致病菌往往会导致食源性疾病的发生，给公共健康、社会稳定、食品行业的发展带来巨大危害。为降低食品中微生物风险，食品加工过程中通常添加抗菌剂来保证食品安全[1]。清洁标签是指在产品标签中尽可能少地出现食品添加剂，保持食品配料栏中的食品天然的属性。因此从天然产物中获取有效抗菌成分意义重大。目前常见的清洁标签天然抗菌剂可从自然来源中获得，主要包括植物源（植物精油及成分、茶多酚）、动物源（壳聚糖、蜂胶）和微生物源（细菌素，特别是乳酸链球菌素）。天然抗菌剂在食品领域也得到了一定的应用，例如植物精油，常从植物的叶、芽、草本、果实、根和花中提取，不仅具有抑菌或杀菌功效，还有抗氧化和抗癌作用[2]，符合美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）公认安全类产品（generally regarded as safe，GRAS）认证要求。精油成分复杂多样，也有多个抗菌功能位点，现研究认为可能是通过破坏细菌细胞膜、损伤核酸和控制代谢活动等发挥抗菌活性，其确切作用机制有待进一步阐明。
随着消费者食品安全意识的提升，抗菌剂和热处理组成的栅栏技术在推动绿色产业发展方面有了更广阔的市场前景。热处理作为一种常见的商业化杀菌技术，通常指将产品加热至一定温度以抑制有害微生物的生长，其杀菌效果较好。研究表明，加热能破坏细菌细胞膜，增加细菌细胞膜和磷脂双分子层的流动性，这种增加的流动性有助于促进抗菌物质的渗透，并在细胞内具有杀菌作用[3]。将抗菌剂与热处理结合能避免较高的杀菌温度，防止对产品造成热损伤，改善食品的感官品质，抑制食源性致病菌的生成。
近年来，国内外研究者对抗菌剂与热处理结合的灭菌效果进行了大量研究，发现协同效应可以增强灭菌效果，从而降低抗菌剂的浓度、加热温度及时间，在0.01%或更低浓度下就能起作用[4]。不仅解决加工成本问题，而且减少了高浓度抗菌剂对产品感官和风味的影响。本文以检测微生物的培养基（缓冲溶液、胰蛋白胨大豆肉汤和脑心浸液肉汤）和食品基质（果蔬汁、新鲜及鲜切果蔬、萨尔萨辣酱和蛋液）为线索，结合国内外最新研究成果对天然抗菌剂与温和热处理结合对食源性致病菌灭活的协同影响及机理进行综述，为天然抗菌剂开发利用提供理论参考。
1 抗菌剂和热处理的联合应用
1.1 抗菌剂和热处理结合在缓冲溶液中的应用
表1介绍了以缓冲溶液为处理介质，多种天然抗菌剂和温和热处理结合在缓冲溶液中的应用。
表1 抗菌剂和热处理结合在缓冲溶液中的应用
Table 1 Application of antimicrobial agents and heat treatment in buffer solution
注：δ值指灭活1 lg（CFU/mL）细菌所需要的杀菌时间；对照组为对培养基不做抗菌剂处理，仅热处理；实验组为对培养基既做抗菌剂处理又加热处理；单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）。
缓冲液（pH3.8） 0.02%柠檬醛 大肠杆菌O157∶H7结果 参考文献柠檬酸磷酸盐基质 抗菌剂 微生物 处理条件54℃，27 min与对照组相比，添加香芹酚δ值从8.9 min缩短到1.7 min [5]柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH4.0）橙子精油、柠檬精油、柑橘精油 大肠杆菌O157∶H7 54℃，10 min添加0.001%的3种精油灭活1 lg（CFU/mL）大肠杆菌O157∶H7；0.002%的 3 种精油灭活约 3 lg（CFU/mL）～4 lg（CFU/mL）大肠杆菌O157∶H7；0.005%或0.01%的3种精油灭活4.5 lg（CFU/mL）～4.8 lg（CFU/mL）大肠杆菌 O157∶H7；0.02% 精油灭活≥5.5 lg（CFU/mL）大肠杆菌 O157∶H7[6]柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH7.0）对-聚伞花素、α-蒎烯、β-蒎烯、百里香酚、香芹酚、冰片、芳樟醇、松油烯-4-醇、1，8-桉叶素、α-乙酸松油酯、樟脑大肠杆菌O157∶H7 54℃，10 min灭活大肠杆菌O157∶H7强弱顺序为百里香酚=香芹酚=芳樟醇=松油烯-4-醇>冰片=对-聚伞花素>樟脑>α-乙酸松油酯=1，8-桉叶素=α-蒎烯=β-蒎烯[7]柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH7.0）对-聚伞花素、α-蒎烯、β-蒎烯、百里香酚、香芹酚、冰片、芳樟醇、松油烯-4-醇、1，8-桉油素、α-乙酸松油酯、樟脑LM 54℃，10 min灭活LM强弱顺序为百里香酚=香芹酚=芳樟醇=松油烯-4-醇=α-乙酸松油酯=对-聚伞花素＞1，8-桉叶油素=樟脑=β-蒎烯>α-蒎烯>冰片[7]
为更深入地研究抗菌剂和热处理灭活食源性致病菌的机理和动力学，在对真实食品进行进一步研究之前，会优先在实验室模型培养基中进行测试，以便获得可行性的结果。目前柠檬酸磷酸盐缓冲液介质的大肠杆菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特氏菌不同菌株的灭活效果已被鉴定和报道（表1）。可以采用各种缓冲溶液模拟食品类型。Luis-Villaroya等[3]用pH4.0的Mcllvaine缓冲液（1 000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625mL0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液pH4.0）模拟果汁，当热处理和天然抗菌剂蜂胶结合时，对大肠杆菌O157:H7 Sakai菌株具有很强的协同杀伤作用，灭活时间从对照组44 min缩短至1 min。据报道，热量可能会促进蜂胶成分扩散到细胞膜的脂质相，使它们能够穿透细胞并在细胞质中发挥作用。Gayán 等[8]用 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液作为椰汁的模型系统，柠檬醛、香芹酚和t-肉桂醛对大肠杆菌 O157∶H7（MG1655）菌株的热失活有明显的促进作用，协同提高了大肠杆菌O157∶H7（MG1655）菌株的热失活率，但只有香芹酚是唯一一种与热处理联合作用对大肠杆菌所有抗性突变体保持协同作用的化合物，因此，热处理和香芹酚似乎能抵消抗性菌株耐热性的发展。此外，乳酸链球菌素作为一种天然抗菌剂，结合热处理可有效控制大量微生物，但是当考虑细菌孢子时，它们似乎对直接添加到加热介质中的抗菌剂不敏感，只有将其添加到复苏培养基中时，才能观察到菌株表面的耐热性有所下降[9-10]。Ros-chumillas等[11]在磷酸盐缓冲溶液中，研究乳酸链球菌素和热处理对生孢梭菌孢子的耐热性，结果表明乳酸链球菌素与热处理的结合加速了生孢梭菌的失活，乳酸链球菌素和热处理有协同作用[10]，这与先前的结果一致。研究显示，乳酸链球菌素可通过孔的形成促进在细菌孢子本身含有的二吡啶甲酸的释放，破坏其结构完整性并加速其失活过程。
1.2 抗菌剂和热处理结合在脑心浸液肉汤和胰蛋白胨大豆肉汤中的应用
利用脑心浸液肉汤和胰蛋白胨大豆肉汤为培养介质，研究抗菌剂和热处理在食品模拟液的热失活行为。表2列举了部分抗菌剂与热处理结合对致病菌的灭活效果。
表2 抗菌剂和热处理结合在脑心浸液肉汤和胰蛋白胨大豆肉汤的应用
Table 2 Application of antimicrobial agents and heat treatment in brain and heart infusion broth and tryptone soy broth
注：D值指在一定的条件和热力致死温度下，杀死原有细菌数的90%所需要的杀菌时间；δ值指灭活1 lg（CFU/mL）细菌所需要的杀菌时间；对照组为对培养基不做抗菌剂处理，仅热处理；实验组为对培养基既做抗菌剂处理又加热处理；肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，SE）；李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）。
结果 参考文献脑心浸液肉汤 柠檬醛、香芹酚、（E）-2-己烯醛基质 抗菌剂 微生物 处理条件LM 60℃ 对照组、50 mg/L柠檬醛、30 mg/L香芹酚、65 mg/L（E）-2-己烯醛D值分别为 10.9、3.31、3.37、2.98 min[12]脑心浸液肉汤 塞内加尔花椒精油、黑胡椒精油、姜黄精油、沙果精油SE 55℃ 对照组减少7 lg（CFU/mL）SE所需时间为129.3 min；50 mg/L的4种精油减少 7 lg（CFU/mL）SE 所需时间分别为 12.49、9.31、10.74、14.06 min；100 mg/L的4种精油减少7 lg（CFU/mL）SE所需时间分别为 6.83、9.42、7.05、8.33 min[13]脑心浸液肉汤 塞内加尔花椒精油、黑胡椒精油、姜黄精油、沙果精油SE 60℃ 对照组减少7 lg（CFU/mL）SE所需时间为1.46 min，100 mg/L的4种精油减少 7 lg（CFU/mL）SE 所需时间分别为 1.06、1.14、1.11、1.16 min[13]脑心浸液肉汤 S-香芹酮、香芹酚、肉桂醛、百里香酚、癸醛LM Scott A 45℃，30 min 5 mmol/L S-香芹酮、2 mmol/L香芹酚、2.5 mmol/L肉桂醛、2 mmol/L百里香酚、2 mmol/L 癸醛分别灭活 LM 1.3、2.1、1.7、3.0、2.3 lg（CFU/mL）[14]含0.6%酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤0.3 mmol/L百里香酚、香芹酚LM 55℃ 对照组、百里香酚组、香芹酚组的δ值分别为0.80、0.25、0.25 min；百里香酚结合香芹酚组δ值为0.18 min[15]
如表2所示，抗菌剂与热处理之间的协同效应虽然具有广谱的抗菌性能，但其抗菌效果受多方面因素的影响。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的结构差异决定了它们对抗菌剂和热处理的敏感性不同。通常情况下，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对抗菌剂更加敏感，例如，Chen等[16]研究0.6%酵母提取物的胰蛋白酶大豆肉汤中乳酸链球菌素、百里酚和乳糖酸联合对单核细胞增生李斯特氏菌的抗菌效果，结果表明乳糖酸增加了乳酸链球菌素、百里酚的抗菌活性，扩大其抗菌谱，完全抑制了单核细胞增生李斯特氏菌的生长，但对大肠杆菌O157:H7没有协同作用，这可能是革兰氏阴性菌大肠杆菌O157:H7外膜中的脂多糖为乳酸链球菌素的作用提供了屏障[17]。然而另一项研究在胰蛋白胨大豆肉汤中，发现月桂酰精氨酸乙酯（15 μg/mL）和温和热处理（55℃）对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌O157:H7）和革兰氏阳性菌（如英诺克李斯特氏菌）均表现出协同作用，机制可归因于月桂酰精氨酸产生的氧化应激，以及温和热处理和月桂酰精氨酸乙酯的双重压力而加重膜损伤。但如单独处理，则需要增加约27倍的热能和2.3倍的月桂酰精氨酸乙酯浓度，才能达到与两者结合处理相同的5 lg（CFU/mL）大肠杆菌数量[18]。因此，研究微生物应激和毒性反应之间的关系对于抗菌剂的发展是至关重要的。Lanciotti等[19]在脑心浸液肉汤中，评估了单核细胞增生李斯特氏菌Scott A如何调节和形成蛋白质组以对抗柠檬醛、香芹酚、（E）-2-己烯醛和百里香精油的抗菌能力。这项研究表明，不同处理条件其蛋白质组图谱不同。与柠檬醛和（E）-2-己烯醛相比，香芹酚和百里香精油在蛋白质合成中起到了更高的诱导作用。适应柠檬醛或（E）-2-己烯醛的细菌，在肉汤中表现出更高的存活率。
1.3 抗菌剂和热处理结合在果蔬汁的应用
为更好地阐明抗菌剂和热处理技术的抗菌效果，选择以常见的果蔬汁作为应用载体，正确地比较微生物的抵抗性能是研究此类技术的必要工作。表3总结了几种常见果蔬汁中抗菌剂和温和热处理灭活食源性致病菌的效果。
表3 抗菌剂和热处理结合在果蔬汁的应用
Table 3 Application of antimicrobial agents and heat treatment in fruit and vegetable juice
注：D值指在一定的条件和热力致死温度下，杀死原有细菌数的90%所需要的杀菌时间；对照组为对食品基质不做抗菌剂处理，仅热处理；实验组为对基质既做抗菌剂处理又加热处理。
结果 参考文献苹果汁、胡萝卜汁基质 抗菌剂 微生物 处理条件0.5 mmol/L D-柠檬烯LM 52.5℃ 苹果汁、胡萝卜汁的D值分别为1.49、22.6 min [20]苹果汁 0.2 μL/mL 阿尔及利亚百里香精油大肠杆菌O157∶H7 54℃ 对照组减少5 lg（CFU/mL）细菌所需时间为27 min；阿尔及利亚百里香精油组减少5 lg（CFU/mL）细菌所需时间为5 min[21]苹果汁、芒果汁、橙汁、番茄汁1.3 mmol/L香芹酚大肠杆菌O157∶H7 54℃ 对照组在4种果汁中减少5 lg（CFU/mL）细菌所需时间分别为41.8、22.1、15.1、24.9 min；香芹酚组在 4 种果汁中减少 5 lg（CFU/mL）细菌所需时间分别为 8.0、7.1、3.9、7.0 min[22]苹果汁、芒果汁、橙汁、番茄汁1.3 mmol/L香芹酚大肠杆菌O157∶H7 60℃ 对照组在4种果汁中减少5 lg（CFU/mL）细菌所需时间分别为7.66、3.50、2.14、5.08 min；香芹酚组在 4 种果汁中减少 5 lg（CFU/mL）细菌所需时间分别为 1.05、0.7、0.48、1.06 min[22]混合果蔬汁（21种蔬菜和3种水果）肉桂精油、丁香精油、八角茴香精油和丁香酚大肠杆菌O157∶H7 55℃ 对照组D值为5.69 min；0.01%的4种抗菌剂D值分别为3.41、4.09、2.95、4.05 min；0.05%的 4种抗菌剂 D 值为 0.79、0.67、0.38、0.60 min[23]
健康营养的果蔬汁产品作为食品产业的一个重要分支，所占的市场份额仍在不断扩大。目前大量文献研究了抗菌剂与热处理协同抑制细菌或降低细菌热稳定性的条件及作用效果（见表3），结果表明，热处理和精油协同作用的程度与温度有关，在细菌细胞中，热量对精油组分在细胞质膜中的分配，是影响精油失活动力学的主要原因[24]。Espina等[6]在苹果汁中处理大肠杆菌O157∶H7时，将柠檬精油与热处理结合，处理时间从28.5 min减少至5 min，这些协同效应已被解释为热损伤细胞的失活。果汁的性质会影响细菌在处理过程中的存活率，尤其是酸性条件下，如自然形成或糖发酵过程中产生的有机酸，能够诱导致病细菌产生交叉保护反应，形成酸适应性细胞。酸适应能够诱导至少60种特异性酸休克蛋白的翻译，以及诱导能提高耐热性的σ因子[25]，从而增加细菌的抵抗力。Tchuenchieu等[26]在菠萝汁、橙汁或西瓜汁中，用香芹酚和热处理对适应酸的非致病大肠杆菌25 922菌株进行检测，发现适应酸性环境的大肠杆菌O157∶H7细胞在耐热处理上比未经酸调节的细胞更强。对于食品基质而言，菠萝汁、橙汁中的一级酸是柠檬酸，西瓜汁中的一级酸是苹果酸，通常情况下，菠萝汁和橙汁中大肠杆菌的失活率可能高于西瓜汁。此外，果蔬的独特组成也是一个非常重要的影响因素，盐、糖、蛋白质和脂肪等成分可能有助于保护细胞免受热损伤。当抗菌剂和热处理结合时，这些基质成分会削弱其抗菌效果，如胡萝卜汁中的脂肪和纤维成分，在澄清的苹果汁中并不存在，从而增加了胡萝卜汁的热致死时间[27]。
1.4 抗菌剂和热处理结合在新鲜及鲜切果蔬的应用
表4列举了新鲜及鲜切果蔬产品中，抗菌剂和热处理结合对致病菌的灭活效果。
表4 抗菌剂和热处理结合在新鲜及鲜切果蔬的应用
Table 4 Application of antimicrobial agents and heat treatment in fresh and fresh cut produce
注：对照组为对食品基质不做抗菌剂处理，仅热处理；实验组为对食品基质既做抗菌剂处理又加热处理；柠檬酸（citric acid，CA），碱性电解水（acidified electrolyzed water，AlEW）。
基质 抗菌剂 微生物 处理条件 结果 参考文献菠菜叶 1%乳酸、CA、苹果酸、酒石酸、乙酸大肠杆菌O157:H7 50℃，2 min对照组灭活细菌1.1 lg（CFU/mL），5种抗菌剂组分别灭活细菌2.3、2.2、2.2、2.0、2.0 lg（CFU/mL）[28]菠菜叶 1%乳酸、CA、苹果酸、酒石酸、乙酸大肠杆菌O157:H7 40℃，5 min对照组灭活细菌1.1 lg（CFU/mL），5种抗菌剂组分别灭活细菌2.7、2.3、2.3、2.2、1.8 lg（CFU/mL）[28]胡萝卜丝 AlEW、1.0%CA 嗜温好氧菌群20、40、50℃，3 min添加 AlEW、CA 及两者结合，20 ℃分别灭活细菌 1.78、2.37、3.17 lg（CFU/g）；40 ℃分别灭活细菌 2.02、2.69、3.47 lg（CFU/g）；50 ℃分别灭活细菌 2.37、2.98、3.72 lg（CFU/g）[29]包菜丝 AlEW、1.0%CA 嗜温好氧菌群20、40、50℃，5 min添加 AlEW、CA 及两者结合，20 ℃分别灭活细菌 2.34、2.30、2.70 lg（CFU/g）；40 ℃分别灭活细菌 2.83、2.80、3.23 lg（CFU/g）；50 ℃分别灭活细菌 3.08、3.01、3.98 lg（CFU/g）[30]
新鲜及鲜切果蔬因具有天然、营养以及方便等特点，深受世界各地消费者的青睐。同时，与之相关的食源性疾病暴发的频率也不断上升。果蔬产品中微生物风险问题愈发突出，而抗菌剂和热处理结合在提高果蔬产品的微生物安全性方面显示出潜在的应用价值。对于鲜切果蔬，切割面的汁液流失是造成微生物感染的主要原因。鲜切西兰花经50℃热水处理1.5 min后，然后浸入壳聚糖膜液中，发现采用壳聚糖结合温和热处理可使嗜常温细菌、肠细菌、酵母和霉菌以及乳酸菌显著降低[31]。用50℃热水处理芒果30 min，然后采用0.25%壳聚糖进行涂膜包裹，发现单独采用热处理和壳聚糖涂膜或者两者组合对芒果的风味和口感均无显著影响，热处理能保持芒果的质地和色泽，壳聚糖可以抑制贮藏期间微生物的生长[32]。新鲜果蔬富含水分和各种营养物质，采后易受微生物污染。例如采后枸杞经42℃热水处理30 min处理后，用1%壳聚糖涂膜包裹，与未处理的枸杞相比，热处理和壳聚糖涂膜后的枸杞具有较高的抗坏血酸、总酚含量和抗氧化能力以及较低的腐烂率。其机制可能是热处理几乎能封闭果实开放的气孔，限制致病菌渗透到果实的内部。壳聚糖能控制生物膜的形成，阻止枸杞的二次感染，减缓了果实呼吸和代谢活性的变化[33]。将热处理与有机酸和H2O2结合对大肠杆菌O157:H7进行商业性试验，以控制菠菜的采后病害。与对照组相比，这种组合清楚地显示了栅栏效应的协同作用，整体的失活量超过部分总和。有机酸和H2O2抗菌活性受pH值的影响，可能是酸在低pH值下有利于分子形成不带电、不离解状态。此外，悬浮在液体基质中的浮游细胞，可能会附着在固体食物基质上，导致无法进行热处理和抗菌处理，因此仍需要进一步测试其灭菌策略[28]。
1.5 抗菌剂和热处理结合在萨尔萨辣酱和蛋液的应用
鸡蛋的营养价值很高，在食品加工生产中极易受到污染。因此使用方便、安全性好的蛋液制品日渐引起消费者的关注。表5列举了抗菌剂和热处理结合在萨尔萨辣酱和蛋液中的应用。
表5 抗菌剂和热处理结合在萨尔萨辣酱和蛋液中的应用
Table 5 Application of antimicrobial agents and heat treatment in salsa and liquid egg
注：D值指在一定的条件和热力致死温度下，杀死原有细菌数的90%所需要的杀菌时间；对照组为对食品基质不做抗菌剂处理，仅热处理；试验组为对食品基质既做抗菌剂处理又加热处理；羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丙酯（propyl p-hydroxybenzoic acid ester or propylparaben，PRPA）；鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，Sty），奥拉宁堡沙门氏菌（Salmonella oranienburg，SO），肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，SE）；李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）。
基质 抗菌剂 微生物 处理条件 结果 参考文献萨尔萨辣酱1 mmol/L柠檬醛、百里香酚大肠杆菌O157∶H7、Sty、LM脉冲欧姆加热，约72℃，38 s对照组灭活3种细菌分别约0.5、1.1、0.5 lg（CFU/mL）；柠檬醛组灭活3 种细菌分别为 1.1、1.7、1.0 lg（CFU/mL）；百里香酚组灭活 3 种细菌分别为 1.7、2.8、1.7 lg（CFU/mL）[34]萨尔萨辣酱1.3 mmol/L香芹酚大肠杆菌O157∶H7、Sty、LM脉冲欧姆加热，约75℃，50 s对照组灭活3种细菌分别约1.2、2.1、1.9 lg（CFU/mL）；香芹酚组灭活3 种细菌分别为 5.7、5.5、5.1 lg（CFU/mL）[35]蛋清液 0、125、250、500、1 000 μg/mL PRPA SE、SO 56.7 ℃ pH 7.8时，各浓度PRPA的D值分别为2.99、1.05、0.68、0.26、≥0.16 min；pH 8.9 时，D 值分别为 0.87、0.99、0.66、0.22、0.09 min[36]
蛋液是由鲜蛋经加工后制得的液蛋制品，在食品工业中多采用热处理的方法进行杀菌。但由于加热会破坏蛋清中热敏性活性物质，往往导致杀菌效果不理想，温和热处理结合抗菌剂对于高价值热敏性的蛋液以及萨尔萨辣酱可能是较好的灭菌策略，表5介绍了蛋液和萨尔萨辣酱中抗菌剂和温和热处理的灭菌效果。溶菌酶可分解细菌细胞壁，具有已知的抗菌特性，尤其是对革兰氏阳性菌具有较强抗菌活性，使其在食品工业中有着广泛的应用。Bi等[37]利用热处理和溶菌酶灭活全蛋液中的鼠伤寒沙门氏菌，两者表现出明显的协同作用。虽然加热易使溶菌酶失活引起酶的空间结构的变化，但是由于溶菌酶的热变性，某些特定组成氨基酸受到影响，其抗菌活性会得到发展，因此热处理和溶菌酶具有协同作用。据推测，溶菌酶是通过降解全蛋液的肽聚糖层，才导致鼠伤寒沙门氏菌细胞裂解[38]。与超声波和溶菌酶处理相比较，当加热条件为64℃/3 min时，其失活效果是相似的。而不同之处是热处理和溶菌酶处理全蛋液的L*和b*值显著低于超声波和溶菌酶处理的全蛋液，对全蛋液质量的影响仍需深入研究。Sung等[39]研究了溶菌酶和热处理灭活蛋清液中的炭疽杆菌，发现添加2 mg/mL溶菌酶在60℃，30 min处理条件下，炭疽杆菌的灭活效率提高5.76倍，两者有效地参与了炭疽杆菌的灭活。此外，溶菌酶灭活炭疽杆菌的能力受蛋清液pH值影响，有数据表明，在45℃和60℃时，接近中性pH值蛋清液能更有效地灭活炭疽杆菌。
2 展望
热处理作为目前使用较多的物理杀菌方法，仍是现代食品工业中的主要杀菌技术手段。随着生物技术和人们生活水平的不断提高，利用健康、安全的抗菌剂来保证食物的天然特性，符合消费者对“清洁标签”的需求，由此，天然抗菌剂与温和热处理联用的应用前景将十分广阔。但由于食品基质复杂多样，该方法在食品安全中的应用仍存在诸多挑战，未来可以从以下几个方面进行相关深入研究。
2.1 研发纳米抗菌剂的抗菌作用
为解决精油疏水性差及感官特性方面的缺陷，近年来一些研究者发现以纳米乳液形式存在的精油及成分结合热处理的方法，能在不同食品基质中快速、均匀地分布，提高其溶解度和抗致病细菌的活性，如D-柠檬烯以纳米乳液的形式处理时，在胰蛋白酶大豆肉汤和苹果汁中可使单核细胞增生李斯特氏菌的D值由784 min降低至8.13 min（几乎是对照组的100倍），而山夫登堡沙门氏菌的δ值由32.13 min减少至0.65 min（约50倍）[40-41]。精油纳米乳液液滴的大小通常在20 nm～200 nm之间，但由于尺寸较小，可能会改变胃肠道的吸收、分布、代谢和排泄等正常功能[42]，因而产生其潜在毒性效应。目前，纳米抗菌剂在食品基质中的毒性、安全性和相互作用方面的研究还很少，液滴大小、聚集状态、电荷正负、物理状态和生物活性化合物浓度是评估纳米抗菌剂安全风险的主要因素[43]。其相关标准化测试方案仍在制定中，未来应加大控制和管理纳米天然抗菌剂相关产品的开发。
2.2 致病菌应激响应分子机制的研究
在对温和热处理与抗菌剂的食品加工技术进行优化或开发新的控制措施时，必须考虑细菌的应激反应和交叉保护。致病细菌长时间地暴露在亚致死浓度或温和热处理下，会诱导产生突变株，对其他化合物和热处理表现出交叉抗性[44-45]，借助基因组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术，从分子水平进一步探究基因型的特征及细菌对精油成分的耐药机制的作用，例如金黄色葡萄球菌USA300对亚抑制剂量的香芹酚或热的抗性，经全基因组测序后，发现耐药性菌株的多个编码基因如DNA结合蛋白、复制蛋白DnaD、外源反应元件家族转录调节因子等的缺失，可能与菌体耐受性的增加有关[46]；用双向凝胶电泳分析温和热处理与香芹酚和百里酚对单核细胞增生李斯特氏菌细胞的蛋白表达，发现在应激条件下诱导的蛋白质与这些细胞的应激反应、新陈代谢及蛋白质合成、蛋白质折叠、蛋白酶活性的变异有关。为了抵抗外界环境压力，参与能量代谢的蛋白质过度表达，能补充因与细菌细胞质膜作用的应激反应而受损的部分能量；涉及热应激反应的蛋白伴侣，能协助折叠、组装热损伤细胞的蛋白质和蛋白酶[12]，为抗菌剂和热处理结合在各种食品安全上的使用奠定基础。同时，还应避免添加亚致死浓度的抗菌剂剂量，在亚致死浓度之前减缓致病菌的生长，则有可能消除这些致病菌的应激反应。
2.3 抗菌剂和热处理结合在鲜切果蔬产业的开发应用
目前，天然抗菌剂在鲜切果蔬产业领域的研究已取得不小的成就，在国内外研究较多的天然有机抗菌剂是壳聚糖和植物精油，可作为化学消毒技术的有效替代品。温和的热处理方法能诱导宿主产生不同的植物防御系统，如细胞壁的强化和气孔的堵塞（裂缝是致病菌的主要入侵点），以及应激蛋白（如热休克蛋白、病原相关蛋白）和抗氧化酶的积累[47]，有效地控制水中致病菌在鲜切过程中的迁移。目前天然抗菌剂在果蔬产业领域中的研究大多数仅限于理论或者实验室阶段，距离产业化应用仍有一段距离。主要存在的问题如下：有关壳聚糖、精油等作用机理的研究尚不透彻，对天然抗菌剂抗菌效果的评价和检测方法不统一，天然抗菌物质的产地、品种、活性成分等对果蔬的抗菌作用有很大差异，其确切作用机制还有待进一步研究。此外，细菌在植物细胞内化的转运机制还尚不清楚。当清洗消毒剂和果蔬产品之间存在温度差时，细菌易通过细胞间组织、角质层的气孔或受损（伤口、切口）部位进入鲜切果蔬组织，引起致病菌内化[48]。有研究称细菌的附着和内化依赖于细菌和植物因素，细菌因素包括细菌浓度、细菌菌株和生物膜的形成；植物因素包括植物品种、浸染部位、生长条件[49]。未来应建立精确评估、预测和控制微生物的数学模型，利用先进的显微成像和分析工具识别影响微生物存活的关键因素，建立和优化工艺条件及处理参数，从而构建目标菌株的预测失活模型[50]，在适当的条件下有效地提高果蔬的安全性。为满足工业应用的要求，需要进一步提高这些技术的抗菌效率，从而降低成本。
3 结语
综上所述，复合型抗菌剂相比于单一抗菌剂在较小用量下具有较优的抑菌效果，真实食品基质观察到的结果可能比使用缓冲溶液或肉汤稀释系列更有用，这将充分体现出抗菌剂和热处理技术的实用性。研究证明，天然生物活性抗菌剂和温和热处理具有协同的抗菌作用，可有效灭活致病性大肠杆菌、沙门氏菌等食源性致病菌，优化栅栏技术在加工食品中的应用。添加低剂量的抗菌剂，能够减少对食品感官特性的影响，增强与热处理协同作用的杀菌效果，使得在温和的条件下实现灭菌作用。因此，抗菌剂与热处理形成的协同效应，可明显缩短致病菌的热致死时间，降低食源性致病菌的污染水平与频率，对于有效预防和控制食源性疾病暴发具有重要意义。
[1]QUINTO E J,CARO I,VILLALOBOS-DELGADO L H,et al.Food safety through natural antimicrobials[J].Antibiotics,2019,8(4):208.
[2]BURT S.Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods—A review[J].International Journal of Food Microbiology,2004,94(3):223-253.
[3]LUIS-VILLAROYA A,ESPINA L,GARCIA-GONZALO D,et al.Bioactive properties of a Propolis-based dietary supplement and its use in combination with mild heat for apple juice preservation[J].International Journal of Food Microbiology,2015,205:90-97.
[4]GURTLER J B,FAN X T,JIN T,et al.Influence of antimicrobial agents on the thermal sensitivity of foodborne pathogens:A review[J].Journal of Food Protection,2019,82(4):628-644.
[5]ESPINA L,SOMOLINOS M,PAGÁN R,et al.Effect of citral on the thermal inactivation of Escherichia coli O157:H7 in citrate phosphate buffer and apple juice[J].Journal of Food Protection,2010,73(12):2189-2196.
[6]ESPINA L,SOMOLINOS M,OUAZZOU A A,et al.Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in fruit juices by combined treatments of Citrus fruit essential oils and heat[J].International Journal of Food Microbiology,2012,159(1):9-16.
[7]AIT-OUAZZOU A,CHERRAT L,ESPINA L,et al.The antimicrobial activity of hydrophobic essential oil constituents acting alone or in combined processes of food preservation[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2011,12(3):320-329.
[8]GAYÁN E,GEENS E,BERDEJO D,et al.Combination of mild heat and plant essential oil constituents to inactivate resistant variants of Escherichia coli in buffer and in coconut water[J].Food Microbiology,2020,87:103388.
[9]ESTEBAN M D,CONESA R,HUERTAS J P,et al.Effect of thymol in heating and recovery media on the isothermal and non-isothermal heat resistance of Bacillus spores[J].Food Microbiology,2015,48:35-40.
[10]HUERTAS J P,ESTEBAN M D,ANTOLINOS V,et al.Combined effect of natural antimicrobials and thermal treatments on Alicyclobacillus acidoterrestris spores[J].Food Control,2014,35(1):73-78.
[11]ROS-CHUMILLAS M,ESTEBAN M D,HUERTAS J P,et al.Effect of nisin and thermal treatments on the heat resistance of Clostridium sporogenes spores[J].Journal of Food Protection,2015,78(11):2019-2023.
[12]SADO KAMDEM S L,BELLETTI N,TCHOUMBOUGNANG F,et al.Effect of mild heat treatments on the antimicrobial activity of essential oils of Curcuma longa,Xylopia aethiopica,Zanthoxylum xanthoxyloides and Zanthoxylum leprieurii against Salmonella enteritidis[J].Journal of Essential Oil Research,2015,27(1):52-60.
[13]FISHER K,PHILLIPS C.The mechanism of action of a Citrus oil blend against Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis[J].Journal of Applied Microbiology,2009,106(4):1343-1349.
[14]NGANG J J,NYEGUE M A,NDOYE F C,et al.Characterization of Mexican coriander(Eryngium foetidum)essential oil and its inactivation of Listeria monocytogenes in vitro and during mild thermal pasteurization of pineapple juice[J].Journal of Food Protection,2014,77(3):435-443.
[15]贾振宇,孙慧慧,郝旭昇,等.百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用[J].食品工业科技,2018,39(20):79-86.JIA Zhenyu,SUN Huihui,HAO Xusheng,et al.Inhibitory activity of thymol and carvacrol against Cronobacter sakazakii[J].Science and Technology of Food Industry,2018,39(20):79-86.
[16]CHEN H Q,ZHONG Q X.Lactobionic acid enhances the synergistic effect of nisin and thymol against Listeria monocytogenes Scott A in tryptic soy broth and milk[J].International Journal of Food Microbiology,2017,260:36-41.
[17]ZHOU L,VAN HEEL A J,MONTALBAN-LOPEZ M,et al.Potentiating the activity of nisin against Escherichia coli[J].Frontiers in Cell and Developmental Biology,2016,4:7.
[18]YANG X,RAI R,HUU C N,et al.Synergistic antimicrobial activity by light or thermal treatment and lauric arginate:Membrane damage and oxidative stress[J].Applied and Environmental Microbiology,2019,85(17):e01033-19.
[19]LANCIOTTI R,BRASCHI G,PATRIGNANI F,et al.How Listeria monocytogenes shapes its proteome in response to natural antimicrobial compounds[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:437.
[20]ESPINA L,SOMOLINOS M,LORÁN S,et al.Chemical composition of commercial Citrus fruit essential oils and evaluation of their antimicrobial activity acting alone or in combined processes[J].Food Control,2011,22(6):896-902.
[21]AIT-OUAZZOU A,ESPINA L,CHERRAT L,et al.Synergistic combination of essential oils from Morocco and physical treatments for microbial inactivation[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2012,16:283-290.
[22]AIT-OUAZZOU A,ESPINA L,GARCÍA-GONZALO D,et al.Synergistic combination of physical treatments and carvacrol for Escherichia coli O157∶H7 inactivation in apple,mango,orange,and tomato juices[J].Food Control,2013,32(1):159-167.
[23]PAN X,MAK L,NAKANO H.Efficacy of essential oils on inactivation of Escherichia coli O157:H7 in vegetable juice[J].Food Science and Technology Research,2014,20(5):1043-1049.
[24]ARIOLI S,MONTANARI C,MAGNANI M,et al.Modelling of Lis－teria monocytogenes Scott A after a mild heat treatment in the presence of thymol and carvacrol:Effects on culturability and viability[J].Journal of Food Engineering,2019,240:73-82.
[25]WESCHE A M,GURTLER J B,MARKS B P,et al.Stress,sublethal injury,resuscitation,and virulence of bacterial foodborne pathogens[J].Journal of Food Protection,2009,72(5):1121-1138.
[26]TCHUENCHIEU A,SYLVAIN S K,POP C,et al.Low thermal inactivation of Escherichia coli ATCC 25922 in pineapple,orange and watermelon juices:Effect of a prior acid-adaptation and of carvacrol supplementation[J].Journal of Food Safety,2018,38(1):e12415.
[27]MATÉ J,PERIAGO P M,ROS-CHUMILLAS M,et al.Fat and fibre interfere with the dramatic effect that nanoemulsified D-limonene has on the heat resistance of Listeria monocytogenes[J].Food Microbiology,2017,62:270-274.
[28]HUANG Y X,CHEN H Q.Effect of organic acids,hydrogen peroxide and mild heat on inactivation of Escherichia coli O157∶H7 on baby spinach[J].Food Control,2011,22(8):1178-1183.
[29]RAHMAN S M E,JIN Y G,OH D H.Combination treatment of alkaline electrolyzed water and citric acid with mild heat to ensure microbial safety,shelf-life and sensory quality of shredded carrots[J].Food Microbiology,2011,28(3):484-491.
[30]RAHMAN S M E,JIN Y G,OH D H.Combined effects of alkaline electrolyzed water and citric acid with mild heat to control microorganisms on cabbage[J].Journal of Food Science,2010,75(2):M111-M115.
[31]MOREIRA MDEL R,PONCE A,ANSORENA R,et al.Effectiveness of edible coatings combined with mild heat shocks on microbial spoilage and sensory quality of fresh cut broccoli(Brassica oleracea L.)[J].Journal of Food Science,2011,76(6):M367-M374.
[32]DJIOUA T,CHARLES F,FREIRE M Jr,et al.Combined effects of postharvest heat treatment and chitosan coating on quality of freshcut mangoes(Mangifera indica L.)[J].International Journal of Food Science&Technology,2010,45(4):849-855.
[33]BAN Z J,WEI W W,YANG X Z,et al.Combination of heat treatment and chitosan coating to improve postharvest quality of wolfberry(Lycium barbarum)[J].International Journal of Food Science&Technology,2015,50(4):1019-1025.
[34]KIM S S,KANG D H.Combination treatment of ohmic heating with various essential oil components for inactivation of food-borne pathogens in buffered peptone water and salsa[J].Food Control,2017,80:29-36.
[35]KIM S S,KANG D H.Synergistic effect of carvacrol and ohmic heating for inactivation of E.coli O157∶H7,S.Typhimurium,L.monocytogenes,and MS-2 bacteriophage in salsa[J].Food Control,2017,73:300-305.
[36]GURTLER JB,JIN TZ.Propylparaben sensitizes heat-resistant Salmonella Enteritidis and Salmonella Oranienburg to thermal inactivation in liquid egg albumen[J].Journal of food protection,2012,75(3):443-448.
[37]BI X F,WANG X Q,CHEN Y,et al.Effects of combination treatments of lysozyme and high power ultrasound on the Salmonella typhimurium inactivation and quality of liquid whole egg[J].Ultrasonics Sonochemistry,2020,60:104763.
[38]JANA M,GHOSH A,SANTRA A,et al.Synthesis of novel muramic acid derivatives and their interaction with lysozyme:Action of lysozyme revisited[J].Journal of Colloid and Interface Science,2017,498:395-404.
[39]SUNG K,KHAN S A,NAWAZ M S,et al.Lysozyme as a barrier to growth of Bacillus anthracis strain Sterne in liquid egg white,milk and beef[J].Food Microbiology,2011,28(6):1231-1234.
[40]MATÉ J,PERIAGO P M,PALOP A.When nanoemulsified,dlimonene reduces Listeria monocytogenes heat resistance about one hundred times[J].Food Control,2016,59:824-828.
[41]ROS-CHUMILLAS M,GARRE A,MATÉ J,et al.Nanoemulsified D-limonene reduces the heat resistance of Salmonella senftenberg over 50 times[J].Nanomaterials,2017,7(3):65.
[42]BOUWMEESTER H,DEKKERS S,NOORDAM M Y,et al.Review of health safety aspects of nanotechnologies in food production[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2009,53(1):52-62.
[43]LOHITH KUMAR D H,SARKAR P.Encapsulation of bioactive compounds using nanoemulsions[J].Environmental Chemistry Letters,2018,16(1):59-70.
[44]GARRE A,ESPÍN J F,HUERTAS J P,et al.Limonene nanoemulsified with soya lecithin reduces the intensity of non-isothermal treatments for inactivation of Listeria monocytogenes[J].Scientific Reports,2020,10:3656.
[45]CHUECA B,BERDEJO D,GOMES-NETO N J,et al.Emergence of hyper-resistant Escherichia coli MG1655 derivative strains after applying sub-inhibitory doses of individual constituents of essential oils[J].Frontiers in Microbiology,2016,7:273.
[46]BERDEJO D,CHUECA B,PAGÁN E,et al.Sub-inhibitory doses of individual constituents of essential oils can select for Staphylococcus aureus resistant mutants[J].Molecules,2019,24(1):170.
[47]KROUPITSKI Y,GOLLOP R,BELAUSOV E,et al.Salmonella enterica growth conditions influence lettuce leaf internalization[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:639.
[48]GADELHA J R,ALLENDE A,LÓPEZ-GÁLVEZ F,et al.Chemical risks associated with ready-to-eat vegetables:Quantitative analysis to estimate formation and/or accumulation of disinfection byproducts during washing[J].European Food Safety Authority Journal,2019,17(S2):e170913.
[49]LENEVEU-JENVRIN C,CHARLES F,BARBA F J,et al.Role of biological control agents and physical treatments in maintaining the quality of fresh and minimally-processed fruit and vegetables[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2020,60(17):2837-2855.
[50]MUNEKATA P E S,PATEIRO M,RODRÍGUEZ-LÁZARO D,et al.The role of essential oils against pathogenic Escherichia coli in food products[J].Microorganisms,2020,8(6):924.