南酸枣为漆树科南酸枣属植物果实，学名五眼果（Choerospondias axillaris）[1]，其干燥成熟果实为蒙医用药材[2]，药食同源，具有较高的营养及药用价值[3]。目前对南酸枣的研究主要集中在其果实部分，研究表明南酸枣果肉含有多酚、有机酸、多糖[4]、维生素及矿物质[5]等，且有安神、提高记忆力、镇静等作用[6]。Wang等[7]对南酸枣水提物的体外及体内抗氧化活性进行测试，发现抗氧化活性效果显著。南酸枣树皮外用，是烫伤的特效药[8]。Li等[9]研究发现南酸枣果皮中的原花青素对4种糖酵解酶有抑制活性。文献调研发现，对南酸枣的研究主要集中在其果实、果皮，对南酸枣叶多糖的研究未见报道。
近年来，植物多糖的研究备受关注。多糖类化合物是一种可再生、储存丰富的绿色资源，广泛存在于植物的皮、果、叶中。大量研究结果表明植物多糖有抗氧化[10]、抗衰老[11]、抗癌活性[12]、降血糖[13-14]、免疫调节作用[15-16]等多种生物活性，是保健类食品开发的重要原料之一。目前多糖的提取方法主要有热水浸提法、微波辅助法、酶解提取法和超声辅助法等。这些方法各有优点，微波辅助法和超声波辅助法提取率较高，但微波和超声波较高的能量虽然可以破碎细胞壁，达到提高多糖得率的目的，但也会使多糖的微观结构发生改变，影响其活性[17]。另外超声也会导致多糖降解[18]。酶解法提取成本较高，对pH值、温度等条件较为敏感。热水浸提法以操作简单、设备需求低而备受青睐[19]。李景恩等[20]采用热水浸提法对南酸枣果的多糖进行提取，发现提取率可达21.79%，但南酸枣叶多糖的研究未见报道。
为补充南酸枣林业资源化学成分库，充分利用废弃资源，本试验以南酸枣叶为原料，采用热水浸提法提取多糖，通过响应面法设计并优化最佳工艺条件。考察了南酸枣叶多糖的还原能力、对DPPH·和·OH的清除作用，以期为丰富南酸枣林业资源化学成分库及天然抗氧剂的开发提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
南酸枣叶（采于6月）：广西南宁植物园；葡萄糖（AR）、抗坏血酸（AR）、DPPH（AR）、铁氰化钾（AR）、三氯乙酸（AR）、氯化铁（AR）、石油醚（AR）：上海阿拉丁生物技术有限公司；水杨酸（AR）、丙酮（AR）、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（AR）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（AR）、FeSO4（AR）、硫酸（AR）、H2O2（30%）：广东省精细化学品工程技术研发中心。
1.2 仪器设备
旋转蒸发仪（RE-2000A）：上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵SHZ-D（III）：上海予华仪器有限公司;集热式恒温磁力搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司；离心机（LDZ4-2）：江苏省金坛市金南仪器制造有限公司；分光光度计（UV-1780）：岛津仪器（苏州）有限公司；万能粉粹机（FW-400AD）：天津鑫博得仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 南酸枣叶干粉的制备
将南酸枣叶置于60℃的烘箱中烘干12 h，用打粉机粉碎后过60目筛，用石油醚以液料比5∶1（mL/g）于60℃回流4 h脱脂，将脱脂后的粉末晾干，密封保存，备用。
1.3.2 标准曲线的绘制
用葡萄糖作为标准品，配制浓度为1.0 mg/mL标准溶液。用移液枪分别量取标准液0.20、0.30、0.40、0.60、0.70、0.80 mL置于20 mL棕色容量瓶中，补加蒸馏水至总体积为2.00 mL。向每个容量瓶中加入6%苯酚溶液1.00 mL，充分振摇后快速加入浓硫酸5.00 mL，振荡后置于沸水浴中反应20 min，取出后冷却，在490 nm测定吸光度，绘制工作曲线。
1.3.3 南酸枣叶多糖的提取
1.3.3.1 温度对多糖得率的影响
准确称取处理好的南酸枣叶粉末2.00 g，置于圆底烧瓶中，在转速100 r/min条件下，固定液料比为100∶1（mL/g），提取时间为 4 h，分别在温度为 75、80、85、90、95℃时试验，提取两次，合并提取液，对提取液减压抽滤，收集滤液。在温度60℃下，用旋转蒸发仪将滤液加热浓缩，收集浓缩液。向浓缩液缓慢加入4倍体积的无水乙醇，充分搅拌，将析出的沉淀液置于10 mL的带塞试管中，放入冰箱中静置24 h后，于4 000 r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀，沉淀物依次使用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤2次，将沉淀干燥，得南酸枣叶粗多糖。计算南酸枣叶多糖得率。
1.3.3.2 液料比对多糖得率的影响
准确称取处理好的南酸枣叶粉末2.00 g，置于圆底烧瓶中，在转速100 r/min条件下，固定温度85℃，提取时间为 4 h，分别在液料比为 60∶1、80∶1、100∶1、120∶1、140∶1（mL/g）时提取多糖，提取 2 次，合并提取根据1.3.2的标准曲线计算南酸枣叶多糖得率。
1.3.3.3 时间对多糖得率的影响
准确称取处理好的南酸枣叶粉末2.0 g，置于圆底烧瓶中，在转速100 r/min条件下，固定温度85℃，液料比为 100∶1（mL/g），分别在提取时间为 2、2.5、3、4、5、6 h下试验，提取两次，合并提取液，根据1.3.2的标准曲线计算南酸枣叶多糖得率。
1.3.4 多糖得率测定
用苯酚硫酸法[21]测定南酸枣叶多糖得率。将提取得到的南酸枣叶多糖配制成1 mg/mL的溶液，用移液枪量取2.0 mL溶液，按照1.3.2步骤的操作方法测定其吸光度值，平行测定3次，取平均值，南酸枣叶多糖的得率按照回归方程计算其多糖的得率，计算公式如下。
式中：x为标曲上对应浓度，mg/mL；V1为比色测定时吸取样液体积，mL；V2为提取液总体积，mL；N为稀释倍数，40；m为南酸枣叶质量，g。
1.3.5 南酸枣多糖的抗氧化活性
参考王洪政等[22]的方法测定南酸枣叶多糖抗氧化能力。采用李婉婷等[23]的方法测定南酸枣叶多糖对DPPH·和·OH的清除作用。
2 结果与讨论
2.1 标准曲线
选取葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制的标准曲线见图1。标准曲线拟合方程为y=1.108 7x+0.000 8，R2=0.999 3。式中：y 为吸光值；x 为葡萄糖浓度，mg/mL。
图1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 The standard curve of glucose
2.2 单因素试验结果
2.2.1 温度的影响
提取温度与南酸枣叶多糖得率的关系见图2。
图2 温度对多糖得率的影响
Fig.2 Effect of temperature on yield of polysaccharides
从图2可见，随着温度升高，南酸枣叶多糖得率先升高后趋于稳定，升高温度有助于破碎植物细胞壁，加快多糖的溶出效率。当温度为85℃时，南酸枣叶多糖得率达到最大，之后有所降低，可能是由于温度较高，部分多糖发生降解，导致多糖含量下降，故提取温度不宜过高。选择温度85℃为响应面试验优化中心值进行试验。
2.2.2 液料比的影响
为考察液料比对南酸枣叶多糖得率的影响，以液料比为变量，固定其他因素进行试验，结果见图3。
图3 液料比对多糖得率的影响
Fig.3 Effect of liquid-material ratio on yield of polysaccharides
如图3所示，当液料比从60∶1增加到100∶1（mL/g），南酸枣叶多糖的得率增加显著，是由于大量溶剂有助于提高细胞内外多糖浓度差，进而让多糖快速溶出。当液料比超过100∶1（mL/g）时，不再增加，且会浪费溶剂及增加功耗。选择液料比100∶1（mL/g）作为响应面优化试验的中心点。
2.2.3 时间的影响
为探究提取时间对南酸枣叶多糖得率的影响，以提取时间为变量，固定其他因素进行试验，见图4。
图4 提取时间对多糖得率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on yield of polysaccharides
如图4所示，时间从2 h增加到4 h，南酸枣叶多糖得率增加显著，之后随时间不再增加。延长提取时间会导致生产周期过长，不利于经济性提升。选择提取时间4 h作为响应面试验优化的中心值。
2.3 响应面优化提取工艺
2.3.1 响应面试验设计与试验结果
选择温度A、液料比B、时间C进行响应面优化试验分析，试验方案与结果见表1。
表1 响应面设计与结果
Table 1 Response surface design and results
序号 因素 Y多糖得率/%A温度/℃B液料比/（mL/g）C时间/h 1 0（85） -1（90∶1） 1（5） 3.87 2 0（85） 1（110∶1） -1（3） 4.43 3 0（85） 0（100∶1） 0（4） 4.34 4 0（85） 0（100∶1） 0（4） 4.40 5 0（85） -1（90∶1） -1（3） 3.44 6 0（85） 0（100∶1） 0（4） 4.37 7 0（85） 1（110∶1） 1（5） 4.21 8 0（85） 0（100∶1） 0（4） 4.35 9 -1（80） 1（110∶1） 0（4） 4.21 10 -1（80） -1（90∶1） 0（4） 3.36 11 1（90） 0（100∶1） 1（5） 4.31 12 1（90） 0（100∶1） -1（3） 4.27 13 -1（80） 0（100∶1） 1（5） 4.12 14 1（95） -1（90∶1） 0（4） 3.92 15 0（85） 0（100∶1） 0（4） 4.38 16 1（90） 1（110∶1） 0（4） 4.06 17 -1（80） 0（100∶1） -1（3） 3.84
把表1中的试验数据进行响应面回归分析，得到南酸枣叶多糖的得率Y对A、B、C的回归方程：Y=+4.37+0.13A+0.29B+0.066C-0.18AB-0.06AC-0.16BC-0.17A2-0.31B2-0.067C2。
2.3.2 回归方程及方差分析
对回归方程分析可知，各因素对南酸枣叶多糖得率的影响次序：液料比>温度>时间。将回归方程进行方差分析，分析结果见表2。
表2 方差分析结果
Table 2 Results of ANOVA analysis
注：*表示差异显著，P＜0.05；** 表示差异极显著，P＜0.01。
方差来源 自由度 平方和 均方和 F值 P值 显著性模型 9 1.68 0.19 55.00 <0.000 1 **A 1 0.13 0.13 39.08 0.000 4 **B 1 0.67 0.67 198.26 <0.000 1 **C 1 0.035 0.035 10.34 0.014 7 *AB 1 0.13 0.13 37.14 0.000 5 **AC 1 0.014 0.014 4.24 0.078 4 BC 1 0.11 0.11 31.13 0.000 8 **A2 1 0.12 0.12 34.40 0.000 6 **B2 1 0.42 0.42 122.33 ＜0.000 1 **C2 1 0.019 0.019 5.49 0.051 7失拟项 3 0.021 0.007 158 12.56 0.016 7 *纯误差 4 0.002 28 0.000 57
由表2分析可知，模型P<0.000 1，上述回归模型极显著，说明南酸枣叶多糖得率的拟合方程可靠性好。在拟合方程一次项A、B、C中，A、B的P值均<0.001，效果极显著，表明温度、液料比对多糖得率的影响作用较大，时间的影响较小，可能是由于提取温度越高水分子越活跃，细胞壁更容易破裂，促使多糖向提取液中溶出[24]。从交互项AB、AC、BC的P值分析可知，AB、BC的P<0.01，且在图5和图7的三维响应面图比图6陡峭，试验表明温度和液料比、液料比和时间的交互作用比时间和温度的交互作用对多糖得率的影响显著。在二次项中，A2和B2的P值<0.001，表明与时间相比，温度和液料比的二次项对多糖得率的影响较大，该模型相关系数R2=0.968，失拟项差异不显著，表明数据可靠，该模型拟合度较高，可以用于热水浸提法提取南酸枣叶多糖的理论预测。
图5 液料比和温度的交互作用对多糖得率的影响
Fig.5 The effect of the interaction of liquid-to-material ratio and temperature on the yield of polysaccharides
图6 时间和温度的交互作用对多糖得率的影响
Fig.6 The effect of the interaction of extraction time and temperature on the yield of polysaccharides
图7 时间和液料比的交互作用对多糖得率的影响
Fig.7 The effect of the interaction of time and liquid-to-material ratio on the yield of polysaccharides
2.3.3 响应面及等高线分析
依据响应面分析试验结果，采用Design Expert8.0.6软件进行回归拟合分析，得到温度、液料比、时间对南酸枣叶多糖得率的影响，响应面和等高线如图5～图7所示。
由图5～图7的响应面图可以看出，温度和料液比与时间和料液比的交互作用接近于椭圆形，表明交互作用显著，对多糖得率影响较大，而时间和温度的交互作用不显著，说明对多糖得率影响较小。在等高线图中，图形呈椭圆状，说明交互作用显著，接近于圆形，说明交互作用弱[25]。在图5～图7的等高线图中，AB和BC的交互作用呈椭圆形，说明其交互作用显著，而AC接近于圆形，说明作用较弱。从上述分析说明，温度和液料比、液料比和时间的交互作用对南酸枣叶多糖得率影响较大，影响较小的是温度和时间的交互作用。
2.3.4 最佳工艺条件的确定及验证试验
根据回归模型方程，预测得到提取南酸枣叶中多糖的最佳工艺为提取温度85.85℃、液料比109∶1（mL/g）、提取时间3.88 h，预测多糖理论得率4.44%。结合具体试验情况，将最优工艺调整为温度86℃、液料比110∶1（mL/g）、时间 3.90 h。在调整后的试验条件下，平行进行5次验证试验，结果显示多糖平均得率4.41%，实际值与理论值4.44%的误差为0.068%，证明了该试验模型结果可靠，适用于南酸枣叶多糖的提取。
2.4 南酸枣叶多糖抗氧化活性
2.4.1 总抗氧化能力
还原能力是评价物质抗氧化能力的一项重要指标，与抗氧化能力直接相关，吸光度越大表示还原能力越强[26]。南酸枣多糖的还原能力见图8。
图8 南酸枣叶多糖的还原能力
Fig.8 Total reducing ability of Choerospondias axillaris leaves polysaccharides
由图8分析知，南酸枣叶多糖的总抗氧化能力随浓度的增大而增强，当浓度为0.50 mg/mL时，南酸枣叶多糖的吸光值相当于VC的77.05%，当浓度达到2.00 mg/mL时，南酸枣叶粗多糖还原能力接近于VC。研究表明还原能力与结构中的还原酮类物质有关，它可以提供质子进而阻断链式反应达到抗氧化目的[27]。南酸枣叶多糖具有较强的抗氧化能力，但稍弱于VC。
2.4.2 DPPH·清除能力
南酸枣叶多糖对DPPH·的清除率见图9。
图9 南酸枣叶多糖对DPPH·的清除率
Fig.9 Scavenging activities of Choerospondias axillaris leaves polysaccharides on DPPH·
由图9可知，南酸枣叶多糖对DPPH·清除能力与浓度呈正相关。当多糖浓度在0.20 mg/mL～2.00 mg/mL，对DPPH·清除率快速增加，之后与VC接近。当浓度为0.50mg/mL时，对DPPH·清除率为49.43%。南酸枣叶多糖对DPPH·清除率的IC50值为0.57mg/mL。研究表明多糖的抗氧化能力与其分子量、单糖组成等有关，低分子量多糖一般有较强的抗氧化能力[28]。推测南酸枣叶多糖可能以低分子量多糖为主。
2.4.3 ·OH清除能力
南酸枣叶多糖对的·OH清除率见图10。
图10 南酸枣叶多糖对的·OH清除率
Fig.10 Scavenging activities of Choerospondias axillaris leaves polysaccharide on·OH
由图10可知，南酸枣叶多糖对·OH的清除能力与浓度呈正相关的量效关系。多糖浓度在0.20 mg/mL～3.00 mg/mL范围内，对·OH清除能力随浓度增大快速增加，之后呈平缓趋势增加，逐渐趋于稳定。当浓度为0.50 mg/mL时，对·OH清除率为55.92%。南酸枣叶多糖对·OH清除率的IC50值为0.39 mg/mL。表明南酸枣叶多糖具有一定·OH清除能力。
3 结论
试验通过热水浸提法提取南酸枣叶多糖，用响应面设计法对提取工艺进行优化，并对南酸枣叶多糖的抗氧化活性进行了研究。可得出如下结论：1）热水浸提法提取南酸枣叶多糖的最优工艺条件：提取温度86 ℃；液料比 110∶1（mL/g）；提取时间 3.90 h。在该工艺条件下，南酸枣叶多糖得率为4.41%。2）南酸枣叶粗多糖有一定的还原能力，对DPPH·和·OH的清除的IC50值分别是0.57 mg/mL和0.39 mg/mL，其结果弱于VC，期望为天然抗氧剂的开发提供数据依据。
南酸枣叶可以作为植物多糖的来源之一。试验仅采用热水浸提法提取多糖，且未对多糖组成进行分析。后续试验可考察其他提取方法对多糖得率和活性的影响，并采用大孔吸附树脂、葡聚糖对南酸枣叶粗多糖进行分离纯化，以期探究南酸枣叶多糖各组分与其抗氧化能力的协同效应。
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