to the yield of polysaccharide
由图6可知，在提取功率一定时，随着液料比的变化，多糖得率先增大后显著降低，响应面坡度较大；在液料比一定时，随着提取功率的改变，多糖得率先显著增加后降低，但降低的不明显，响应面坡度较大，液料比和提取功率的交互作用显著。
2.4 优化与验证试验
经响应面优化后最优条件为超声时间35.12min、提取功率 80.64 W、液料比 40.16∶1（mL/g），多糖得率为5.99%。依据实际操作条件，将工艺修正为超声时间35 min、提取功率80 W、液料比 40∶1（mL/g），得到实测多糖得率为5.92%。实际值与预测值之间相差较小，验证了该响应面模型的有效性。因此，响应面法对大果木姜子多糖最佳优化工艺为超声时间35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g）。
2.5 大果木姜子多糖抗氧化活性结果
大果木姜子多糖抗氧化作用结果见表4。
表4 大果木姜子多糖抗氧化作用
Table 4 Antioxidant effect of Cinnamomum migao H.W.Li polysaccharide
浓度/（μg/mL）DPPH自由基清除率/%羟基自由基清除率/%40 9.26 8.87 8.59 80 17.98 15.56 15.12 160 35.21 30.09 29.56 320 70.25 63.01 60.79 640 88.17 84.64 82.11 1 280 92.88 91.89 90.23超氧阴离子自由基清除率/%
由表4可知，大果木姜子多糖对DPPH自由基的最大清除率为92.88%，经计算IC50为219.60 μg/mL。对超氧阴离子自由基最大清除率为91.89%，IC50为244.37 μg/mL。对羟基自由基的最大清除率为90.23%，IC50为258.26 μg/mL。因此，大果木姜子多糖有一定的抗氧化活性。研究表明，抗氧化疗法可以在治疗疾病中发挥关键作用。在潜在的药物资源中，植物多糖是天然抗氧化成分，其应用历史悠久，广泛的可获得性以及食用的副作用小，被认为对人体健康至关重要[20]。在实验室研究和临床研究中，多种疾病模型均显示出植物多糖具有抗氧化性、抗炎症、促进细胞活力、免疫调节和抗肿瘤的功能[21-22]。
多糖发挥抗氧化作用机制之一是由于多糖中含有大量的氢离子，氢可以与自由基结合形成稳定的自由基以终止自由基链反应。多糖还可以通过降低脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平发挥抗氧化作用[23]。此外，多糖还可以在体外与自由基发生反应，从而终止自由基链反应。通过增强过氧化氢酶（catalase，CAT）活性来增强抗氧化活性，催化H2O2的分解[24]。多糖可以防止谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）消耗，并增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。最后，多糖还可以刺激产生自由基酶的合成，建立氧化还原循环来保护细胞免受氧化应激的影响[25]。
3 结论
本试验利用超声辅助提取法获得大果木姜子多糖，通过响应面法优化了多糖的提取工艺。研究表明最佳超声辅助提取工艺条件为超声时间35 min、提取功率 80 W、液料比 40∶1（mL/g），多糖得率为5.92%。此外，大果木姜子多糖还具有较强的抗氧化能力。
综上所述，大果木姜子多糖可通过超声方法优化提取，大果木姜子多糖还表现出较强的体外抗氧化能力，本研究为大果木姜子新产品的开发提供了理论依据。
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