桑黄（Phellinus igniarius）是一类大型的珍稀药用真菌，属于锈革孔菌科木层孔菌属，主要寄生于阔叶树树种，常分布于中国、韩国和日本[1]，据《中药大辞典》记载“桑黄可用于痢疾、闭经、泻血、血崩、淋病等疾病的治疗”，具有悠久的中医应用历史[2]，享有“森林黄金”美称，功能多样。桑黄富含生物活性成分，如糖类、萜类、黄酮类、氨基酸等，目前研究表明桑黄具有抗肿瘤[3]、降低血糖浓度、预防糖尿病[4]、提高免疫力[5]等作用，其中桑黄多糖和总三萜成分具有良好的抗氧化[6]、抗菌[7]、抗癌等作用[8-10]，具有较好的药用价值和开发前景。
可食用酵素是以新鲜果蔬、谷物、中草药等为原料，在多种有益菌的自然条件下发酵产出的含有丰富的有机酸、维生素、萜类物等功能成分的混合发酵液，可催化新陈代谢、养分和能量转化等作用，但不会使其物质及生化反应造成改变，酵素具有解酒护肝、提高免疫力、抗氧化等功能[11]。
酵素起源于日本，在日本发展已经相当成熟，在欧洲、加拿大等地也开始盛行，而在中国仍处于低潮期[12]。目前关于桑黄液态产品的开发主是中药发酵与药酒生产，而通过添加酵素制备桑黄口服液是一种较新的思路。基于此，本试验以桑黄为原材料，采用诺丽果酵素和木瓜酵素发酵，研究桑黄功效成分的最佳提取条件，测定不同提取条件下桑黄提取液核酸、总三萜、多糖等含量，研究其水提和醇提物的抗氧化和抑菌活性，使桑黄有效成分得到更好的开发利用，有望成为促进人类健康的新型功能性食品。
1 材料与方法
1.1 材料
桑黄、诺丽果酵素、木瓜酵素：成都益康堂公司；黄酒：浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌：四川师范大学生命科学学院实验室。
1.2 试剂与仪器
乙酸乙酯、乙醇、高氯酸、铁氰化钾、三氯化铁、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸钠、香草醛、冰醋酸、无水葡萄糖（均为分析纯）：成都市科隆化工试剂厂；硫酸（分析纯）：四川西陇化工有限公司；三氯乙酸（分析纯）、白桦酯醇标准品（HPLC≥98%）、芦丁标准品（HPLC≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-nitro-henylhydrazine，DPPH）（纯度 99%）：成都硕博研创公司；牛肉膏蛋白胨（LB）培养基：杭州微生物试剂有限公司。
FD-1A-50型冷冻干燥机：江苏天翎仪器有限公司；DHP-9082型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司生产；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂制造；HKC-40A型超声波仪：昆山市超声仪器有限公司；BioMate 3S型紫外分光光度计：Thermo公司；JA5003型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑黄提取液的制备
参考文献[13]，进行桑黄功效成分的提取。称取6份过100目筛的桑黄粉末500 g，分为两组，料液比1∶6（g/mL）。一组样品进行水提，一组样品进行醇提（黄酒）。水提直接使用煎煮法进行桑黄成分的提取。醇提使用黄酒进行提取。
水提、乙醇提组内合并滤液各得1000mL，不同提取方式的桑黄滤液各取6个100 mL样品，3个样品中分别加入木瓜酵素30 mL、3个样品中分别加入诺丽果酵素30mL（按照3kg桑黄，加入180 mL酵素计算），得4种配方桑黄提取液（计算提取液得率）[13]。
以抽真空的方式使样品中水分直接升华，进而浓缩桑黄提取液，分别于冷冻干燥机进行冻干，称量记录（计算冻干粉得率）。计算提取液和冻干粉的得率公式如下。
1.3.2 桑黄提取液多糖含量的测定
桑黄提取液的多糖含量是其总糖含量与还原糖含量的差值，按下列方法测定总糖、还原糖的含量。
用硫酸-苯酚法[14-15]测定总糖的含量：准确称取烘干后无水葡萄糖50 mg置于500 mL容量瓶，蒸馏水溶解、定容，摇匀。加蒸馏水配制成浓度梯度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的标准溶液。分别取不同浓度的标准溶液1 mL，各加5%的苯酚1 mL，并迅速加入5 mL浓H2SO4，25℃静置10 min后摇匀，再放置30 min，于490 nm处测定OD值，作总糖标准曲线，曲线回归方程为y=10.364x+0.089 4，R2=0.997 2，线性关系良好，可用于测定总糖含量，结果见图1。
图1 测定桑黄总糖、还原糖标准曲线
Fig.1 Determination of the standard curve of P.igniarius total sugar and reducing sugar
用3，5-二硝基水杨酸法[16]测定还原糖的含量：准确称取烘干后无水葡萄糖1 g于1 000 mL容量瓶，定容后摇匀。分别取1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于6支试管中，补蒸馏水至0.5 mL，分别加1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）试剂，5 min沸水浴后立即用冷水冷却，加蒸馏水至6 mL，混匀，在540 nm处测吸光度值，作还原糖标准曲线，回归方程为 y=3.866 5x+0.004 4，R2=0.990 8，线性关系良好，可用于测定还原糖含量，结果见图1。
1.3.3 桑黄提取液总三萜含量的测定
参考文献方法[17]，测定桑黄提取液总三萜的含量：精密称取白桦酯醇标准品0.02 g，95%乙醇溶解，定容至100 mL，摇匀即得浓度0.2 mg/mL的标准储备液。精密量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 的标准储备液，分别置于编号为0～6的10 mL离心管中，70℃水浴蒸干。加0.20 mL新配制的5%香草醛冰醋酸溶液，再加入高氯酸0.80 mL，摇匀，70℃恒温水浴20 min，立即冷水冷却，用乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀，在551 nm处测定OD值。以0号管为对照，绘制总三萜标准曲线，曲线回归方程为y=11.726x+0.015 5，R2=0.995，线性关系良好，可以用于测定口服液的总三萜含量。结果见图2。
图2 测定总三萜含量的标准曲线
Fig.2 Standard curve of total triterpenes
1.3.4 桑黄提取液核酸含量的测定
参考文献[18]，用朗伯-比尔光吸收定律测定桑黄提取液的核酸的含量：核酸嘌呤和嘧啶间的共轭双键，在260 nm处具有最大的吸收峰，测定产品中的核酸含量。
1.3.5 桑黄冻干粉DPPH自由基清除率测定
参考文献[19]，测定清除DPPH自由基的能力。分别精密吸取水提、醇提的桑黄提取液各0.1 mL，加95%乙醇至3 mL，混匀后加3 mL DPPH自由基溶液，摇匀，25℃避光放置30 min，在517 nm处测定OD值（Ai）。分别精密吸取水提、醇提的桑黄提取液各0.1mL，加95%乙醇至6 mL，摇匀，于室温（25℃）避光放置30 min，在波长517 nm处测定OD值（Aj）。精密吸取3 mL 95%乙醇溶液和3 mL DPPH溶液置于试管，25℃避光放置30 min，在517 nm处测定OD（Ae）值。每组试验3个平行，DPPH自由基清除率（I）的计算公式如下。
根据不同提取物的浓度与清除率间关系，计算出IC50值，比较该值的大小。IC50值越低，抗氧化剂的DPPH自由基清除能力越强，抗氧化性就越好。
1.3.6 桑黄冻干粉Fe3+还原活性测定
参考文献[20-21]，测定还原能力，精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 的 0.2 mg/mL 芦丁标准品溶液，分别加入95%乙醇至1mL，再依次加入2.5 mL磷酸缓冲液、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后封口，置50℃水浴20 min；然后快速冷却，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀，4 000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后静置10 min，于700 nm测定OD值。作还原能力标准曲线，曲线回归方程为y=0.810 1x+0.221 5，R2=0.998 6，线性关系良好，可用于测定桑黄产品的还原能力，结果见图3。
图3 测定还原能力的标准曲线
Fig.3 Standard curve for determination of reduction capacity
再根据不同提取物的浓度与还原能力关系，计算出IC50值，比较该值的大小。IC50值越低，抗氧化剂的还原能力越强。
1.3.7 桑黄冻干粉抑菌作用的测定
菌种的活化及菌悬液的制备，参考张倩等[22]、魏思敏等[23]的方法稍加改进。分别取100 μL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌低温保存菌株接种至LB液体培养基，于35℃、120 r/min条件下振荡培养48 h进行活化。再分别取活化的菌液5 mL于离心管，4℃、12 000 r/min条件下离心2 min得到菌体沉淀。然后加无菌生理盐水悬浮，最后稀释得到107CFU/mL～108CFU/mL的菌悬液，振荡均匀备用。
参考最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定方法[24-25]：将 pH7 的 LB 液体培养基分装24支试管，每管各3 mL，高压蒸气121℃灭菌20 min。以二倍稀释法进行无菌操作，每3根试管为一组，分别加入20 mg/mL的桑黄冻干粉样品液3 mL，摇匀，平行吸取3 mL于下一组试管，依次类推，至第6组试管弃去3 mL液体，每组2根试管中加入0.2 mL菌液，1根试管加0.2 mL液体（水提组加无菌水，醇提组加95%乙醇）作为组内空白。第7组试管加0.2 mL液体（水提组加无菌水，醇提组加95%乙醇）作为试验空白组，第8组加入0.2 mL菌液作为阴性对照。将试管充分摇匀，置于35℃培养24 h，观察浊度并于600 nm处测定OD值。
1.4 试验设计与统计分析
用SPSS 25.0软件先进行正态性检验，符合正态性的进行方差分析，图用Origin 9、Excel绘制。
2 结果与分析
2.1 制备工艺对桑黄提取液得率和冻干粉得率的影响
比较4种制备方法桑黄口服液得率、冻干粉得率的不同影响，试验数据经Shapiro-Wilk正态性检验，得到各组的P＞0.05，符合正态性，可选择单因素方差法进行统计分析，组间差异性的比较用法，结果见表1。
表1 桑黄提取液得率的比较（n=3）
Table 1Yield of P.igniarius extract（n=3）
注：组间有不同的大写字母，表示P≤0.01，差异极显著。
项目 提取液得率/% 冻干粉得率/%醇提后加诺丽果酵素 1 6.6 7±0.0 5 2.0 7±0.0 0 A水提后加木瓜酵素 1 6.6 7±0.0 4 1.4 9±0.0 0 B醇提后加木瓜酵素 1 6.6 7±0.0 3 0.9 4±0.0 0 C水提后加诺丽果酵素 1 6.6 7±0.0 3 0.2 1±0.0 0 D
如表1所示，4种不同提取方式对桑黄提取液得率无显著性影响（P＞0.05）。提取液冻干后，各组间冻干粉的得率有极显著性差异性（P≤0.01），其中，“醇提桑黄+木瓜酵素”冻干粉得率最高为（2.07±0.002）%，“桑黄+诺丽果酵素”水提液的得率最低为（0.21±0.002）%。
2.2 制备工艺对桑黄提取液液多糖含量的影响
测定4种不同提取工艺制备的样品溶液OD490 nm值，根据建立的回归方程得到各样品的多糖含量。各组经Shapiro-Wilk正态性检验，均有P＞0.05，符合正态性，因此可选择单因素方差分析，比较各组间多糖含量差异的显著性用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法，结果见表2。
表2 桑黄提取液的多糖含量（n=3）
Table 2 Extract of polysaccharide from P.igniarius（n=3）
注：组间不同大写字母，表示P≤0.01，差异极显著。
项目多糖含量/（mg/mL）水提后加木瓜酵素 6.04±0.35A醇提后加木瓜酵素 5.86±0.29A醇提后加诺丽果酵素 0.89±0.35B水提后加诺丽果酵素 0.54±0.48B
如表2所示，与桑黄水提或醇提后加入诺丽果酵素比较，桑黄水提或醇提后加入木瓜酵素，提取液多糖含量的差异性极显著（P=0.001≤0.01），桑黄水提或醇提后加入同种酵素，提取液多糖含量的差异性不显著（P＞0.05）。即不同提取工艺，桑黄水提、乙醇的提取液中，加入木瓜酵素后的多糖含量差异性不显著（P=0.883＞0.05），加入诺丽果酵素后的多糖含量差异性也不显著（P=0.076＞0.05）。4种不同提取工艺中，提取液多糖含量最高的为“桑黄水提后加入木瓜酵素”，为（6.04±0.35）mg/mL，最低为“桑黄水提后加入诺丽果酵素”的（0.54±0.48）mg/mL。
2.3 生产工艺对提取液总三萜含量的影响
测定4种不同提取工艺制备的样品溶液OD551 nm值，根据建立的回归方程得到各样品的总三萜含量。各组经Shapiro-Wilk正态性检验，均有P＞0.05，因此符合正态性，可选择“单因素方差分析”分析4种提取方式桑黄提取液的总三萜含量有无显著差异，结果见表3。
表3 桑黄提取物总三萜的含量（n=3）
Table 3 Extract of total triterpenoid from P.igniarius（n=3）
注：组间不同大写字母，表示P≤0.01，差异极显著。
项目总三萜含量/（m g/m L）醇提后加木瓜酵素 1.7 7±0.0 6 A醇提后加诺丽果酵素 1.4 5±0.0 4 B水提后加木瓜酵素 0.7 8±0.0 5 C水提后加诺丽果酵素 0.7 3±0.0 1 C
如表3所示，除“水提后加入木瓜酵素”和“水提加入诺丽果酵素”组间差异性不显著（P=0.244＞0.05）外，其他组间的差异性均为极显著（P=0.000≤0.01）。其中，“醇提后加入木瓜酵素”的桑黄提取液的总三萜含量最高[（1.77±0.061）mg/mL]，“水提后加入诺丽果酵素”的提取液，总三萜含量最低[（0.73±0.013）mg/mL]。
2.4 制备工艺对桑黄提取液液核酸含量的影响
分析4种提取方式桑黄提取液核酸含量有无显著差异，各组经Shapiro-Wilk正态性检验，均有P＞0.05，因此符合正态性，可选择单因素方差分析，组间比较用LSD法，结果见表4。
表4 桑黄提取液的核酸含量（n=3）
Table 4 Extract of nucleic acid from P.igniarius（n=3）
注：不同组间小写字母，表示P≤0.05，差异显著。
项目核酸含量/（μ g/m L）水提后加木瓜酵素 2 1 0.7 0±7.2 3 a水提后加诺丽果酵素 2 0 8.8 0±8.8 4 ab醇提后加木瓜酵素 2 0 0.0 0±2.3 5 b醇提后加诺丽果酵素 1 9 5.8 1±2.2 0 b
如表4所示，“醇提后加入诺丽果酵素”组与“水提后加入木瓜酵素”存在显著性差异（P=0.015≤0.05），“醇提后加入诺丽果酵素”组与“水提后加入诺丽果酵素”存在显著性差异（P=0.029≤0.05），而“醇提后加入诺丽果酵素或木瓜酵素”组间不存在差异（P=0.422＞0.05）。其中“水提后加入木瓜酵素”桑黄提取液的核酸含量最高，为（210.70±7.23）μg/mL，“醇提后加入诺丽果酵素”组桑黄提取液的核酸含量最低，为（195.81±2.20）μg/mL。
2.5 桑黄冻干粉DPPH自由基清除率的影响
DPPH自由基是一种以氮为中心的活泼自由基，在抗氧化剂存在时能迅速地与之配对并被其清除，是实验室鉴定抗氧化能力常用的研究方法之一[26]。用其测定水提、醇提的桑黄提取液冻干粉的抗氧化活性，结果见图4。
图4 桑黄冻干粉清除DPPH自由基的活性
Fig.4 Activity of DPPH free radical eliminating of P.igniarius lyophilized powder
如图4所示，随着样品浓度的升高，桑黄提取液冻干粉的清除能力增强，浓度与清除能力均呈现正相关。在相同的浓度（12.50 mg/mL）下，DPPH自由基的清除率有差异，醇提的为62.10%、水提的为9.79%，因此，桑黄提取液DPPH自由基清除能力，醇提明显高于水提，桑黄用醇提表现出更良好的抗氧化活性。
2.6 桑黄对Fe3+还原活性的影响
桑黄提取液Fe3+还原活性，表明桑黄提取液的总还原能力，可用来表明样品的抗氧化能力[27]。因此是实验室测定抗氧化能力常用的研究方法之一，用其测定水提、醇提的桑黄提取液冻干粉的抗氧化活性，结果见图5。
图5 桑黄冻干粉Fe3+还原活性
Fig.5 Activity of Fe3+reducing capacity of P.igniarius lyophilized powder
如图5所示，随着样品浓度的升高，水提和醇提两种提取方式的桑黄提取液，还原能力都增加，浓度与还原力均呈现正相关。在相同浓度（125.0mg/mL），Fe3+还原活性，醇提为55.61%，水提为24.46%，醇提明显高于水提，说明桑黄醇提取液清除Fe3+还原活性明显高于水提，因此，桑黄醇提比水提表现出更良好的抗氧化活性。
2.7 桑黄冻干粉对抑菌活性的影响
经比浊法测定抑菌作用的方法得，水提和醇提桑黄提取液冻干粉分别测定对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用，结果见图6。
图6 不同桑黄冻干粉对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌率变化
Fig.6 Inhabition rate of E.coli and S.aureus of P.igniarius lyophilized powder
如图6所示，桑黄提取液的浓度-抑菌能力呈现正相关。研究表明，桑黄水提物浓度（2.5 mg/mL）对金黄色葡萄球菌的抑制率为30%，对大肠杆菌的抑制率为31%。而桑黄醇提物浓度（2.5 mg/mL）对大肠杆菌的抑制率为100%，对金黄色葡萄球菌的抑制率为54%。证实在不同提取方式相同浓度下，醇提对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出较良好的抑菌活性并且抑菌活性醇提强于水提。
3 结论
桑黄的药用功效成分最早记载于《本草纲木》，具有化饮、止血、止泻、活血等功效[28]，其良好的药效作用被大量报道，但是，缺少工艺条件对功效成分、功能的影响研究。氧化损伤是引起衰老、细胞癌变的原因之一，天然低毒的抗氧化抑菌产品，具有潜在的开发价值。本试验研究桑黄提取液的提取工艺，对功效成分、抗氧化和抑菌活性的影响，优化桑黄提取液的提取工艺，以便在产品开发中发挥更有效的作用。
研究结果表明，桑黄提取液的4种制备方式对提取液的得率无显著性影响，但是，冻干粉的得率中，“醇提后加入木瓜酵素”组最高（2.07%），“水提后加入诺丽果酵素”组最低（0.21%），组间具有极显著性差异。桑黄提取液4种制备方式中，水提后加入木瓜酵素的桑黄多糖（6.04 mg/mL）和核酸（210.70 mg/mL）含量最高，“水提后加入诺丽果酵素”多糖含量最低（0.54 mg/mL），“醇提后加入诺丽果酵素”核酸含量最低（195.81 mg/mL）。“醇提后加入木瓜酵素”的总三萜含量最高（1.77 mg/mL），“水提后加入诺丽果酵素”总三萜含量最低（0.73 mg/mL）。
研究结果表明，桑黄提取液的抗氧化和抑菌功能与工艺有关。用DPPH法和Fe3+还原活性法比较桑黄水提和醇提的抗氧化活性，结果表明，醇提DPPH自由基清除能力IC50=9.90 mg/mL，Fe3+还原活性IC50=10.58 mg/mL，因此醇提桑黄提取物抗氧化活性显著高于水提。用比浊法比较桑黄醇提和水提的抑菌活性，结果表明，桑黄对革兰氏阴性菌和阳性菌均具有抑菌效果，醇提桑黄提取物抑菌活性显著高于水提，且醇提提取物对革兰氏阴性（大肠杆菌）抗菌活性更显著。
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